天山花楸平喘膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李改茹， 劉玉花， 常軍民*， 程煜鳳， 何家偉

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830054）

天山花楸平喘膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李改茹1， 劉玉花2， 常軍民1*， 程煜鳳1， 何家偉2

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830054）

目的 建立天山花楸平喘膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 方法 用薄層色譜法 （TLC） 對膠囊內(nèi)容物中金絲桃苷、 苦杏仁苷進(jìn)行定性鑒別； 采用高效液相色譜法測定金絲桃苷、 槲皮素和山柰素的量。 結(jié)果 TLC鑒別專屬性強(qiáng)， 斑點(diǎn)清晰、 分離度好， 陰性對照無干擾； 金絲桃苷、 槲皮素和山柰素進(jìn)樣量分別在 3.72 ～74.4 μg（r=0.999 9）、 8.00 ～64.00 μg（r=0.999 3）、 2.00 ～16.00 μg（r=0.999 3） 范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系， 平均回收率分別為101.2%、 97.3%和 93.7%， RSD分別為 1.4% （n=9）、 2.6%和 1.9% （n=6）。 結(jié)論 所建標(biāo)準(zhǔn)可用于天山花楸平喘膠囊的質(zhì)量控制。

天山花楸； 平喘膠囊； 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； TLC； HPLC

天山花楸 Sorbus tianshanica Ruper.為新疆民間特有天然植物藥，維吾爾和哈薩克族常以其嫩枝、葉和果實(shí)入藥，具有清肺止咳，補(bǔ)脾生津，補(bǔ)血補(bǔ)氣的功效［1-3］。根 據(jù)天然 藥物 5 類新藥 的申報要求，在前期對天山花楸藥用部位的提取分離工藝研究和天山花楸平喘膠囊的成型工藝的研究基礎(chǔ)上，為保證該新藥制劑的安全性和臨床有效性，對其進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的臨床前研究［4-9］。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀 （ 日本 島津， LC-20AB泵，SPD-20A紫 外 檢 測 器）， 色 譜 柱 （ shim-pack Vp-ODS 柱，150 mm×4.6 mm， 5 μm）， Lcsolution 工作站， CAMAG LIONMAT 5 薄層色譜半自動點(diǎn)樣儀（瑞士卡瑪公司）， CAMAG REPROSTAR 3 薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng) （瑞士卡瑪公司），DHO-9075A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 （上海恒科儀器有限公司）， AB-135-S 型 電 子 分 析 天 平 （ 托 利 多-梅 特 勒 有 限 公司）， SHH-500SD藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱 （重慶永生實(shí)驗(yàn)儀器廠），KQ-500DZ超聲清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司， 500 W， 40 kHz）， 聚酰胺薄膜薄層板 （浙江臺州市路橋四甲塑料廠）， GF254薄層板 （Merck 公司）。

金絲桃苷對照品 （中國固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心， 批號 J20-110411 ）） ； 苦杏仁苷對照品 （中國藥品生物制品檢定所， 批號 110820-200403）； 槲皮素對照品 （中國食品藥品檢定研究院， 批號 100081-200406）； 山柰素對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號 110861-200808）；天山花 楸 平 喘 膠 囊 （ 批 號 20121029、 20121030、20121031） 及陰性樣品由新疆醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室提供； 甲醇 （ Burdick&Jackson 色譜純）， 乙腈 （Burdick&Jackson 色譜純）， 超純水， 其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 金絲桃苷的薄層鑒別 分別稱取 3 批天山花楸平喘膠囊內(nèi)容物各 40 mg， 加甲醇 4 mL經(jīng)超聲溶解后過濾，將濾液作為供試品溶液；稱取金絲桃苷對照品2mg， 加甲醇制成每1mL含1mg的對照品溶液；取天山花楸平喘膠囊陰性處方樣品，將內(nèi)容物按供試品溶液的制備方法，制成陰性樣品溶液。 吸取上述溶液各 2 μL， 分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜薄層板上，分別以乙酸乙酯-甲酸-水 （8 ∶1 ∶1） 和乙酸乙酯-甲醇-甲酸 （10 ∶5 ∶3） 為展開劑，展開， 取出， 晾干， 噴以 5%AlCl3乙醇溶液， 晾干， 電吹風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰， 紫外光燈 （366 nm） 下檢視。 結(jié)果， 在 2 種展開條件的供試品色譜中，均在與對照品色譜相應(yīng)位置處顯相同顏色的斑點(diǎn)， 陰性對照無干擾。 見圖1。

圖1 金絲桃苷的 TLC圖Fig.1 TLC diagram of hyPerin

2.1.2 苦杏仁苷的薄層鑒別 分別稱取 3 批天山花楸平喘膠囊內(nèi)容物各 160 mg， 加甲醇 8 mL行超聲溶解后過濾，將濾液蒸干， 加入2 mL甲醇作為供試品溶液； 稱取苦杏仁苷對照品 3 mg， 加甲醇制成每1 mL含3 mg的對照品溶液； 取天山花楸平喘膠囊陰性處方樣品，將內(nèi)容物按供試品溶液的制備方法，制成陰性樣品溶液。吸取陽性、陰性對照品溶液各 3 μL， 供試品溶液各 2 μL， 分別點(diǎn)于同一 GF254薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15 ∶40 ∶22 ∶10）在 5 ～10 ℃放置 12 h 的下層為展開劑， 展開， 取出， 立即噴以 0.8%磷鉬酸的15%硫酸乙醇溶液 （臨用現(xiàn)配）， 105 ℃加熱 3 ～4 min 顯色， 白光下檢視； 吸取陽性、 陰性對照品溶液各 3 μL，供試品溶液各 2 μL， 分別點(diǎn)于同一GF254薄 層 板 上， 以 三 氯 甲 烷-乙 酸 乙 酯-甲 醇-水（3 ∶8 ∶5 ∶2） 在 5 ～10 ℃放置 12 h 的下層為展開劑， 展開， 取出， 晾干， 噴以磷鉬酸顯色劑 （2 g磷鉬酸溶于 20 mL水中， 再緩緩加入 30 mL硫酸，臨用現(xiàn)配）， 105 ℃加熱 3 ～4 min 顯色， 白光下檢視。結(jié)果，在2種展開條件的供試品色譜中，均在與對照品色譜相應(yīng)位置處顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。見圖2。

圖2 苦杏仁苷的 TLC圖Fig.2 TLC diagram of am ygdaline

2.2 金絲桃苷的測定

2.2.1 色 譜條件與系統(tǒng)適用性試 驗(yàn) shim-pack Vp-ODS 色譜柱 （150 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相為乙腈-0.1% 磷酸 （26 ∶84）； 檢測波長 360 nm， 體積流量 1 m L/min； 柱溫 30 ℃； 進(jìn)樣量 10 μL。 在此色譜條件下， 供試品中金絲桃苷色譜峰與其他組分色譜峰能夠達(dá)到基線分離，與對照品色譜峰保留時間一致；理論塔板數(shù)按金絲桃苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。 結(jié)果見圖 3。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取金絲桃苷對照品適量， 置25 mL量瓶中， 加甲醇制成每 1 m L含 0.186 mg的溶液， 即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取本品內(nèi)容物100 mg， 置具塞錐形瓶中， 加40 mL甲醇，超聲處理 30 min 后過濾， 置 50 mL量瓶中， 放冷， 加甲醇定容至刻度， 進(jìn)樣前 過 0.2 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.4 陰性對照品溶液的制備 取陰性樣品， 按“2.2.3” 項(xiàng)下方法配制陰性對照溶液。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密量取金絲桃苷對照品溶液 0.2、 0.5、 1、 2、 3、4 mL分別置 10mL量瓶中， 用甲醇定容至刻度， 搖勻， 分別進(jìn)樣 10 μL。以峰面積積分值對質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得方程Y=21 760X+2 669.5 （r=0.999 9）。 結(jié)果表明，金絲桃苷在 3.72 ～74.4 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密量取金絲桃苷對照品溶液適量，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。 結(jié)果， RSD為 1.32% （n=6）， 表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取批號為 20121029 的膠囊內(nèi)容物適量， 按照 “2.2.3” 項(xiàng)制備， 上述色譜條件， 分別于 0、 2、 4、 6、 8、 10、 12 h 測定金絲桃苷。 結(jié)果， RSD為 3.55% （n=6）， 表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取批號為 20121029 的膠囊內(nèi)容物適量， 按 “2.2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，照上述色譜條件測定。結(jié)果，金絲桃苷的平均含有量為 9.09 mg/g， RSD為 1.77%（n=6）， 表明方法重復(fù)性良好。

圖3 金絲桃苷 HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram s of hyPerin

2.2.9 加 樣 回 收 率 試 驗(yàn) 精 密 稱 取 批 號 為20121029 的膠囊內(nèi)容物 （含有量為 9.09 mg/g） 適量，加入高、中、低劑量的金絲桃苷對照品溶液，各平行 3 份，按照 “2.2.3”項(xiàng)下方法操作， 在此色譜條件下，用外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果，見表1。

表 1 金絲桃苷的加樣回收率考察 （n=9）Tab.1 Results of recovery tests for hyPerin（n=9）

2.2.10 樣 品 測 定 分 別 取 批 號 為 20121029、20121030、 20121031 的 3 批天山花楸平喘膠囊內(nèi)容物， 按上述 “2.2.3” 項(xiàng)操作制備供試品溶液，平行3份，在該色譜條件下進(jìn)行測定。結(jié)果，見表2。

表 2 樣品測定 （n=3）Tab.2 Results of conten t determ ination of sam Ples（ n= 3）

2.3 黃酮苷的測定

2.3.1 色 譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) shim-pack Vp-ODS 色譜柱 （150 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相為甲醇-0.1% 磷酸 （52 ∶48）； 檢測波 長 360 nm； 體積流量 1 m L/min； 柱溫 30 ℃； 進(jìn)樣量 10 μL。 在此色譜條件下， 供試品中槲皮素、 山柰素的色譜峰與其他組分色譜峰能夠達(dá)到基線分離，與對照品色譜峰保留時間一致；理論塔板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于 4 000。 結(jié)果見圖4。

圖4 槲皮素、 山柰素 HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram s of quercetin and kaem Pferol

2.3.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取槲皮素、山柰素適量，加甲醇使成每1 mL含槲皮素為160 μg、山柰素為40 μg的混合對照品溶液， 即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取本品 80 mg，置圓底燒瓶中， 加甲醇30 mL， 25%鹽酸5 mL， 85℃水浴回流 60 min， 冷卻， 轉(zhuǎn)移至 50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性對照品溶液的制備 取陰性樣品，按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.3.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對照品貯備液0.5、 1、 2、 3、 4 m L置 10 m L量瓶中， 用甲醇稀釋定容。在上述色譜條件下，以槲皮素、山柰素的對照品色譜峰面積 （A） 對進(jìn)樣質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。槲皮素、山柰素的回歸方程、 相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表3。

表3 槲皮素、 山柰素的回歸方程、 相關(guān)系數(shù)、線性范圍Tab.3 Regression equations， correlation coefficient and linearity ranges of the quercetin， kaem Pferol

2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密量取混合對照品溶液（槲皮素 32 μg/mL，山柰素 8 μg/mL），按上述色譜條件測定，記錄峰面積值。結(jié)果，槲皮素、山柰素的 RSD分別為 1.51%、 1.05% （n=6）， 表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照 “2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于 0、 2、4、 6、 8、 10 h 進(jìn)樣，按上述色譜條件測定，記錄峰面積值。結(jié)果，槲皮素、 山柰素 的 RSD分 別為 2.10%、 2.31%（n=6）， 表明供試品溶液在 10 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按照 “2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，記錄峰面積值。結(jié)果，槲皮素、山柰素的平均含有量為30.63、 7.93 mg/g， RSD分別為 2.03%、 1.86%（n=6）， 表明方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取樣品 25 mg，平行 6 份， 分別置 100 mL圓底燒瓶中， 分別加入質(zhì)量濃度為 0.644 mg/mL槲皮素、 0.535 mg/mL山柰素各1 m L， 按照 “2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，記錄峰面積值，用外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果，槲皮素、山柰素的平均回 收 率 分 別 為 97.3%、93.7%，RSD 分 別 為2.61%、1.88% （n=6）。

表 4 槲皮素的回收率試驗(yàn) （n=6）Tab.4 Results of recovery tests for quercetin （ n=6）

表 5 山柰素回收率試驗(yàn) （n=6）Tab.5 Resu lts of recovery tests for kaemPferol（n=6）

2.3.10 樣 品 測 定 分 別 取 批 號 為 20121029、20121030、 20121031 的 3 批天山花楸平喘膠囊內(nèi)容物， 按上述 “2.3.3” 項(xiàng)操作制備樣品溶液， 平行 3份，按上述色譜條件測定，記錄峰面積值，計(jì)算天山花楸平喘膠囊內(nèi)容物中黃酮苷的量 （天山花楸黃酮苷的量 =槲皮素量 ×2.02+山柰素量 ×1.87）。 結(jié)果見表 6， 天山花楸中試提取物測定結(jié)果見表7。

表6 樣品測定結(jié)果 （n=3）Tab.6 Results of content determ ination of samPles（ n= 3）

表7 天山花楸中試提取物測定結(jié)果Tab.7 Results of content determ ination of extract

3 討論

根據(jù) 《中國藥典》 2010 年版中有關(guān) TLC鑒別的要求， 經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)及有關(guān)文獻(xiàn)的查閱［10］， 分別對不同的薄層板、不同的展開劑、點(diǎn)樣量等展開條件進(jìn)行了考察，確定了兩種不同的展開條件來定性鑒別天山花楸平喘膠囊中有效成分金絲桃苷和苦杏仁苷。結(jié)果，該方法具有較好的重復(fù)性和專屬性，可快速有效地對膠囊的安全性和有效性進(jìn)行質(zhì)量控制。

天山花楸藥材中含有的金絲桃苷和苦杏仁苷兩種有效成分具有明確的止咳平喘的藥理作用。金絲桃苷成分穩(wěn)定，用等度洗脫方法干擾少，分離度、重現(xiàn)性好， 操作簡便， 可快速用 RP-HPLC對其進(jìn)行分離檢測；但苦杏仁苷成分不穩(wěn)定，對溫度敏感，易水解，所以天山花楸藥材經(jīng)提取分離后，含苦杏仁苷量較低， 嘗試采用 RP-HPLC分析方法，用不同的梯度洗脫方法來同時對金絲桃苷和苦杏仁苷兩種有效 成 分 進(jìn)行 測 定［10-13］，苦 杏 仁 苷的 分 離度都達(dá)不到要求， 而采用液-質(zhì)連用的分析方法達(dá)不到快速、操作簡單易行的特點(diǎn)，適用范圍窄，所以本研究只對苦杏仁苷進(jìn)行了定性鑒別。

天山花楸藥材中含有多種黃酮類化合物，不能進(jìn)行一一控制， 據(jù)文獻(xiàn)報道， 采用 RP-HPLC法對兩種主要的水解苷元槲皮素和山柰素進(jìn)行分離檢測，用外標(biāo)法來計(jì)算各苷元的量，再利用相對分子質(zhì)量為610 的蘆丁對槲皮素的轉(zhuǎn)換因子 2.02 和相對分子質(zhì)量為 534 的山柰素糖苷 （山柰素-葡萄糖苷-丙二酸酯） 對山柰素的轉(zhuǎn)換因子 1.87 的轉(zhuǎn)換關(guān)系來計(jì)算 天山 花 楸 黃酮 苷 的 量［14-16］。 本 法采 用 等度洗脫，重復(fù)性好，操作簡便，可快速、準(zhǔn)確地測定成分含有量，能在一定程度上對天山花楸平喘膠囊進(jìn)行質(zhì)量控制。

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Quality control for Tianshan Huaqiu Asthm a CaPsules

LIGai-ru1， LIU Yu-hua2， CHANG Jun-min1*， CHENG Yu-feng1， HE Jia-wei2
（1.College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China； 2.First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China）

Sorbus tianschanica Ruper.； asthma capsule； quality criteria；TLC；HPLC

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）01-0106-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.026

2013-04-18

新疆維吾爾自治區(qū)科技支撐計(jì)劃 （201133127）

李改茹 （1975—） ， 女， 副教授， 研究方向： 天然藥物分析。 E-mail： 164232309@qq.com

*通信作者： 常軍民 （1965—） ， 男， 教授， 博士， 碩士生導(dǎo)師， 研究方向： 天然藥物分析。 E-mail： 1617265908@qq.com