HPLC-MS聯(lián)用同時(shí)檢測支氣管類中成藥中違禁添加的 11 種糖皮質(zhì)激素

陳 鳳， 陳 宇， 董培健

（1.廣西玉林食品藥品檢驗(yàn)所， 廣西 玉林 537000； 2.廣西桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)本科 2009 級， 廣西 桂林541000）

HPLC-MS聯(lián)用同時(shí)檢測支氣管類中成藥中違禁添加的 11 種糖皮質(zhì)激素

陳 鳳1， 陳 宇1， 董培健2

（1.廣西玉林食品藥品檢驗(yàn)所， 廣西 玉林 537000； 2.廣西桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)本科 2009 級， 廣西 桂林541000）

目的 建立一個(gè)高準(zhǔn)確性、 高靈敏度的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法， 檢測支氣管哮喘類中成藥中違禁添加的 11 種糖皮質(zhì)激素 （倍他米松， 丙酸倍氯米松， 氯氟舒松， 醋酸潑尼松龍，氫化可的松， 醋酸氟輕松， 醋酸潑尼松， 醋酸曲安奈德， 醋酸可的松， 氫化潑尼松， 醋酸地塞米松）。 方法 色譜條件為 Waters XTerra? MSC18色譜柱 （2.1 mm× 150 mm， 5 μm）， 柱溫 35 ℃， 流動相以 0.1%甲酸 10 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈進(jìn)行梯度洗脫， 體積流量為 0.25 m L/m in。 質(zhì)譜條件為以電噴霧離子源正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。 結(jié)果 在建立的色譜條件下， 11 種糖皮質(zhì)激素有良好的分離， 且對其定性定量檢出， 線性范圍良好， 加樣回收率為 90% ～110%。 結(jié)論 該法操作簡便、 快捷、 高靈敏度、高準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，可同時(shí)對中成藥中非法添加多種糖皮質(zhì)激素進(jìn)行定性定量分離檢測。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用； 糖皮質(zhì)激素； 支氣管類中成藥

中成藥有著服用方便和毒副作用小等特點(diǎn)，但其成分復(fù)雜，一般方法不易監(jiān)督檢測，近年來，一些非法廠家為牟取暴利，在中成藥中添加糖皮質(zhì)激素類藥物，以提高療效，誤導(dǎo)群眾，造成糖皮質(zhì)激素類藥物的濫用。糖皮質(zhì)激素在一定程度上有著抗炎、抗過敏、抑制免疫反應(yīng)等作用，但長期使用糖皮質(zhì)激素時(shí)，會誘發(fā)和加重感染、引起中樞神經(jīng)并發(fā)癥、內(nèi)分泌及代謝系統(tǒng)紊亂及骨質(zhì)疏松等，對患者身心健康和生命安全造成極大威脅，其副作用不容忽視［1-2］。 對于糖皮質(zhì)激素， 目前鑒別方 法主要包括呈色反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、 薄層色譜［3］、 紫外分光光度法 （UV）、高 效 液 相 色 譜 法 （HPLC）［4-5］、氣相質(zhì)譜聯(lián)用法 （GC-MS）［6］， 高效液相色譜法-二極管陣列檢測法 （ HPLC-DAD）［7］、 液相質(zhì)譜聯(lián)用法 （ HPLC-MS）［8-9］， 超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用法 （ UPLC-MS）［10］等， 對于基質(zhì)較為復(fù)雜的中成藥來說，采用 HPLC-MS 的方法更能快速有效地對多種糖皮質(zhì)激素成分同時(shí)分離，并對其定性、定量檢測。為了打擊此激素類藥物的非法濫用，本實(shí)驗(yàn)建立了一個(gè)簡便、快捷、高準(zhǔn)確性、高靈敏度的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，同時(shí)分離檢測支氣管類中成藥中可能添加的11種糖皮質(zhì)激素， 加強(qiáng)藥物監(jiān)督工作的建設(shè)。

1 儀器和試藥

1.1 儀 器 2695/2998/Waters Alliance-Quanttro MicroTM高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 （ 美國 Waters公司）， KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗儀 （昆山市超聲 儀 器 有 限 公 司）， XS-205DU 電 子 分 析 天 平（METTLER TOLEDO公 司）， 電 子 天 平 及 移 液槍等。

1.2 試 劑 與 試 藥 倍 他 米 松 （ Betamethaone，100118-200403）、 丙 酸 倍 氯 米 松 （ Beclonmetasone Dlpropionate， 0119-9802 ） 、 氯 氟 舒 松 （ Halcinonidum， 146-9101）、 醋酸潑尼松龍 （ Prednisolone Acetate， 100124-200303， 純度為 99.2%）、氫化可的松 （Hydrocortisonum， 152-9204 ）、 醋 酸 氟 輕 松（ Fluocinonide， 100010-200507 ）、 醋 酸 潑 尼 松（ Prednisone Acetate， 0012-9204 ）、 醋 酸 曲 安 奈 德（Triamcinolone Acetonide，0125-9302 ） 、 醋 酸 可 的松 （ Cortisone Acetate，0123-9302 ）、 氫 化 潑 尼 松（ Prednisolonum， 153-9101）、 醋酸地塞米松 （ Dexamethasone Acetate， 100122-200805， 純 度 為99.6%） 這11 種糖皮質(zhì)激素藥物的對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供；供試品中成藥為治療支氣管炎或支氣管哮喘類的片劑、丸劑、膠囊及糖漿劑等 （在各藥店購得）； 甲醇、 乙腈均為色譜純，三氯甲烷、甲酸、乙酸銨為分析純，水為超純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)條件

2.1.1 液相色譜條件 Waters XTerra? MS C18色譜柱 （2.1 mm×150 mm， 5 μm）； 柱溫 35 ℃； 流動相 A為 0.1%甲酸 10 mmoL/L乙酸銨溶液， 流動相B為乙腈， 梯度洗脫， 洗脫程序見表1； 體積流量 0.25 mL/min； 進(jìn)樣量 10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 M obile Phases gradient elution Program

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源 （ESI）， 電噴霧毛細(xì)管 電 壓 （ Capillary） 2.71 kV， 源 溫 （ source Temp） 120 ℃， 脫溶劑氣溫度 （ Desolvation Temp）300 ℃， 脫 溶 劑 氣 體 積 流 量 （ Desolvation ） 500 L/h， 錐孔氣體積流量 （ Cone） 100 L/h， 采用正離子 （ES+） 掃描模式和多反應(yīng)監(jiān)測 （MRM） 模式檢測。 質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

表 2 11 種糖皮質(zhì)激素的質(zhì)譜采集參數(shù)Tab.2 MS acquisition Parameter of 11 glucocorticoids

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取上述所要測定的11 種糖皮質(zhì)激素藥物的對照品各約 10 mg于 10 mL量瓶中， 加適量甲醇，超聲 （功率 250 W，頻率 40 kHz） 10 min， 使其溶解， 并用甲醇定容， 搖勻；再精密量取各對照品溶液，配制成含醋酸潑尼松、 醋酸可的松、 氫化潑尼松各1 000 μg/L， 氯氟舒松、 氫化可的松各 4 000 μg/L， 倍他米松、醋酸潑尼松龍、 醋酸氟輕松、 醋酸曲安奈德各 500μg/L， 醋酸地塞米松 2 000 μg/L， 丙酸倍氯米松250 μg/L的高質(zhì)量濃度對照品混合溶液； 精密量取該高質(zhì)量濃度對照品混合溶液3mL，置于10mL量瓶中，用初始流動相稀釋至刻度，搖勻，得較低質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。 過 0.22 μm的濾膜［8］。 在實(shí)驗(yàn)條件下精密量取 10 μL進(jìn)樣， 記錄圖譜。 11種糖皮質(zhì)激素混合對照品溶液總離子流圖（見圖1）。

圖 1 11 種糖皮質(zhì)激素混合對照品溶液總離子流圖Fig.1 TIC of 11 glucocorticoidsm ixture reference substance

2.2.2 樣品溶液 對于片劑、丸劑先將其研細(xì)；若為膠囊，則倒出內(nèi)容物并將其研細(xì)，取樣品粉末適量 （約相當(dāng)于該藥品一次服用的量），置于 25 mL的量瓶中， 加甲醇 10 mL， 超聲 （功率 250 W，頻率 40 kHz） 10 min 溶解， 冷至室溫， 并用初始流動相 ［0.1%甲酸 10 mmoL/L乙酸銨溶液-乙腈（75 ∶25）］ 稀釋至刻度， 搖勻， 過濾， 取續(xù)濾液過 0.22 μm的濾膜， 得樣品溶液［8］。

若為糖漿劑，取約一次服用量，置于分液漏斗中， 加水 10 mL， 再一次加 10、 10、 5 mL的三氯甲烷-乙腈 （9 ∶1） 分次提取， 合并提取液于另一分液漏斗中， 用水洗滌2 次， 每次15mL。棄掉水層， 將三氯甲烷層蒸干， 殘留物用 10 mL甲醇轉(zhuǎn)移至 25 mL量瓶中， 用初始流動相稀釋到刻度， 搖勻， 過濾，取續(xù)濾液過 0.22 μm的濾膜， 得樣品溶液［8］。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線、 線性范圍及檢出限 分別精密量取 “2.2.1” 項(xiàng)下高質(zhì)量濃度的 11 種糖皮質(zhì)激素對照品混合溶液 0.5、 1、 2、 4、 6 mL于 25 m L的量瓶中， 用初始流動相稀釋至刻度， 搖勻，配制成一系列質(zhì)量濃度的對照品混合溶液，分別過0.22 μm的濾膜。 精密量取 10 μL進(jìn)樣，記錄圖譜。 將峰面積 （A）與其相對應(yīng)的組分質(zhì)量濃度（C） 進(jìn)行線性回歸， 所測的 11 種糖皮質(zhì)激素在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好； 按信噪比 （S/N） 為3 時(shí) 計(jì) 算 相 應(yīng) 成 分 的 檢 出 限［10-11］。 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 見表3。

2.2.4 加樣回收率 精密稱取已知含有量的樣品9 份， 平均分為 3 組， 分別精密加入 “2.2.1” 項(xiàng)下高質(zhì)量濃度對照品混合溶液 1、 3 和 5 mL， 照“2.2.2” 項(xiàng)下平行操作處理， 使其成低、 中、 高（分別約 20、 60、 100 μg/L） 質(zhì)量濃度的加標(biāo)溶液， 按實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣 10 μL， 記錄圖譜， 計(jì)算 11種糖皮質(zhì)激素的平均回收率均在 90% ～110%之間。

表 3 11 種糖皮質(zhì)激素的線性關(guān)系及檢出限Tab.3 L inear relation and detection lim it of 11 glucocorticoids

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取 “2.2.1” 項(xiàng)下較低質(zhì)量濃度的 11 種糖皮質(zhì)激素混合對照品溶液 10 μL，按上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣， 連續(xù)重復(fù) 6 次， 記錄圖譜， 按峰面積計(jì)算 RSD， 各成分的 RSD（n=6）分別為： 氫化潑尼松 0.29%、 氫化可的松 0.27%、倍他米松 0.59%、醋酸潑尼松 1.35%、 醋酸可的松0.67%、 醋酸潑尼松龍 0.45%、 醋酸地塞米松0.46%、 氯氟舒松 0.98%、 醋酸曲安奈德 0.45%、醋酸氟輕松 0.82%、丙酸倍氯米松 1.30%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取 “2.2.1” 項(xiàng)下較低質(zhì)量濃度的 11 種糖皮質(zhì)激素混合對照品溶液 10 μL， 分別在 0、 2、 4、 8、 12、 16、 24 h 按實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣， 記錄圖譜， 按峰面積計(jì)算 RSD均小于5%。 說明 24 h 內(nèi) 11 種糖皮質(zhì)激素對照品混合溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.7 所購樣品中各激素的測定 在該實(shí)驗(yàn)條件下， 共檢查了16 批不同的有治療支氣管炎或支氣管哮喘的中成藥，通過比較樣品與對照品中各色譜峰的色譜行為和質(zhì)譜行為，發(fā)現(xiàn)所測的藥品中有1批有檢出糖皮質(zhì)激素類藥物的現(xiàn)象，檢出的藥物是：氯氟舒松。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 大部分的糖皮質(zhì)激素類藥物都溶解于三氯甲烷、乙腈、丙酮、甲醇、以及乙酸乙酯中［12］。 本實(shí)驗(yàn)剛開始所采用的流動相為甲醇-0.1%甲酸 10 mmol/L乙酸銨溶液， 反復(fù)調(diào)節(jié)該流動相組分比例， 實(shí)驗(yàn)中的11種糖皮質(zhì)激素仍未得到良好的的色譜行為。最后將流動相更換乙腈-0.1%甲酸 10 mmol/L乙酸銨溶液， 經(jīng)過反復(fù)的摸索和調(diào)節(jié)之后， 發(fā)現(xiàn)按表 1進(jìn)行梯度洗脫， 11種糖皮質(zhì)激素能得到良好的分離，并有良好的色譜行為和質(zhì)譜行為， 可以將實(shí)驗(yàn)中的 11 種糖皮質(zhì)激素進(jìn)行定性定量分析。 文獻(xiàn)［13］報(bào)道當(dāng)甲酸含有量為 0.05% ～0.1%時(shí)， 隨著甲酸含有量的增加， 大多數(shù)糖皮質(zhì)激素的響應(yīng)值均逐漸增加；而甲酸含有量為 0.1% ～0.3% 時(shí)， 隨著甲酸含有量的增加，響應(yīng)值又逐漸降低； 所以甲酸含有量為 0.1%時(shí)目標(biāo)化合物的響應(yīng)值最高。乙酸銨使流動相保持一定的離子強(qiáng)度，改善峰型，減少拖尾。因此，最終選用了乙腈-0.1%甲酸 10 mmol/L乙酸銨溶液作為該實(shí)驗(yàn)的流動相，按表1的洗脫程序進(jìn)行梯度洗脫。

3.2 樣品的前處理與凈化 本實(shí)驗(yàn)比較了 3 種不同的樣品前處理凈化方法。平行稱取6份樣品于25 mL量瓶中， 均分為 3 組， 分別加入 10 mL甲醇和 3 mL的高質(zhì)量濃度混合對照品溶液， 超聲 10 min 后，冷卻。 第 1 份溶液直接用流動相稀釋至刻度［14］； 第 2 份溶液過 HLB固相萃取柱［15］， 并用流動相洗脫到25 mL的量瓶中， 流動相稀釋至刻度；第 3 份溶液過 C18固相萃取柱， 并用流動相洗脫到25 mL的量瓶中， 流動相稀釋至刻度［16］。 按實(shí)驗(yàn)條件各進(jìn)樣 10 μL。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 按第 1 份加樣回收的樣品溶液處理完后不選擇過柱，直接定容時(shí)，回收率較高。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)樣品前處理方法簡單、成本低、污染小， 采用 0.1%甲酸 10mmol/L乙酸銨溶液-乙腈的流動相進(jìn)行梯度洗脫， 并對其進(jìn)行 ES+正離子掃描和 MRM模式檢測， 本實(shí)驗(yàn)建立了一個(gè)簡便、 快捷、 高準(zhǔn)確性、 高靈敏度的 HPLC-MS 的方法， 能快速有效地對中成藥中非法添加的11種糖皮質(zhì)激素類藥物同時(shí)定性、定量檢測。本研究為支氣管類中成藥中非法添加糖皮質(zhì)激素類藥物提供了一個(gè)有實(shí)用價(jià)值的檢測方法，以便加強(qiáng)中成藥類非法添加的監(jiān)督管理工作。

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Simultaneous determ ination of eleven glucocorticoids in Chinese trandition medicines for bronchus by HPLC-MS

CHEN Feng1， CHEN Yu1， DONG Pei-jian2
（1.Guangxi Yulin Institute for Food and Drug Control， Yulin 537000， China； 2.Guangxi Guilin Medical College， Guilin 541000， China）

AIM To establish amethod for detecting eleven glucocorticoids（Betamethaone， Beclonmetasone，Dlpropionate， Halcinonidum，Prednisolone acetate， Hydrocortisonum， Fluocinonide，Prednisone acetate，Triamcinolone acetonide， Cortisone acetate， Prednisolonum， Dexamethasone acetate） thatwere illegally added in antiasthmatic herbal preparations.M ETHODS Waters XTerra? MSC18（2.1 mm×150 mm， 5 μm） column was used with column temperature of35 ℃， themobile phase was consisted of 0.1%formic acid-10 mmol/L ammonium acetate solution and acetonitrile in gradientelutionmanner， the flow rate was 0.25 mL/min.Electronspray ionization in the positive ionsmode was adopted in mass spectrometry.RESULTS In the chromatographic conditions established， the eleven glucocorticoidswere separated finely and could be detected qualitatively and quantitatively，the range of linearity was good with the labeled recovery from 90%to 110%.CONCLUSION Thismethod not only is convenient， rapid， sensitive and accurate， butalso can be used to separate and detecta variety ofglucocorticoids qualitatively and quantitatively in Chinese trandition medicines at the same time.

HPLC-MS； glucocorticoids； Chinese trandition medicines for bronchus

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）01-0102-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.025

2013-03-04

陳 鳳 （1978—） ， 女， 碩士生。 E-mail： feng077101@163.com