鼻淵舒對(duì)慢性鼻-鼻竇炎模型鼻竇黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體功能的影響

李 輝， 朱天民

（1.成都大學(xué)醫(yī)護(hù)學(xué)院， 四川 成都 610106； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)， 四川 成都 610075）

鼻淵舒對(duì)慢性鼻-鼻竇炎模型鼻竇黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體功能的影響

李 輝1， 朱天民2*

（1.成都大學(xué)醫(yī)護(hù)學(xué)院， 四川 成都 610106； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)， 四川 成都 610075）

目的 觀察鼻淵舒 （辛夷、 蒼耳子、 梔子、 黃芪、 白芷、 黃芩、 柴胡、 薄荷、 細(xì)辛、 川木通、 川芎） 對(duì)慢性鼻-鼻竇炎模型鼻竇黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體的受體親和力及轉(zhuǎn)錄激活能力等功能的影響， 從細(xì)胞抑炎機(jī)制角度， 探討鼻淵舒治療慢性鼻-鼻竇炎的可能機(jī)制。 方法 選取 100 只健康新西蘭大白兔， 按每組 20 只， 隨機(jī)分為正常、 模型、假手術(shù)、 克拉霉素、 鼻淵舒組， 建立慢性鼻-鼻竇炎模型， 正常、 模型、 假手術(shù)組不干預(yù)， 克拉霉素組、 鼻淵舒組分別予以克拉霉素 25 mg/（kg·d）、 鼻淵舒口服液 1.5 mL/（kg·d）灌胃， 治療 14 d 后取各組鼻竇黏膜上皮， HE染色后觀察鼻竇黏膜組織的病理形態(tài)學(xué)改變，受體的放射性配基結(jié)合分析及報(bào)告質(zhì)粒分析法觀察糖皮質(zhì)激素受體的受體結(jié)合容量、解離常數(shù)及轉(zhuǎn)錄激活能力。結(jié)果 模型組鼻竇黏膜呈慢性炎癥改變，黏膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體及杯狀細(xì)胞明顯增生； 模型組黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體解離常數(shù)較正常組顯著增高 （P＜0.01）， 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pMTV-CAT后， 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 （CAT） 表達(dá)較正常及假手術(shù)組顯著下降 （P＜0.01）。 鼻淵舒治療后， 鼻竇黏膜上皮得到較好修復(fù)， 上皮組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)、 杯狀細(xì)胞及腺體少見(jiàn)增生； 糖皮質(zhì)激素受體解離常數(shù)顯著低于模型組 （P＜0.01）， 與正常組比較無(wú)顯著性差異 （P＞0.05）， 轉(zhuǎn)染 pMTV-CAT質(zhì)粒后， CAT表達(dá)顯著高于模型組 （P＜0.01）， 與正常及假手術(shù)組比較無(wú)顯著差異 （P＞0.05）。 結(jié)論 鼻淵舒能顯著改善慢性鼻-鼻竇炎模型鼻竇黏膜慢性炎癥狀態(tài)， 其機(jī)制與提高黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體的受體親和力及轉(zhuǎn)錄激活能力有關(guān)。

鼻淵舒口服液； 慢性鼻-鼻竇炎； 鼻竇黏膜上皮； 糖皮質(zhì)激素受體； 受體親和力； 轉(zhuǎn)錄激活能力

慢性鼻-鼻竇炎 （chronic rhinosinusitis） 治療困難，反復(fù)發(fā)作，對(duì)呼吸系統(tǒng)可產(chǎn)生不利影響。鼻淵舒口服液作為臨床治療慢性鼻-鼻竇炎的有效中成藥，其臨床研究較多，但其治療機(jī)制尚未明了。糖皮質(zhì)激素受體 （ glucocorticoid receptor） 介導(dǎo)了體內(nèi)重 要 的 抑 炎 激 素——糖 皮 質(zhì) 激 素 （ glucocorticoid）的生物學(xué)效應(yīng)［1］。 其在鼻淵舒口服液治療慢性鼻-鼻竇炎中的作用未見(jiàn)報(bào)道， 本實(shí)驗(yàn)采用受體的放射性配基結(jié)合分析 （Radioligand Binding Assay of Receptors， RBA） 及報(bào)告質(zhì)粒分析法觀察了鼻淵舒口服液對(duì)慢性鼻-鼻竇炎模型鼻竇黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體功能的影響，以探討其治療機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康新西蘭大耳白兔 100 只， 體質(zhì)量 1.5 ～3.0 kg， 雌雄各半。 于四川實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專(zhuān)業(yè)委員會(huì)繁育場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)， 合格證號(hào)： SCXL（川） -2008-14， 成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

1.2 主要藥品、 試劑與儀器 金葡菌菌液 （四川省中醫(yī)院細(xì)菌室制備）， 克拉霉素片 （南京瑞爾制藥公司，批號(hào)為090301），鼻淵舒口服液 （成都華神 公 司 制 藥 廠， 國(guó) 藥 準(zhǔn) 字： Z51020208， 10 mL/支， 批 號(hào)： 090425 ） ，3H-地 塞 米 松 （3H-Dex，放射比活性 34 Ci/mmoL， Amersham公司），地塞米 松 （Sigma公 司 ）， GF/C 型 玻 璃 纖 維 濾 膜（Whatman 公司） ， 二甲苯 （ 重慶化學(xué)試劑總廠），三羥甲基氨基甲烷 （ Tris， 北京化工廠） ， 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 （CAT）檢測(cè)試劑盒 （GBD公司），pMTV-CAT質(zhì)粒 （成都醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)），MEM/F12 培養(yǎng)基 （Hyclone公司）， 標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清 （ 蘭州民海生物技術(shù)有限公司）， KeyGenTransⅢ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑 （南京凱基生物發(fā)展有限公司）。ZT—Ⅱ型多頭細(xì)胞收集器 （紹興衛(wèi)星機(jī)械有限公司），LS 6500型液體閃爍計(jì)數(shù)儀 （計(jì)數(shù)效率 26%， Beckman 公司）， 酶標(biāo)儀 （Thermo公司） 等。

2 方法

2.1 分組方法 適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，依照 SAS8.0軟件生成的隨機(jī)數(shù)字表，隨機(jī)分為正常、模型、假手術(shù)、 克拉霉素、 鼻淵舒組， 每組各20只。

2.2 建立慢性鼻-鼻竇炎模型

2.2.1 制備菌種 取慢性鼻竇炎患者上頜竇沖洗液，細(xì)菌鑒定儀分離篩選出金黃色葡萄球菌，血平板接種， 37 ℃培養(yǎng) 24 h， 收集菌落， 稀釋成 1 麥?zhǔn)蠁挝坏木骸?/p>

2.2.2 造模方法 使用竇口不完全阻塞結(jié)合竇腔留置棉絮法， 建立慢性鼻-鼻竇炎模型［2］。 將兔用氯氨酮 50 mg/kg肌注麻醉， 鼻背正中的毛剪短、刮光， 消毒、鋪巾，1%利多卡因浸潤(rùn)麻醉， 選取一側(cè)上頜竇前壁，逐層分離皮下組織及骨膜，鉆一直徑1.5 mm的孔。 通過(guò)該孔將少量棉絮放置在竇口及竇腔，竇口不完全堵塞，將骨膜、皮膚逐層縫合。 術(shù)后第2天， 取1 mL細(xì)菌懸濁液，通過(guò)小孔注入模型、 鼻淵舒及克拉霉素組竇腔，飼養(yǎng) 42 d，建立慢性鼻-鼻竇炎模型。 假手術(shù)組手術(shù)方法同上，不注射細(xì)菌及處理竇口。正常組不做處理，各組均精飼料喂養(yǎng)、自由飲食飲水。

2.3 治療方法 造模后第43 天開(kāi)始， 鼻淵舒組給予鼻淵舒口服液 1.5 mL/（kg·d）灌胃， 克拉霉素組給予克拉霉素 25 mg/（ kg·d） 灌胃， 共 14 d［3］；正常、模型、假手術(shù)組不給藥。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.4.1 一般情況及癥狀、 體征 觀察各組兔造模及治療前后的活動(dòng)、毛色、進(jìn)食進(jìn)水量，及鼻塞、流涕、噴嚏等癥狀。

2.4.2 鼻竇黏膜組織病理改變 HE染色后， 光鏡觀察上頜竇黏膜上皮排列，炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度，腺體和杯狀細(xì)胞分布、數(shù)量等。

2.4.3 鼻竇黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體的放射性配基結(jié)合分析 兔鼻黏膜組織剪碎，加入適量體積的勻漿液， 5 000 r/min 勻漿， 800 ×g 離心 15 min，收集 上 清， 30 000 ×g 離 心 20 min， 收 集 上 清，-70 ℃貯存，Lowry法測(cè)定胞漿蛋白濃度。 受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)記配基多點(diǎn)飽和法，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程在冰 浴 中 進(jìn) 行。 用 0.05 mol/L Tris-HCl緩 沖 液（pH7.4） 分 別 配 置 6.25、 12.5、 25、 50、 100、200 nmol/L的3H-Dex， 于 對(duì) 應(yīng) 實(shí) 驗(yàn) 管 中 各 加 入50 μL，形成終濃度分別為 1.562 5、 3.125、6.25、12.5、 25、 50 nmol/L的3H-Dex， 非特異結(jié)合管另加 入 100 μmol/L 地 塞 米 松 50 μL （ 終 濃 度25 μmol/L），胞漿蛋白 80 μg， 加入 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液補(bǔ)足反應(yīng)體積 200 μL， 混勻， 24℃ 1.5 h。 用多頭細(xì)胞收集器收集受體 -配基復(fù)合物至玻璃纖維濾膜， 蒸餾水洗滌3次。 濾膜 37 ℃烘干后置閃爍瓶?jī)?nèi)， 加入 0.5%PPO二甲苯閃爍液5 mL， 避光 2 h 后在 LS 6500 型液體閃爍計(jì)數(shù)儀進(jìn)行放射計(jì)數(shù)， 檢測(cè)各管的放射性。 以公式： ［RL］（受體配體復(fù)合物濃度） =標(biāo)本的特異性結(jié)合（specific binding，SB） 放射性 /（ 計(jì)數(shù)效率 ×配基放射比活性 ×標(biāo)本蛋白量），求得 ［RL］；然后根據(jù)以 ［RL］ 為變量的飽和曲線(xiàn)方程： ［RL］2-［RL］ × ｛ ［RT］ + ［LT］ +KD］｝ + ［RT］ ×［LT］ =0，將以上各3H-Dex濃度點(diǎn)的 ［ LT］（ 總配體濃度） 和測(cè)得的 ［RL］ 代入該方程， 用計(jì)算機(jī)擬合求出糖皮質(zhì)激素受體的解離常數(shù) （KD，nmol/L） 和 受 體 結(jié) 合 容 量 （ RT， fmol/mg蛋 白質(zhì)）。該計(jì)算過(guò)程由專(zhuān)用放射性配體與受體結(jié)合分析軟件自動(dòng)進(jìn)行。

2.4.4 糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄激活能力測(cè)定

2.4.4.1 鼻竇黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng) 超凈臺(tái)冰盤(pán)上取出的鼻竇黏膜上皮用氟康唑、慶大霉素?zé)o菌生理鹽水沖洗5～6遍， 將黏膜片剪為 1 mm ×1 mm大小黏膜塊， 0.1%膠原酶 37 ℃消化 30 min， 振蕩使上皮細(xì)胞脫落。然后將細(xì)胞懸液移至另一個(gè)離心管，加入等量 0.25%胰蛋白酶， 吹打 5 min， 1 000 r/min 4 ℃離心 5min 后棄上清， 加入適量胎牛血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液， 錐蟲(chóng)藍(lán)染色證實(shí) 95%以上為活細(xì)胞， 調(diào)整細(xì)胞數(shù)為 3 ×107/L， 接種于 6 孔培養(yǎng)皿中， 37 ℃、5%CO2，95%O2培養(yǎng) 24 h 后更換無(wú)血清生長(zhǎng)因子 DMEM/F12 1 ∶1 培養(yǎng)基，每3 日換液， 使細(xì)胞達(dá)到60% ～80%融合率。

2.4.4.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及 CAT活性測(cè)定 轉(zhuǎn)染前 1 日用完全培養(yǎng)基在 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上， 每孔接種900 μL細(xì)胞培養(yǎng)液及 2 ×105個(gè)細(xì)胞， 轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度達(dá)到 70% ～90%。 將 1 μg pMTV-CAT質(zhì)粒與100 μL無(wú)血清、 無(wú)抗生素的培養(yǎng)基在 1.5 m L無(wú)菌EP管中混勻后， 再加入 2 μL KeyGenTransⅢ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑混勻， 室溫放置 10 ～15 min， 獲得 100 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物。 將前述的 100 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物直接滴加到含 900 μL完全培養(yǎng)基的細(xì)胞上清中， 輕輕搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分散。 37 ℃、5%CO2條件下孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞 48 h 后， 分別向轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的培養(yǎng)瓶中加入相應(yīng) 100 nmol/L地塞米松，繼續(xù)培養(yǎng) 12 h 后， 收集細(xì)胞， ELISA法檢測(cè) CAT活性。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0 軟件處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料，單因素方差分析進(jìn)行組間比較， 雙側(cè) α=0.05 作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)， P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況及癥狀、 體征變化 造模前， 各組兔進(jìn)食正常，活動(dòng)敏捷，皮毛光澤，鼻、唇部清潔，大便正常，無(wú)兔死亡。造模后，正常和假手術(shù)組兔無(wú)死亡，模型組4只、鼻淵舒組2只兔因肺部感染死亡；克拉霉素組分別因灌胃不當(dāng)及肺部感染致2只兔死亡；除正常、假手術(shù)組，其余各組兔普遍活動(dòng)遲緩，鼻塞、 膿涕明顯， 時(shí)發(fā)噴嚏 （約每分鐘3～4個(gè)）。 治療后， 鼻淵舒、 克拉霉素組兔行為活躍，鼻塞、膿涕、噴嚏消失；至處死前，模型組活動(dòng)較為遲緩，鼻塞、膿涕、噴嚏等癥狀未見(jiàn)改善；正常及假手術(shù)組，未見(jiàn)鼻塞、膿涕、噴嚏等癥狀。

3.2 鼻竇黏膜病理改變 正常及假手術(shù)組鼻竇黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊；散在分布少量杯狀細(xì)胞，黏膜下層無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體數(shù)量少；模型組鼻竇黏膜呈慢性炎癥改變，上皮增生，纖毛脫失，部分區(qū)域鱗狀上皮化生，杯狀細(xì)胞增生；黏膜下腺體增生，單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞明顯浸潤(rùn)， 提示慢性鼻-鼻竇炎模型建立成功； 鼻淵舒組鼻竇黏膜上皮及其纖毛排列較為整齊，炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度不如模型及克拉霉素組明顯；克拉霉素組鼻竇黏膜上皮損傷較嚴(yán)重，纖毛脫失，炎細(xì)胞浸潤(rùn)較假手術(shù)、 鼻淵舒組明顯 （見(jiàn)圖 1）。

圖1 各組鼻竇黏膜 HE染色Fig.1 HE staining of nasal sinuses mucosa from different grouPs

3.3 鼻竇黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合容量及解離常數(shù)比較 各組鼻竇黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合容量比較無(wú)顯著性差異 （P＞0.05）； 模型組鼻竇黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體解離常數(shù)較正常組顯著增高 （P＜0.01）， 假手術(shù)、 克拉霉素、 鼻淵舒組糖皮質(zhì)激素受體解離常數(shù)顯著低于模型組 （P＜0.01）， 與正常組比較無(wú)顯著性差異 （P＞0.05）。見(jiàn)表1。

3.4 各組鼻竇黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄激活能力比較 模型組、克拉霉素組鼻竇黏膜上皮轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pMTV-CAT后， 氯霉素乙酰轉(zhuǎn) 移酶 （ CAT）表達(dá)較正常及假手術(shù)組顯著下降 （P＜0.01）， 提示模型組和克拉霉素組鼻竇黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄激活能力較正常組及假手術(shù)組顯著降低；鼻淵舒組轉(zhuǎn)染 pMTV-CAT后， CAT表達(dá)顯著高于模型組 （P＜0.01）， 與正常及假手術(shù)組比較無(wú)顯著差異 （P＞0.05）， 提示鼻淵舒組糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄激活能力較模型組顯著增高，且與正常及假手術(shù)組比較無(wú)顯著變化； 鼻淵舒組 CAT表達(dá)與克拉霉素組比較無(wú)顯著差異 （P＞0.05）， 提示鼻淵舒與克拉霉素組皮糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄激活能力無(wú)顯著變化。 見(jiàn)表2。

表1 各組糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合容量及解離常數(shù)比較Tab.1 Com Parisons of them aximum binding caPacity and dissociation constan t of glucocorticoid recePtor among grouPs

表1 各組糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合容量及解離常數(shù)比較Tab.1 Com Parisons of them aximum binding caPacity and dissociation constan t of glucocorticoid recePtor among grouPs

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01

解離常數(shù)/（ nmol·L-1）正常組 20 308.70 ±26.25 5.29 ±0.94模型組 16 328.68 ±51.66 8.92 ±2.33##假手術(shù)組 20 332.65 ±34.71 6.07 ±0.84▲▲克拉霉素組 18 309.45 ±42.82 5.58 ±1.22▲▲鼻淵舒組 18 321.13 ±37.89 5.92 ±1.68組 別 動(dòng)物數(shù)/只受體結(jié)合容量/（ fmol·mg-1）▲▲

表2 各組糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄激活能力比較Tab.2 Assessment of transcriPtional activation function of glucocorticoid recePtor among differen t grouPs

表2 各組糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄激活能力比較Tab.2 Assessment of transcriPtional activation function of glucocorticoid recePtor among differen t grouPs

注： 與 正 常 組 比 較，##P＜0.01； 與 模 型 組 比 較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01； 與假手術(shù)組比較，★★P＜0.01

組 別 動(dòng)物 數(shù) /只 CAT活性 /（ ng·mL-1）正常組 20 12.34 ±1.34模型組 16 9.82 ±1.41##假手術(shù)組 20 12.44 ±1.38▲▲克拉霉素組 18 10.98 ±1.19##▲★★鼻淵舒組 18 11.59 ±1.25▲▲

4 討論

慢性鼻-鼻竇炎 （chronic rhinosinusitis）是一種常見(jiàn)慢性炎癥性疾病，反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，嚴(yán)重影響健康。 許多證據(jù)顯示慢性鼻-鼻竇炎的發(fā)生、發(fā)展是多因素相互作用的結(jié)果，在此過(guò)程中，存在由免疫活性細(xì)胞及其釋放的多種細(xì)胞因子相互作用導(dǎo)致持續(xù)性炎癥性反應(yīng)的復(fù)雜關(guān)系［4-5］。

鼻淵舒口服液為臨床應(yīng)用多年的常用鼻科中成藥，主要由辛夷、蒼耳子、梔子、黃芪、白芷、黃芩、柴胡、薄荷、細(xì)辛、川木通、川芎等組成。其味甘、微苦，具有清熱益氣通竅的功效。方中黃芩、梔子清熱燥濕瀉火。黃芪補(bǔ)中益氣固表。辛夷、蒼耳子、白芷、柴胡、細(xì)辛、薄荷等辛散風(fēng)邪，開(kāi)通鼻竅。川木通、川芎祛風(fēng)利濕。目前該藥被臨床廣泛用于慢性鼻-鼻竇炎的治療， 多中心隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)其對(duì)慢性鼻-鼻竇炎具有良好的治療效果［6］。

糖皮質(zhì)激素具有抗炎、免疫抑制等作用，其生物學(xué)效應(yīng)依賴(lài)于糖皮質(zhì)激素受體［1］。 糖皮質(zhì)激素受體既是激素核受體，又是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控了多種基因表 達(dá)［7］。 失 活 狀 態(tài)的 糖 皮 質(zhì)激 素 受體其配 體 結(jié)合區(qū) （ligand binding domain， LBD） 結(jié)合有熱休克蛋白，當(dāng)糖皮質(zhì)激素與糖皮質(zhì)激素受體的 LBD結(jié)合后， 熱休克蛋白解離， 糖皮質(zhì)激素受體活化并移位到核內(nèi)［8］， 與靶基因 DNA上的糖皮質(zhì)激素調(diào)控元件及負(fù)糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件 （Negative glucocorticoid response element， nGRE） 結(jié) 合，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。大量研究證實(shí)，糖皮質(zhì)激素-糖皮質(zhì)激素受體可抑制 IL-1、 TNF-α等多種炎性細(xì)胞因子的生成和釋放，發(fā)揮顯著的抗炎作用［9-10］。Nonoyama等［11］研究發(fā)現(xiàn) IL-1 能誘導(dǎo)黏附分子在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)， 促進(jìn)慢性鼻-鼻竇炎炎癥組織中的多形核中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，引起鼻竇黏膜功能和形態(tài)的 變 化。 李 延 忠 等［12］報(bào)告， TNF-α可 促 進(jìn)白細(xì)胞向炎癥區(qū)域浸潤(rùn)，在鼻竇慢性炎癥和息肉性病變中其可激活嗜酸性細(xì)胞并提高其生存能力。因此， 糖皮質(zhì)激素受體與慢性鼻-鼻竇炎的發(fā)生發(fā)展及鼻竇黏膜的炎性病理改變密切相關(guān)。

自1980 年代以來(lái)， 在受體研究方法領(lǐng)域出現(xiàn)了點(diǎn)突變，單克隆抗體、熒光和酶等方法，但這些方法都不能檢測(cè)受體親和力。至今，研究受體親和力和受體數(shù)量最基本的方法仍然是受體的放射性配基 結(jié) 合 分 析 （ Radioligand Binding Assay of Receptors， RBA） ， 其 具 有 靈 敏 度 高、 特 異 性 強(qiáng) 的 優(yōu)點(diǎn)［13］。 因此， 本 實(shí) 驗(yàn) 利 用3H-Dex作 為 放 射 配 基 進(jìn)行多點(diǎn)結(jié)合飽和實(shí)驗(yàn)，觀察了各組鼻竇黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體的受體結(jié)合容量及解離常數(shù)的變化。受體結(jié)合容量反映了能夠與配體結(jié)合的受體數(shù)量，解離常數(shù)反映了受體與其配體的親和力即結(jié)合能力，解離常數(shù)值與親和力呈負(fù)相關(guān)，解離常數(shù)值越低，受體與配體的親和力越高，結(jié)合能力越強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示：模型組糖皮質(zhì)激素受體的解離常數(shù)值較正常組顯著升高 （P＜0.01）， 鼻淵舒及克拉霉素組糖皮質(zhì)激素受體的解離常數(shù)值顯著低于模型組 （P＜0.01）， 與正常組比較無(wú)顯著性差異 （P＞0.05）。 提示慢性鼻-鼻竇炎時(shí)， 鼻竇黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體與糖皮質(zhì)激素的親和力下降，鼻淵舒可提高鼻竇粘膜上皮糖皮質(zhì)激素受體與糖皮質(zhì)激素的親和力，加強(qiáng)鼻竇黏膜上皮的抗炎作用。

此外，糖皮質(zhì)激素的抗炎等作用除與糖皮質(zhì)激素受體的數(shù)量及親和力有關(guān)外，還與糖皮質(zhì)激素受體在 細(xì) 胞 核 內(nèi) 的 轉(zhuǎn) 錄 激 活 能 力 有 關(guān)［14］。 質(zhì) 粒pMTV-CAT是糖皮質(zhì)激素受體、 雄激素受體等的報(bào)告載體，其啟動(dòng)子含有多種激素效應(yīng)元件，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 （CAT） 為其報(bào)告基因， 當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染了此質(zhì)粒后， 只要體系中存在糖皮質(zhì)激素-糖皮質(zhì)激素受體， 細(xì)胞中就會(huì)有 CAT生成。因此， 通過(guò)檢測(cè) CAT的活性變化就能準(zhǔn)確地了解糖皮質(zhì)激素受體的轉(zhuǎn)錄激活能力［15］。 本研究發(fā)現(xiàn)慢性鼻-鼻竇炎模型組鼻竇黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄激活能力較正常及假手術(shù)組顯著降低， 提示慢性鼻-鼻竇炎時(shí)存在糖皮質(zhì)激素受體的轉(zhuǎn)錄激活能力下降。鼻淵舒組糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄激活能力較模型組顯著增高， 提示鼻淵舒治療慢性鼻-鼻竇炎亦與其增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體的轉(zhuǎn)錄激活能力有關(guān)。

總之， 本研究發(fā)現(xiàn)慢性鼻-鼻竇炎時(shí)存在鼻竇黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體的受體親和力及轉(zhuǎn)錄激活能力下降，鼻淵舒可通過(guò)改善鼻竇黏膜上皮糖皮質(zhì)激素受體親和力、轉(zhuǎn)錄激活能力等功能，干預(yù)鼻竇黏膜上皮慢性炎癥，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Influence of Biyuanshu Oral Liquid on glucocorticoid recePtors of nasalmucosal ePithelial cells in rabbit w ith chronic rhinosinusitis

LIHui1， ZHU Tian-min2*
（1.Medical and Nursing School， Chengdu University， Chengdu 610106， China； 2.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610075， China）

AIM To investigate the influence of Biyuanshu Oral Liquid （ Magnoliae Flos， Xanthii Fructus，Gardeniae Fructus， Astragali Radix，Angelicae dahuricae Radix， Scutellariae Radix， Bupleuri Radix， Methae Herba， AsariHerba，ClematidisarmandiiCaulis，Chuanxiong Rhizoma ） on the affinity and transcriptional activity to glucocorticoid receptors（ GR） of nasal sinusesmucosal epithelial cells in rabbit with chronic rhinosinusitis（CRS）.METHODS One hundred New Zealand rabbits with CRS were randomly assigned into model group，sham operation group， clarithromycin group， Biyuanshu Oral Liquid group， and normal group without CRS， 20 in each group.There were not any interventions on normal group，model group and sham operation group.Clarithromycin group was given clarithromycin 25 mg/（ kg·d）， and Biyuanshu Oral Liquid group was given Biyuanshu O-ral Liquid 1.5 m L/（ kg·d） for 14 days.After the treatment， nasal sinusesmucosal tissue was collected to observe their pathological changes after HE dyeing，and to detect the maximum binding capacity， dissociation constant（ KD） and transcriptional activity of GR with radioligand binding assay and reporter plasmids analysis.RESULTS In model group， chronic inflammation and inflammatory cell infiltration， epithelial cells and hyperplasia of glandular organs and goblet cellswith CRSwere obvious.The dissociation constant of nasal sinusesmucosal epithelium cytoplasm GR was higher than that in the normal group （ P＜0.01 ） .After plasmid pMTV-CAT transfection， the CAT expression was lower than that in the normal and sham operation group （ P＜0.01） .After the treatmentwith Biyuanshu Oral Liquid， the nasal sinusesmucosa epithelium was repaired， and inflammatory cell infiltration， hyperplasia of epithelial cells and glandular organsand goblet cellswere rare.The dissociation constantof GR was obviously lower than that in the model group （ P＜0.01） with out apparent difference in the normal group （ P＞0.05） .After plasmid pMTV-CAT transfection， the CAT expression was significantly higher than that in themodel group （ P＜0.01） with out apparent difference in the normal and sham operation group （ P＞0.05 ） .CONCLUSION Biyuanshu Oral Liquid could significantly regulate the chronic inflammation nasal sinusesmucosa epithelial cells in rabbit with CRS.Its therapeutic mechanism could be possibly related to improving the affinity and transcriptional activity of GR of nasal sinusesmucosal epithelial cells.

Biyuanshu Oral Liquid； chronic rhinosinusitis； nasal sinusesmucosal epithelium； glucocorticoid receptors； receptor affinity； transcription activity

?圖分類(lèi)號(hào)： R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0030-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.008

2013-04-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （81102621； 30801480）； 成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金資助項(xiàng)目 （ZRYB200945）

李 輝 （1977—） ， 男， 副教授， 醫(yī)學(xué)博士， 研究方向： 中醫(yī)藥治療慢性炎癥性疾病的機(jī)制。 Tel： 13980753275， E-mail： ttlihui@163.com

*通信作者： 朱天民 （1977—） ， 女， 教授， 醫(yī)學(xué)博士， 研究方向： 中西醫(yī)結(jié)合康復(fù)的實(shí)驗(yàn)與臨床。 E-mail： tmzhu66@aliyun.com