白花丹參提取物對(duì)脂多糖損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞周期與凋亡的影響

焦 鵬， 楊娜娜， 唐瑜菁， 秦樹(shù)存

（ 泰山醫(yī)學(xué)院 動(dòng)脈粥樣硬化研究所， 山東 泰安 271000）

白花丹參提取物對(duì)脂多糖損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞周期與凋亡的影響

焦 鵬， 楊娜娜， 唐瑜菁， 秦樹(shù)存*

（ 泰山醫(yī)學(xué)院 動(dòng)脈粥樣硬化研究所， 山東 泰安 271000）

目的 探討白花丹參提取物對(duì)脂多糖損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞周期與凋亡的作用。 方法 以 10 μg/mL脂多糖誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷， 制備內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷模型后用不同質(zhì)量濃度白花丹參提取物干預(yù)， 用 MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞活性，用 AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化， 碘化丙啶單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期。 結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞增殖活性明顯下降， 細(xì)胞凋亡率明顯增加， S 期細(xì)胞比率降低， G0/G1期細(xì)胞比率增加。 與模型組比較，白花丹參組細(xì)胞存活率升高， 細(xì)胞凋亡率下降， 且呈劑量依賴(lài)性， G0/G1期細(xì)胞比率降低， S 期及 G2/M期細(xì)胞比率均增加。結(jié)論 白花丹參對(duì)脂多糖損傷的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)保護(hù)細(xì)胞周期正常進(jìn)行、抑制細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

白花丹參；內(nèi)皮祖細(xì)胞；細(xì)胞周期；凋亡；增殖

我國(guó)近年來(lái)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升和年輕化趨勢(shì)［1］。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)，保護(hù)血管內(nèi)皮功能是防治動(dòng)脈粥樣 硬化的 重要手 段之一［2-3］。 內(nèi)皮祖細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，亦稱(chēng)為成血管細(xì)胞，在生理或病理因素刺激下，可從骨髓動(dòng)員到外周血參與損傷血 管的修 復(fù)［4-5］。丹參是唇 形科鼠尾草屬植物，是治療心腦血管病的常用中藥，其活性成分主要包括脂溶性和水溶性?xún)纱箢?lèi)，這兩類(lèi)成分在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的各個(gè)階段均具一定作用［6］。本研究所使用的白花丹參采自泰山，屬稀有罕見(jiàn)的名貴中藥材，是丹參族中的極品。本實(shí)驗(yàn)擬在脂多糖致血管內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷模型上研究白花丹參水溶性提取物對(duì)受損內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響。

1 材料

1.1 藥 物 和 細(xì) 胞 白 花 丹 參 Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba采自泰山， 白花丹參提取物的制備和人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定參照本課題組發(fā)表的文獻(xiàn)， 即參考文獻(xiàn) ［7］。

1.2 試劑 EBM-2 培養(yǎng)基購(gòu)自 Lonza公司； MTT，PI， AnnexinV/PI染色試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物科技公司； 脂多糖， DMSO購(gòu)自 Sigma公司。

1.3 儀 器 流 式 細(xì) 胞 儀 （BD FACSCalibur，美國(guó)）， RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠）， SHBⅢ型循環(huán)水式多用真空泵 （鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）， 酶標(biāo)儀 （550 型， 美國(guó) BIO-RAD公 司 ）， 圖 像 分 析 系 統(tǒng) Lasersharp2000 軟 件（v4.5.3， 美國(guó) BIO-RAD公司）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將體外培養(yǎng)的臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組不予任何處理，脂多糖損傷組用 10 μg/m L脂多糖處理 12 h 誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷，白花丹參干預(yù)組用脂多糖誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷后用不同質(zhì)量濃度 （0.2、 0.4、 0.8 g/L） 白花丹參提取物干預(yù)12 h。

2.2 細(xì)胞活力的檢測(cè) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以 1.2 ×104個(gè)/孔的密度加入 96 孔板中， 每孔 100 μL培養(yǎng)基， 每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔， 生長(zhǎng)過(guò)夜后， 分別按以上分組處理， 12 h后棄原培養(yǎng)基， 各孔加入含 0.5 mg/LMTT的培養(yǎng)液， 繼續(xù)孵育 4 h 后棄上清， 每孔加 DMSO 150 μL， 充分振蕩 30 min 后在490 nm測(cè)定每孔的吸光度 A值， 對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 按分組處理細(xì)胞后， 分別收集各組漂浮細(xì)胞和用胰酶消化下的細(xì)胞， PBS 洗2 次，1 100 r/min離心 5 min 后去上清， 按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 AnnexinV/PI染色后， 立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 胰酶消化實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液， 加入 75%的冰乙醇， 4 ℃ 固 定 過(guò) 夜， 1 100 r/min 離 心 5 min， 細(xì) 胞用 PBS 洗 2 次后加入 10 μg/mL的 RNaseA， 37 ℃作用 30 min，加 入 10 μg/mL的 碘 化 丙 啶 染 料， 4℃閉光染色 30 min 后上機(jī)檢測(cè)， 用 CellQuest軟件獲取細(xì)胞后用 Modifit軟件分析各組細(xì)胞的周期分布， 分 析 G0/G1期、 S 期 和 G2/M 期 細(xì) 胞 所 占比例［8］。

3 結(jié)果

3.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞的活力檢測(cè) 不同質(zhì)量濃度白花丹參提取物對(duì)脂多糖損傷后內(nèi)皮祖細(xì)胞活力的影響見(jiàn)圖 1。 結(jié)果顯示， 10 μg/m L脂多糖作用內(nèi)皮祖細(xì)胞后，細(xì)胞活力受到明顯的抑制，不同質(zhì)量濃度白花丹參干預(yù)后細(xì)胞活性高于單純損傷組，白花丹參提取物質(zhì)量濃度在 0.8 g/L時(shí)達(dá)到最大效應(yīng)（圖1）。

圖1 內(nèi)皮祖細(xì)胞的活力檢測(cè)Fig.1 Endothelial Progenitor cells viability test

3.2 內(nèi)皮祖細(xì)胞的凋亡檢測(cè) 內(nèi)皮祖細(xì)胞的凋亡通過(guò)流式細(xì)胞儀 AnnexinV-FITC/PI染色法來(lái)檢測(cè)。結(jié)果 如 圖 2， AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)結(jié) 果 表明，沒(méi)有經(jīng)過(guò)處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞只有一小部分細(xì)胞發(fā)生凋亡， 而 10 μg/mL脂多糖與內(nèi)皮祖細(xì)胞孵育12 h 后能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡， 而 0.8 g/L白花丹參處理后能明顯抑制脂多糖引起的細(xì)胞凋亡 （圖2）。

3.3 內(nèi)皮祖細(xì)胞的周期檢測(cè) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同分組處理后內(nèi)皮祖細(xì)胞的 DNA水平揭示了內(nèi)皮祖細(xì)胞周期分布的變化。 如圖 3， 10 μg/m L脂多糖處理細(xì)胞后， G0/G1期細(xì)胞比率較正常對(duì)照組明顯增加， S 期細(xì)胞百分比低于對(duì)照組 （P＜0.01）。因此，脂多糖對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用可能是通過(guò) G0/G1期阻滯來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 與模型組比較， 白花丹參組細(xì)胞 G0/G1期細(xì)胞比率降低， S 期及 G2/M期細(xì)胞比率均增加，0.8 g/L白花丹參處理后，S期細(xì)胞比率與模型組比較有顯著差別，且白花丹參提取物高、 低質(zhì)量濃度藥物組的 G0/G1期與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。 見(jiàn)流式細(xì)胞儀 PI染色 DNA倍體分析結(jié)果 （圖 3A） 及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果 （圖 3B）。

圖 2 流式細(xì)胞儀 AnnexinV-PI雙染檢測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞的凋亡率Fig.2 Flow cytom etry Annexin V-PI double staining detected aPoPtosis of endothelial Progenitor cells

圖3 流式細(xì)胞儀 PI染色不同分組處理后內(nèi)皮祖細(xì)胞的周期分布Fig.3 PI staining flow cytometry detection of different grouPs of endothelial Progenitor cycle distrihution

4 討論

從學(xué)術(shù)角度分析，內(nèi)皮祖細(xì)胞的概念雖然提出僅僅十幾年，但研究進(jìn)展迅速，業(yè)已證明內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管內(nèi)皮系統(tǒng)保護(hù)和損傷修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9-10］。本課題組的前期工作已經(jīng)證明氧化低密度脂蛋白可以損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能，而新近有文獻(xiàn)報(bào)道丹參提取物可以提升外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量［11］。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)丹參對(duì)高膽固醇血癥患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著影響但顯著提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能， 但其機(jī)制尚不清楚［12］。 因此， 丹參對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用，可能部分地與增加了內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量、提高其功能有關(guān)，極有可能亦促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的損傷修復(fù)功能［13］。

丹參中水溶性的活性成分主要為酚酸類(lèi)化合物， Chan 等研究發(fā)現(xiàn)， 在丹參水提物修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)的過(guò)程中，不同類(lèi)型的成分表現(xiàn)出較大差異，水提物的作用效果優(yōu)于丹參素、原兒茶酸等化學(xué)單體［14-15］。 本研究 在前期 研究工作的基礎(chǔ)上，在動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一脂多糖致血管內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷模型上，進(jìn)行拓展性研究，評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素存在下白花丹參對(duì)受損內(nèi)皮祖細(xì)胞的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到泰山白花丹參水提物在 MTT實(shí)驗(yàn)中所獲得的最強(qiáng)藥效濃度下對(duì)脂多糖 （10 μg/mL）誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用而且對(duì)脂多糖造成的細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象有明顯改善作用，為白花丹參發(fā)展為血管保護(hù)藥物提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。由于中藥在使用過(guò)程中多以復(fù)合物而非純品的形式存在，丹參在體內(nèi)可能涉及到多種成分的相互作用，因此多種丹參成分之間的協(xié)同作用機(jī)制在動(dòng)脈粥樣硬化治療過(guò)程中具有更加重要的意義。

［1］ 孫京京， 袁曉晨， 張振剛.載脂蛋白 A1 模擬肽的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用研究進(jìn)展［J］.中華全科醫(yī)學(xué)， 2012， 10（4）： 607-608.

［2］ 王遠(yuǎn)航，李 微.活血化瘀中藥在動(dòng)脈粥樣硬化形成中對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥， 2009， 18（3）：431-432.

［3］ 黃 琛，錢(qián)海凌， 李 麗.中醫(yī)藥保護(hù)動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮功能研究進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2013， 11（1）： 69-71.

［4］ 趙 薇，楊向紅.粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子對(duì)大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞功能活性的影響［J］.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2008， 16（7）： 541-544.

［5］ 姚麗萍，熊 霞.血管內(nèi)皮祖細(xì)胞與血管新生的研究進(jìn)展［J］.西南軍醫(yī)， 2010， 12（6）： 1167-1169.

［6］ 尹 苗，馮成強(qiáng).丹參活性成分抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)理研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志， 2009， 16（7）： 100-102.

［7］ 焦 鵬，常 起，陳 彬， 等.泰山白花丹參提取物對(duì)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、 黏附及分泌 NO的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志， 2011， 26（11）： 2687-2689.

［ 8 ］ 費(fèi)洪榮， 王李梅， 王鳳澤.泰山白首烏醇提物對(duì) HepG2 肝癌細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)節(jié)作用［J］.中國(guó)中藥雜志， 2009，34（21）： 2827-2830.

［9］ 黃 河，湯耀卿.內(nèi)皮祖細(xì)胞在炎癥損傷修復(fù)中的作用和機(jī)制［J］.生命科學(xué)， 2008， 20（2）： 225-230.

［10］ 王亞莉， 賴(lài)應(yīng)龍， 魏蜀亮， 等.心血管支架置入后血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)與再內(nèi)皮化［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)， 2009， 13（9）： 1727-1730.

［11］ 李 爽， 張 凱， 王 佐.內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員的影響因素［J］.生命的化學(xué)， 2011， 31（6）： 779-784.

［12］ 季亢挺， 張懷勤， 唐疾飛， 等.丹參對(duì)高膽固醇血癥患者內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及功能的影響［ J］.中國(guó)中藥雜志， 2007，32（12）： 1214-1217.

［13］ 鄔偉魁， 張海燕， 宋 偉， 等.中藥對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2011， 17（17）： 282-285.

［14］ Chan K， Chui SH， Wong D Y L， et al.Protective effects of Danshensu from the aqueous extract of Salvia miltiorrhiza（ Danshen ） against homocysteine-induced endothelial dysfunction［ J］ .Life Sci， 2004， 75（26） ： 3157-3171.

［15］ Ding M， Ye T X， Zhao G R， et al.Aqueous extract of Salvia miltiorrhiza attenuates increased endothelial permeability induced by tumor necrosis factor-a［ J］ .Int Immunopharmacol，2005， 5（11）： 1641-1651.

Effect of Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extract on cell cycle and aPoPtosis of endothelial Progenitor cells injured by LPS

JIAO Peng， YANG Na-na， TANG Yu-jing， QIN Shu-cun*
（Institute of Arteriosclerosis， Taishan Medical College， Taian 271000， China）

Salviamiltiorrhiza Bunge.f.alba；endothelial progenitor cells； cell cycle； apoptosis； proliferation

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0022-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.006

2013-03-18

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目 （2011-228）； 山東省自然科學(xué)基金 （Z2008C03）； 國(guó)家自然科學(xué)基金 （30971098）； 山東省自然科學(xué)基金 （ZR2012HL18）

焦 鵬 （1979—） ， 女， 講師， 碩士， 研究方向： 細(xì)胞生物學(xué)。 Tel： 13854826934 E-mail： jiaopeng196@163.com

*通信作者：秦樹(shù)存，教授，研究方向：脂質(zhì)代謝與動(dòng)脈粥樣硬化。

ABSTRACT： AIM To explore the effect of Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extracton the cell cycle and apoptosis of endothelial progenitor cells injured by lipopolysaccharide（ LPS）.METHOD The injury to endothelial progenitor cellswas induced by 10 μg/mL LPS and Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extract had been intervening in endothelial progenitor cells.Changes of cellular morphology were detected with microscope.The viability of the cells in each group was examined by MTT method.Flow cytometry Annexin V/PI staining was used for apoptotic changes and PI staining for analysis of the effect of the cell cycle.RESULTS Compared with the control group，LPSdecreased the proliferative activity and increased the rate of cell apoptosis.Flow cytometry PIstaining showed there weremore cells arrested atG0/G1stage and less cells at S stage in LPSdamage group，rather the other way around in Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extract group.CONCLUSION Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extractmay have significant protective effect on the endothelial progenitor cells injured by LPS and related to the protection of normal cell cycle and the decrease in the cell apoptosis.