商陸皂苷甲致肝毒性的研究

周 倩， 姚廣濤， 金若敏， 謝家駿

（上海中醫(yī)藥大學(xué) 藥物安全評價研究中心， 上海 201203）

商陸皂苷甲致肝毒性的研究

周 倩， 姚廣濤*， 金若敏， 謝家駿

（上海中醫(yī)藥大學(xué) 藥物安全評價研究中心， 上海 201203）

目的 通過體外、 體內(nèi)實驗相結(jié)合的方法考察商陸皂苷甲所致的肝毒性。 方法 MTT法測肝細(xì)胞 （ L-02 細(xì)胞）活力； 以不同質(zhì)量濃度的商陸皂苷甲與肝細(xì)胞共培養(yǎng)后， 測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的 AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）、 ALP（堿性磷酸酶） 和 LDH （乳酸脫氫酶） 水平， 并在光鏡下對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察； Hoechst-PI雙標(biāo)染色觀察細(xì)胞的凋亡和壞死情況； 取 KM種小鼠分為正常組和給藥組， 給藥組的小鼠每天尾靜脈注射 10mg/kg商陸皂苷甲， 連續(xù)給藥 7 d， 考察小鼠血清肝功能指標(biāo)和肝組織的病理學(xué)變化。 結(jié)果 MTT的結(jié)果顯示， 商陸皂苷甲能顯著抑制肝細(xì)胞活力， 其 IC50為360.18 μg/mL； 400 μg/mL的商陸皂苷甲能升高細(xì)胞培養(yǎng)上清中的 AST、 ALP和 LDH （ P＜0.01） 并使肝細(xì)胞出現(xiàn)變圓、 減少和死亡的現(xiàn)象； 300 和 350 μg/mL的商陸皂苷甲能使肝細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死； 體內(nèi)實驗表明， 小鼠血清中的AST和 ALT（谷丙轉(zhuǎn)氨酶） 水平均明顯升高 （P＜0.01）， 小鼠肝臟多出現(xiàn)肝細(xì)胞多發(fā)灶性壞死及肝細(xì)胞再生現(xiàn)象。結(jié)論 大劑量的商陸皂苷甲對肝臟具有一定的毒性作用。

商陸皂苷甲；肝毒性；肝細(xì)胞；小鼠

中藥商陸系商陸屬植物商陸 Phytolacca acinosa Roxb.和垂序商陸 Phytolacca americana L.的干燥根， 其味苦、 性寒， 有毒， 歸肺、 腎、 大腸經(jīng)［1］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫和祛痰平喘等作用，主治急慢性腎炎、血小板減少性紫癜、腎水腫、銀屑病和慢性氣管 炎 等［2-3］。商 陸 皂 苷 甲 為 商 陸 的 主 要 成 分 之一［4］，具有顯著的抗炎、 免疫抑制、提高 DNA的合成率等作用［5-6］。 商陸 在臨床應(yīng)用中的不 良反應(yīng)時有報道，但有關(guān)其毒理方面的研究較少，本實驗選用商陸中的主要成分商陸皂苷甲，采用體外與體內(nèi)實驗相結(jié)合的方法，考察其肝毒性。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 L-02 細(xì)胞株 來自上海中科院細(xì)胞庫。

1.2 試劑及材料 商陸皂苷甲 （上海融禾醫(yī)藥科技 發(fā) 展 有 限 公 司， 純 度 ＞98%，批 號 為120417）； DMEM 培 養(yǎng) 基 （ 美 國 Gibco公 司 ） ；MTT（ 美國 Sigma公司）；Hoechst 33342 （ 美 國Sigma公司） ； PI（ 美國 Sigma公 司） ； 胎牛血 清（美國 Hyclone公司） ； 青 霉 素-鏈 霉素抗體 （ 美國 Gibco公 司） ； 胰 蛋白酶 （ 美國 Sigma公 司 ） ；DMSO （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；谷草轉(zhuǎn)氨酶 （AST）、 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （ ALT）、 堿性磷酸酶 （ALP） 和乳酸脫氫酶 （LDH） 均購于日本世諾臨床診斷制品株式會社。

1.3 儀器 全自動酶標(biāo)儀 （BioTek 公司）； 熒光倒置 相 差 顯 微 鏡 （ Olympus公 司）； CO2培 養(yǎng) 箱（Thermo公司）； 日立 7080 全自動血液生化儀 （日本日立貿(mào)易有限公司）。

2 方法

肝細(xì)胞 （L-02 細(xì)胞） 采用的完全培養(yǎng)液為：DMEM培養(yǎng)液 +1%青霉素-鏈霉素抗體 +10%胎牛血清。

2.1 商陸皂苷甲對肝細(xì)胞活力的影響 參考文獻(xiàn)［7］，采用 0.25%胰酶消化處于對數(shù)生長期的肝細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度約為7 ×104個 /mL， 接 種 于 96 孔 板 中 （每 孔 180 μL）。 孵育 24 h 后分別以含 150、 200、 250、300、 350、 400 μg/m L商陸皂苷甲的完全培養(yǎng)液處理細(xì)胞，另設(shè)不加藥的陰性平行對照組，每組平行 4 孔， 置 37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 20 h后每孔避光加入 20 μL MTT溶液， 置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 4 h 后棄上清， 每孔加入200 μLDMSO溶解藍(lán)紫色結(jié)晶， 另設(shè) DMSO調(diào)零孔， 酶標(biāo)板振蕩混勻， 在酶標(biāo)儀 570 nm檢測波長處測定吸光度A，按公式計算細(xì)胞活力，并將給藥組與對照組進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗重復(fù) 3次。公式：細(xì)胞活力%=［（給藥組平均 A-調(diào)零孔 A） ÷（對照組平均 A-調(diào)零孔 A）］ ×100%。

2.2 商陸皂苷甲對肝細(xì)胞上清功能性指標(biāo)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 參考文獻(xiàn)［7］， 采用 0.25%胰酶消化處于對數(shù)生長期的肝細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度約為 18 ×104個/mL， 接種于 24 孔板中（每孔 900 μL）。 孵育 24 h 后分別以含 100、 200、300、400 μg/mL商陸皂苷甲的完全培養(yǎng)液處理細(xì)胞另設(shè)不加藥的陰性平行對照組，每組平行3孔，置37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 藥物作用24 h 后用倒置相差顯微鏡對細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察，立即取細(xì)胞培養(yǎng)上清， 1 200 r/min 離心 5 min， 取上清， 采用全自動血液生化儀對肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的 AST、ALP和 LDH進(jìn)行檢測。

2.3 Hoechst-PI雙標(biāo)染色觀察細(xì)胞的凋亡和壞死情況 同 “2.2” 項對細(xì)胞進(jìn)行處理， 其中商陸皂苷甲 的 給 藥 質(zhì)量濃度設(shè) 為 200、 250、300、350 μg/mL， 給 藥 24 h 后， 加 入 1 mg/m L的 Hoechst33342 （體系中終質(zhì)量濃度為 10 μg/m L）， 37℃避光反應(yīng) 10 min 后加入 1 mg/mL的 PI（ 體系中終質(zhì)量濃度為 10 μg/mL）， 4 ℃ 避 光反應(yīng) 20 min后，立即用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

2.4 商陸皂苷甲對小鼠肝毒性的影響 KM小鼠 20 只 （雌雄各半）， 進(jìn)行隨機(jī)分組， 即分為正常對照組和給藥組。給藥組小鼠每天尾靜脈注射 10 mg/kg的商陸皂苷甲， 連續(xù) 7 d， 正常組尾靜脈注射等容量的生理鹽水，于末次給藥1 h后， 進(jìn)行摘眼球取血， 血漿靜置 30 min 后 3 500 r/min 離心15 min，分離 出 血 清， 全 自 動 血 液 生化儀測 ALT和 AST，另取小鼠肝臟，對其進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。 參考文獻(xiàn)［8］， 進(jìn)行半定量分析：肝組織結(jié)構(gòu)正常，無明顯變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤，記為0分；肝小葉結(jié)構(gòu)尚正常，可見明顯的混濁腫脹、氣球樣變或脂肪變性，散在點狀壞死 （+）， 記為 1 分； 肝小葉結(jié)構(gòu)不清，可見明顯的灶狀壞死，伴有炎癥細(xì)胞浸潤（++）， 記為2 分； 肝小葉結(jié)構(gòu)不清、 可見明顯的片狀壞死，伴有炎癥細(xì)胞浸潤 （+++），記為3分；壞死細(xì)胞彌漫性存在于肝小葉中央，層次較多， 伴有炎癥細(xì)胞浸潤 （++++）， 記為4分。

3 結(jié) 果

3.1 商陸皂苷甲對肝細(xì)胞活力的影響 與對照組相比， 給予 300 ～400 μg/mL商陸皂苷甲 24 h 后，各組的肝細(xì)胞活力均明顯下降，有極顯著性差異（P＜0.01 或 0.05 ），且 呈 劑 量 依 賴 性，IC50為360.18 μg/mL， 見表 1。

表 1 商陸皂苷甲對 L-02 細(xì)胞活力的影響 （， n=4）Tab.1 L-02 cell viability in fluenced by esculentoside A（， n=4）

表 1 商陸皂苷甲對 L-02 細(xì)胞活力的影響 （， n=4）Tab.1 L-02 cell viability in fluenced by esculentoside A（， n=4）

注： 與對照組相比，**P＜0.01，*P＜0.05

組 別 質(zhì)量濃度/（ μg·m L-1） A 細(xì) 胞活 力/%對 照- 0.440 ±0.024 100.00 ±5.45 150 0.405 ±0.048 92.05 ±10.91 200 0.419 ±0.038 95.23 ±8.64商陸皂苷甲 250 0.411 ±0.025 93.41 ±5.68 300 0.385 ±0.009* 87.50 ±2.05*350 0.272 ±0.030** 61.82 ±6.82**400 0.026 ±0.009** 5.91 ±2.05**

3.2 商陸皂苷甲對肝細(xì)胞上清功能性指標(biāo)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 與對照組相比， 400 μg/mL組的肝細(xì)胞上清液中的 AST、 ALP、 LDH水平明顯升高， 有顯著性差異 （P＜0.01）， 見表 2。 正常肝細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞緊密銜接且呈不規(guī)則的多邊形； 400 μg/m L商 陸皂苷甲組的 肝 細(xì) 胞明顯變圓、減少、部分死亡且漂浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞 輪 廓 清 晰， 內(nèi) 可 見 大 量 空 泡 產(chǎn) 生； 300 μg/mL商陸皂苷甲組的肝細(xì)胞內(nèi)可見部分空泡產(chǎn)生； 100 和 200 μg/mL商陸皂苷甲組的肝細(xì)胞形態(tài)無明顯的改變，見圖1。

表 2 商陸 皂苷甲對 L-02 細(xì)胞功能性 指標(biāo)的影響 （，n=3）Tab.2 Contents of AST， ALP， LDH in L-02 cell suPernatant influenced by esculentoside A（， n=3）

表 2 商陸 皂苷甲對 L-02 細(xì)胞功能性 指標(biāo)的影響 （，n=3）Tab.2 Contents of AST， ALP， LDH in L-02 cell suPernatant influenced by esculentoside A（， n=3）

注： 與對照組相比，**P＜0.01

組 別 質(zhì)量濃度/（ μg·mL-1）AST /（IU·L-1）ALP /（IU·L-1）LDH /（IU·L-1）對 照- 3.67 ±0.58 26.00 ±1.00 74.33 ±1.53 100 3.33 ±0.58 25.00 ±0.00 72.33 ±1.15商陸皂苷甲 200 3.33 ±0.58 24.33 ±0.58 71.33 ±1.53 300 4.00 ±0.00 25.67 ±1.15 75.00 ±2.65 400 13.67 ±0.58**31.33 ±1.53**189.00 ±3.46**

圖 1 商陸皂苷甲對 L-02 細(xì)胞形態(tài)的影響 （ ×200）Fig.1 M orPhological changes of L-02 cell influenced by esculen toside A （ ×200）

3.3 Hoechst-PI雙標(biāo)染色觀察細(xì)胞的凋亡和壞死情況 正常對照組肝細(xì)胞數(shù)較多，細(xì)胞多呈淡藍(lán)色，亮藍(lán)色的早期凋亡細(xì)胞和橘紅色的晚期凋亡或壞死細(xì)胞為個別現(xiàn)象； 200 和 250 μg/mL商陸皂苷甲組的肝細(xì)胞未發(fā)生明顯改變；隨著劑量增大，300 μg/mL商陸皂苷甲組的肝細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，凋亡和壞死細(xì)胞逐漸增加； 350 μg/mL商陸皂苷甲組的肝細(xì)胞數(shù)量顯著減少且凋亡和壞死的細(xì)胞明顯增多。見圖2。

圖 2 商陸皂苷甲對 L-02 細(xì)胞形態(tài)的影響 （ ×200）Fig.2 L-02 cell aPoPtosis and necrosis infulenced by esculentoside A（ ×200）

3.4 商陸皂苷甲對小鼠肝毒性的影響 與正常對照組相比， 商陸皂苷甲組小鼠血清中的 ALT和AST水平均出現(xiàn)明顯的升高 （P＜0.01）， 見表 3；光鏡下觀察，與對照組相比商陸皂苷甲組小鼠肝臟多出現(xiàn)肝細(xì)胞多發(fā)灶性壞死及肝細(xì)胞再生 （P＜0.01）， 見表4 及圖 3。

4 討論

商陸皂苷甲是中藥商陸的主要成分與活性成分之一，臨床大量服用商陸可引起消化系統(tǒng)損害，最先出現(xiàn)的不良反應(yīng)是胃腸道癥狀，如惡心嘔吐、食欲減退、腹脹、腹痛、腹瀉，嚴(yán)重者可出現(xiàn)胃腸道糜爛、 潰瘍及出血， 呈現(xiàn)嘔血、 便血等［9］。 在誤服商陸引起的中毒事件中，部分患者出現(xiàn)了肝功能的異常［10-12］ 。

表3 KM小鼠給予商陸皂苷甲7 d后對血清生化指標(biāo)的影響 （， n=10）Tab.3 Serum biochem ical indexes of KM m ice after being given esculentoside A for 7 days（， n=10）

表3 KM小鼠給予商陸皂苷甲7 d后對血清生化指標(biāo)的影響 （， n=10）Tab.3 Serum biochem ical indexes of KM m ice after being given esculentoside A for 7 days（， n=10）

注： 與對照組相比，**P＜0.01

組 別 劑量/（mg·kg-1）ALT/（U·L-1）AST/（U·L-1）正常對照組- 31.38 ±3.08 102.80 ±15.68商陸皂苷甲組 10 360.14 ±287.97**265.21 ±125.02**

表4 KM小鼠給予商陸皂苷甲7 d后對肝病理改變的影響Tab.4 HePatic histoPathology of KM m ice after being given esculen toside A for 7 days

圖 3 商陸皂苷甲對小鼠肝組織病理學(xué)的影響 （ ×200）Fig.3 HePatic histoPathology of KM m ice after being given esculentoside A（ ×200）

體外實驗研究 表 明， 300 ～400 μg/m L商 陸 皂苷甲對肝細(xì)胞活力有明顯的抑制作用，且呈量-效關(guān)系。 400 μg/mL商陸皂苷甲組能顯著升高肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的 AST、 ALP和 LDH水平。 細(xì)胞形態(tài)學(xué)方 面 的影響主要 表 現(xiàn) 為 400 μg/m L商 陸 皂 苷甲組的肝細(xì)胞明顯變圓、減少、部分死亡且漂浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞輪廓清晰，內(nèi)可見大量空泡產(chǎn)生。300 和 350 μg/mL的商陸皂苷甲能使肝細(xì)胞不同程度的發(fā)生凋亡和壞死現(xiàn)象， 且呈現(xiàn)一定的量-效關(guān)系。以上的結(jié)果均表明商陸皂苷甲對肝細(xì)胞具有毒性。

體內(nèi)實驗研究表明， 給 予 10 mg/kg商 陸皂苷甲 7 d 后， KM小鼠血清中的 ALT和 AST水平出現(xiàn)明顯的升高，肝組織出現(xiàn)明顯的病變，顯示大劑量的商陸皂苷甲對肝臟有較強(qiáng)的毒性作用。

商陸皂苷甲在中藥商陸中的量約為 0.4%［4］，其既是有效成分又是毒性成分，本研究提示在大劑量下，商陸皂苷甲對肝臟具有一定的毒性作用，提示在臨床上使用商陸應(yīng)予以注意，特別是對肝功能不良的患者。

［ 1 ］ 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典［S］.2010 年版一部.北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010.

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HePatotoxicity induced by esculentoside A

ZHOU Qian， YAO Guang-tao*， JIN Ruo-min， XIE Jia-jun
（Shanghai University of Traditional ChineseMedicine， Shanghai201203， China）

AIM To explore the hepatotoxicity of esculentoside A from Phytolacca acinosa Roxb.in vitro and in vivo.METHODS MTT assay was used to test the hepatic cells（ L-02 cell） viability.The contents of aspartate aminotransferase（ AST） ， alkaline phosphatase（ ALP）and lactic dehydrogenase（ LDH） in hepatocytes supernatantwere detected after being incubated with the different concentrations of esculentoside A andmorphological changes of hepatocytes were observed by inverted phase contrastmicroscope.Cell apoptosis and necrosis were observed by Hoechst-PI stainingmethod.After 10 mg/kg esculentoside A were given tomice for 7 days through intravenous administration， hepatic function and histopathology inmice was investigated.RESULTS The MTT result showed that esculentoside A could obviously inhibit hepatic cells viability with the IC50of 360.18 μg/mL. 400 μg/mL esculentoside A could increase the levels of AST， ALP， LDH in hepatocytes supernatant（ P＜0.01 ）and cellmorphology showed that 400 μg/mL esculentoside A could damage the shapes of hepatocytes.Three hundred and 350 μg/mL esculentoside A caused cell apoptosis and necrosis.The animal experiment showed that AST and alanine aminotransferase（ALT） in blood serum increased notably（ P＜0.01） .Histopathological examination revealed thatmost ofmice’ s livers had multiple focal necrosis of liver cells and liver regeneration.CONCLUSION Esculentoside A may cause hepatotoxicity.

esculentoside A； hepatotoxicity； hepatocytes； mice

R969

： A

： 1001-1528（2014）01-0014-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.004

2013-02-06

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 （973 計劃） （2009CB522807）； 國家 “十二五” 科技重大專項課題 “中藥安全評價技術(shù)平臺”（2011ZX09301-009）

周 倩 （1988—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 中藥安全性評價。 E-mail： 423384692@qq.com

*通信作者： 姚廣濤， 博士， 副研究員， 碩士生導(dǎo)師， 從事中藥新藥及其安全性評價研究。 Tel： （021） 51322472， E-mail： ygt1969@ yahoo.com.cn