淫羊藿素抗骨肉瘤的機(jī)制探究

劉玉亮， 殷嫦嫦， 張義平， 梁廣勝， 魏強(qiáng)強(qiáng)， 殷 明

（1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨一科， 江西 南昌 330006； 2.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部， 江西 南昌 330006；3.九江學(xué)院醫(yī)學(xué)部分析與檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室， 江西 九江 332000）

淫羊藿素抗骨肉瘤的機(jī)制探究

劉玉亮1，2， 殷嫦嫦3， 張義平3， 梁廣勝1，2， 魏強(qiáng)強(qiáng)1，2， 殷 明1*

（1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨一科， 江西 南昌 330006； 2.南昌大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)部， 江西 南昌 330006；3.九江學(xué)院醫(yī)學(xué)部分析與檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室， 江西 九江 332000）

目的 探討淫羊藿素致 Saos2 細(xì)胞凋亡及抑制其增殖的可能機(jī)制。 方法 采用不同質(zhì)量濃度梯度淫羊藿素作用于人骨肉瘤 Saos2 細(xì)胞及用抗氧化劑預(yù)處理過的骨肉瘤細(xì)胞， 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)； 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同條件下細(xì)胞活性氧的情況及凋亡情況； 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)淫羊藿素對(duì)細(xì)胞增殖遷移的影響； 用終濃度為 100 μmol/L的氯化鈷模擬骨肉瘤的缺氧環(huán)境， RT-PCR檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （VEGF）、 尿激酶型纖溶酶原激活劑受體 （ uPAR）、 基質(zhì)金屬蛋白酶 2 （ MMP2） 、 腎上腺髓質(zhì)素 （ ADM） 、 烯醇酶-1 （ Enolase-1 ） 及醛縮 酶 A （ aldolase A） 基因 表達(dá)的情況。結(jié)果 淫羊藿素作用后的骨肉瘤細(xì)胞活性氧水平較陰性對(duì)照組明顯增高，抗氧化劑預(yù)處理組可降低細(xì)胞活性氧水平且可逆轉(zhuǎn)淫羊藿素的致凋亡作用， 淫羊藿素可下調(diào) VEGF、 uPAR、 MMP2、 ADM、 Enolase-1、 aldolase A基因的表達(dá)。 結(jié)論 淫羊藿素能致骨肉瘤 Saos2 細(xì)胞凋亡可能跟細(xì)胞內(nèi)活性氧的上調(diào)相關(guān)， 增殖抑制可能與 HIF1 下游基因如 VEGF、uPAR、 MMP2、 ADM、 Enolase-1、 aldolase A的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

淫羊藿素； Saos2 細(xì)胞； 增殖抑制； 凋亡

淫羊藿素可以致骨肉瘤 Saos2 細(xì)胞凋亡并能下調(diào) HIF1α的表達(dá)， 凋亡的信號(hào)通常有 兩條通路：由細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)變化導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放入胞質(zhì)及線粒體膜電位的降低激活細(xì)胞凋亡蛋白酶［1］； 一條是由細(xì)胞外死亡配體與死亡受體結(jié)合然后最 終激活 caspase家族［2］。 正 常 情況下細(xì)胞內(nèi)活性氧 （ROS） 的產(chǎn)生和清除處于平衡的狀態(tài)，以保證細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和正常的生理活動(dòng)，腫瘤細(xì)胞由于抗氧化酶低于正常細(xì)胞，所以其細(xì)胞內(nèi)的活性氧處于高水平［3］， 大量學(xué)者研究表明 ROS在上述的兩條凋亡通路上發(fā)揮作用［4］。 抑制腫瘤的增殖主要通過抑制腫瘤血管的新生、抑制腫瘤的糖酵解能力、抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移及免疫逃逸能力等來實(shí)現(xiàn)， 因?yàn)槌Ｑ跸?HIF1α經(jīng)過反應(yīng)被泛素化降解， 所以本實(shí)驗(yàn)用 100μmol/L的氯化鈷模擬低氧環(huán)境來研究 HIF1 的下游 基因的表 達(dá)［5］， 本實(shí)驗(yàn)即探究淫羊藿素在體外致腫瘤凋亡作用與細(xì)胞內(nèi) ROS 水平的關(guān)系， 增殖及轉(zhuǎn)移的抑制與 HIF-1α的下游基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （VEGF）、 尿激酶型纖溶酶原激活劑受體 （uPAR）、 基質(zhì)金屬蛋白酶 2 （MMP2）、 腎上腺髓質(zhì)素 （ADM）、 烯醇酶-1 （ Enolase-1） 及醛縮酶 A （ aldolase A） 表達(dá)的關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑 淫羊藿素 （上海源葉生物科技有限公司， 淡黃色粉末狀， HPLC測(cè)定純度 ＞98%，批號(hào)為20120207）； N-乙酰半胱氨酸、 活性氧檢測(cè)試劑盒 （Sigma）； PCR試劑盒、 胎牛血清 （TRANS）；DMEM/F-12 培養(yǎng)基 （HyClone）； RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （康為世紀(jì)）。二甲基亞砜、胰蛋白酶、 Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、 瓊脂糖、TAE （Solarbio）；CKK-8 細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒 （北京莊盟國際生物基因科技有限公司）。

1.2 主要儀器 臺(tái)式室溫高速離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）； 超低溫冰箱 （Haier）； 手提式不銹鋼壓力蒸氣滅菌器 （上海三申醫(yī)療器械有限公司）；多功能酶標(biāo)儀 （BIO-RAD公司）； 冷凍高速離心機(jī) （珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）； CO2細(xì)胞孵箱 （SIM公司）； 超凈工作臺(tái) （蘇州凈化設(shè)備有限公司）； PCR儀 （杭州博日科技有限公司）； 電泳儀 （美國 伯樂公司）；流式細(xì)胞儀 （BD公司）。 倒置相差顯微鏡（NIKON公司）；凝膠成像系統(tǒng) （SIM公司）。

1.3 細(xì)胞株 人骨肉瘤細(xì)胞株 Saos2 來自本實(shí)驗(yàn)室?guī)齑妗?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞株 Saos2， 分別適量接種于 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)良好， 兩組細(xì)胞以 10 mmol/L的 N-乙酰半胱氨酸 （NAC） 預(yù)處理2 h 后分別加終濃度為20 μmol/L、50 μmol/L淫羊藿素培養(yǎng)基， 另兩組分別直接更換終濃度為 20 μmol/L、 50 μmol/L淫羊藿素培養(yǎng)基， 培養(yǎng) 48 h后， 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)學(xué)變化，評(píng)價(jià) NAC預(yù)處理過的細(xì)胞與直接加淫羊藿素細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況的差別及形態(tài)學(xué)的不同。

2.2 細(xì)胞凋亡流式檢測(cè) 利用 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染料流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè) NAC預(yù)處理對(duì)淫羊藿素致人骨肉瘤 Saos2 細(xì)胞凋亡作用的影響， 24 孔培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)骨肉瘤 Saos2 細(xì)胞， 待其生長(zhǎng)良好， NAC組細(xì)胞以 10 mmol/L的 NAC預(yù)處理 2 h后分別加終濃度為 20 μmol/L、50 μmol/L淫羊藿素培養(yǎng)基， 藥物組分別直接更換終濃度為 20 μmol/L、 50 μmol/L淫羊藿素培養(yǎng)基， 不加任何處理的為陰性對(duì)照， 培養(yǎng) 48 h后， 按凋亡試劑盒操作說明進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。

2.3 細(xì)胞活性氧檢測(cè) 6 孔培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)骨肉瘤 Saos2 細(xì)胞， 待其生長(zhǎng)良好， 藥物組加終濃度為50 μmol/L淫羊藿素培養(yǎng)基分別培養(yǎng) 6、 12、 24 h，NAC組先用 10 mmol/LNAC預(yù)處理細(xì)胞 2 h， 再加入 50 μmol/L淫羊藿素培養(yǎng) 12 h， 不加任何處理的為陰性對(duì)照， 后收集細(xì)胞加含終濃度為 10 μmol/L DCFH-DA的無血清 DMEM， 在 37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育 30 min， 每 3 ～5 min 將細(xì)胞顛倒混勻一下。孵育結(jié)束后， 用冰冷的 PBS 溶液洗滌細(xì)胞 2 次，充分除去未結(jié)合的探針，上機(jī)檢測(cè)。

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 種 6 孔板， 分兩組： 正常組、 氯化鈷 （CoCl2） 組 （100 μmol/L CoCl2+50 μmol/L淫羊藿素）， 待細(xì)胞狀態(tài)良好后， 用 100 μL槍頭在板上輕柔的劃兩條直線， 兩直線距離大于 1 cm， 然后用 PBS 沖洗干凈殘留的細(xì)胞， 然后按分組加上不同的培養(yǎng)基， 然后分別在 6、 12、24 h 拍照。

2.5 RT-PCR檢測(cè) 常規(guī)種板 （6 孔板） ，分 3組： 空白組 （未做 任 何 處 理組）、 氯 化 鈷 組（100 μmol/L CoCl2） 、 陽 性 對(duì) 照 組 （ 100 CoCl2+50 μmol/L淫羊藿素）， 每組設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔。 24 h按照康為世紀(jì) RNA提取和逆轉(zhuǎn)說明書進(jìn)行操作， 以逆轉(zhuǎn)后的 cDNA為模版擴(kuò)增檢測(cè) VEGF、uPAR、 ADM、 Enolase-1、 aldolase A mRNA的 表達(dá)擴(kuò)增后制膠跑電泳拍照， 用 image J軟件分析灰度值。見表1。

表1 各目的基因及內(nèi)參基因的引物序列Tab.1 Prim er sequences of target gene and the con trol gene

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析， 檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 用以 10 mmol/L的NAC預(yù)處理2 h能明顯逆轉(zhuǎn)不同終濃度淫羊藿素所致的 Saos2 細(xì)胞凋亡， 細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減低， 但和陰性對(duì)照組細(xì)胞還是存在細(xì)胞收縮變圓，并且有明顯的凋亡小體存在。 見圖1。

圖 1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 （100 倍）Fig.1 Cellular morPhology observation（ ×100）

3.2 細(xì)胞凋亡流式檢測(cè) Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染料流式細(xì)胞分析技術(shù)：左下象限：正常存活細(xì)胞，左上象限：壞死細(xì)胞，右上象限：早期凋亡細(xì)胞，右下象限：晚期凋亡細(xì)胞。淫羊藿素作用于 Saos2 細(xì)胞及用 NAC預(yù) 處理的細(xì)胞后結(jié)果顯示： 用 NAC預(yù)處理2 h可以逆轉(zhuǎn)淫羊藿素致凋亡作用， 且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）， 但其凋亡率還是顯著高于對(duì)照組，提示淫羊藿素致Saos2 細(xì)胞凋亡作用可能跟淫羊藿素促氧化作用有關(guān)。 見圖2。

圖 2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)淫羊藿素促 Soas2 細(xì)胞凋亡作用及不同狀態(tài)細(xì)胞的百分比柱狀圖Fig.2 APoPtosis effect on Soas2 cells of icaritin

3.3 活性氧檢測(cè)結(jié)果 DCFH-DA可穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞， 經(jīng)胞內(nèi)的酯酶水解作用轉(zhuǎn)化生成 DCFH在活性氧作用下，DCFH被氧化成發(fā)熒光的 DCF。 細(xì)胞內(nèi) ROS的水平與 DCF的熒光強(qiáng)度成正比。 同對(duì)照組比較， Saos2 細(xì)胞經(jīng) 50 μmol/L淫羊藿素作用后可導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增加， 表明細(xì)胞內(nèi)的 ROS在增加。 隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)胞內(nèi) ROS水平逐漸增高并在 12 h 達(dá)到峰值， 而后 ROS 水平逐漸回落但至 24 h 胞內(nèi) DCF熒光強(qiáng)度仍然顯著高于對(duì)照組水平。6、 12、24 h 后細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強(qiáng)度分別為57.5% （P＜0.05）、124.9% （P＜0.05）、 64.6%（P＜0.05）， 增多的 ROS 可以被抗氧化劑 NAC所阻斷。 見圖3。

3.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示： 陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，有明顯的向遠(yuǎn)處生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的趨勢(shì)，劃痕處有明顯的細(xì)胞存在，而加藥組生長(zhǎng)明顯受到抑制，細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組明顯減少，劃痕處無細(xì)胞出現(xiàn)且細(xì)胞凋亡明顯， 說明淫羊藿素有阻抑 Saos2 細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的作用。 見圖4。

3.5 RT-PCR結(jié)果 各組處理 24 h 后結(jié)果： 與 A組相比， CoCl2組的 VEGF、 uPAR、 MMP2、 ADM、Enolase-1 表 達(dá) 水 平 均 升 高， 差 別 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（ P＜0.05） ， 而 aldolase A表達(dá)水 平差異 無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）； 與 CoCl2組相比， CoCl2+淫羊藿組 VEGF、 MMP2、 ADM、 Enolase-1 的表達(dá)明顯降低， 差 別 均 有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （ P＜0.05）， 而uPAR、 aldolase A的表達(dá)與 CoCl2組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明用 CoCl2模擬缺氧可以使 Saos2 高表達(dá) VEGF、 uPAR、 MMP2、 ADM、 Enolase-1 基因，而對(duì) aldolase A無明顯影響， 而淫羊藿素可以降低在 Saos2 在缺氧環(huán)境下 VEGF、 MMP2、 ADM、 Enolase-1 基因的表達(dá)， 而對(duì) uPAR、 aldolase A無明顯影響。 見圖5。

4 討論

圖 3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)淫羊藿素對(duì)細(xì)胞內(nèi) ROS水平的影響Fig.3 Effect on intracellular ROS level of icaritin

圖 4 劃痕實(shí)驗(yàn) （100 倍）Fig.4 Scratch tests（ ×100）

活性氧主要包括超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等，正常情況下細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于平衡的狀態(tài)，以保證細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和正常的生理活動(dòng)［6］。 腫瘤細(xì)胞由于超氧化物歧化酶 （ SOD）、 過氧化氫酶 （CAT） 等抗氧化酶低于正常細(xì)胞， 所以其細(xì)胞內(nèi)的活性氧處于高水平［7］。 降低 ROS 水平可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，ROS水平增高在細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中也同樣發(fā)揮著重要作用［8］。 有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn) ROS 致凋亡可能和 Fas受體途徑相似， 因?yàn)榭寡鮿┛梢宰枰?Fas受體途徑誘導(dǎo)的凋亡， 并且 ROS 和 Fas受體和配體的基因表達(dá)密切相關(guān)［9-10］。 ROS 通過線粒體途徑致凋亡主要是由于使線粒體 Ca2+的超載， 然后線粒體膜電位降低致線粒體膜通透性增加最終導(dǎo)致細(xì)胞色素c從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)激活 Caspase家族， 另外線粒體 Ca2+的超載可以反作用使 ROS 水平升高［11］。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)過多的 ROS 高表達(dá) Bcl家族的促凋亡基因 Bax是線粒體膜通透性增加從而導(dǎo)致細(xì)胞色素 c釋放激活 Caspase家族導(dǎo)致凋亡［12］， 本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)淫羊藿素致能使 Saos2 細(xì)胞內(nèi) ROS 量增高致細(xì)胞凋亡， 淫羊藿素的致 Saos細(xì)胞凋亡作用能被 NAC逆轉(zhuǎn)， 說明淫羊藿素致 Saos細(xì)胞凋亡跟高表達(dá)其細(xì)胞內(nèi) ROS水平相關(guān)。

圖 5 淫 羊 藿 素 對(duì) Soas2 細(xì) 胞 VEGF、 uPAR、MM P2、 ADM、 Enolase-1 及 aldolase A基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of icaritin on VEGF， uPAR， MMP2，ADM， Enolase-1 and aldolase A exPression in Saos2

腫瘤的增殖跟諸多基因相關(guān)［13］， 如向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基因、在缺氧條件下利用營(yíng)養(yǎng)的基因及血管新生的基因等：向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移主要通過分泌周圍基質(zhì)消化的酶如 uPAR、 MMP2 等， 從而消化周圍的機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移；大量研究表明腫瘤細(xì)胞利用能量主要通過糖酵解來完成，因此高表達(dá)與糖酵解相關(guān)的酶如 ADM、Enolase-1 等在腫瘤增殖過程中發(fā)揮著重要作用；血管的新生跟很多生長(zhǎng)因子如 PDGF、 VEGF等基因相關(guān)， 此類基因可以促進(jìn)血管的形成。上述各基因都受 HIF1 轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)在前期研究中發(fā)現(xiàn)淫羊藿素在基因水平上下調(diào) HIF1α， HIF在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮作用需要低氧環(huán)境抑制 HIF1α的降解， 因?yàn)?HIF1α在常氧情況下可以被脯氨酸羥化酶羥化，羥化后被泛素化降解，因此本實(shí)驗(yàn)在研究與增殖抑制相關(guān)基因即HIF1 的下游基因時(shí)用氯化鈷來模擬腫瘤細(xì)胞的相對(duì)缺氧環(huán)境，結(jié)果證實(shí)氯化鈷組高表達(dá)了上述基因，說明缺氧環(huán)境模擬成功。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淫羊藿素可以下調(diào)細(xì)胞增殖遷移相關(guān)基因 VEGF、uPAR的表達(dá)， 且能降低 Saos2 糖酵解相關(guān)基因如 ADM、Enolase-1 的表達(dá)， 從而影響了腫瘤細(xì)胞血管的新生、降解細(xì)胞外基質(zhì)、在缺氧環(huán)境下利用營(yíng)養(yǎng)的能力，從而影響腫瘤的增殖轉(zhuǎn)移的能力。

淫羊藿素致 Saos細(xì)胞凋亡跟高表達(dá)其細(xì)胞內(nèi)ROS水平相關(guān)， 增殖轉(zhuǎn)移的抑制作用應(yīng)更進(jìn)一步的分子水平的研究，用相關(guān)技術(shù)如沉默相關(guān)基因觀察細(xì)胞的生物學(xué)性狀的變化，進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)基因與增殖抑制的關(guān)系。

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M echanism of anti-osteosarcoma of icaritin

LIU Yu-liang1，2， YIN Chang-chang3， ZHANG Yi-ping3， LIANG Guang-sheng1，2， WEIQiang-qiang1，2，YIN Ming1*
（1.The Second Hospital Affiliated to Nanchang University， Nanchang 330006， China； 2 Graduate School of Medicine， Nanchang University， Nanchang 330006， China； 3 Analysisand Test Laboratory of Jiujiang University， Jiujiang 332000， China）

AIM To investigate the inhibitory proliferation of icaritin and its induction of apoptosis on Saos2 cells.METHODS Saos2 cells and their pretreated cellswith antioxidantwere incubated with different concentrations of icaritin， and then the change of the cellmorphologywas observed by the invertedmicroscope.Flow cytometry instrumentwas used for the detection of reactive oxygen species（ ROS） and apoptosis ratio of the cells.The scratch test for cellmigration and proliferation， under the hypoxic condition simulated by cobalt dichloride（100 μmol/L） for analog of anoxic environment of osteosarcomat， and RT-PCR for measurement of VEGF， uPAR，MMP-2， ADM， Enolase-1 and aldolase A gene expression in cells were performed.RESULTS Icaritin can increase the ROS of Saos2 as compared with the control group， antioxidant pretreatment antagonized apoptosis ratio and relative gene expression.CONCLUSION Icaritin-inducing Saos2 apoptosismay be associated with upregulation of intracellular reactive oxygen，and Icaritin's proliferation inhibition is related to down-regulation of HIF1 downstream genes such as VEGF， uPAR， MMP2， ADM， Enolase-1 and aldolase A expression.

icaritin； Saos2 cells； proliferation inhibition； apoptosis

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0004-06

,ebook=10

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.002

2013-05-19

劉玉亮 （1987—） ， 男， 碩士生， 研究方向： 中藥抗骨腫瘤。 Tel： 18653844696， E-mail： 283401832@qq.com

*通信作者： 殷 明 （1958—）， 男， 碩士生導(dǎo)師， 研究方向： 端粒酶基因阻抑椎間盤退變。 Tel：（0791）86298917