乙醇沉淀法對頭花蓼水提物活性成分和抗氧化活性的影響研究

龔金炎， 陳麗春， 張 蕾， 葛 青， 毛建衛(wèi)， 黃 俊， 劉士旺， 王永江

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院， 浙江 杭州 310023； 2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 杭州 310023； 3.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院， 浙江 杭州 310029； 4.紹興市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測院， 浙江 紹興 312000）

乙醇沉淀法對頭花蓼水提物活性成分和抗氧化活性的影響研究

龔金炎1，2，3，4， 陳麗春1，2， 張 蕾1，2， 葛 青1，2， 毛建衛(wèi)1，2， 黃 俊1，2， 劉士旺1，2， 王永江1，2

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院， 浙江 杭州 310023； 2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 杭州 310023； 3.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院， 浙江 杭州 310029； 4.紹興市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測院， 浙江 紹興 312000）

目的 研究乙醇沉淀法對頭花蓼水提物活性成分和抗氧化活性的影響。 方法 70%乙醇醇沉后， 分別采用分光光度法測定總黃酮、 總酚和 HPLC法測定沒食子酸的量， 采用 DPPH和 ABTS 法測定抗氧化活性。 結(jié)果 醇沉后， 頭花蓼活性成分富集明顯，抗氧化活性明顯增強(qiáng)。結(jié)論 醇沉有助于頭花蓼活性成分富集和抗氧化活性的提升。

頭花蓼；醇沉；總黃酮；總酚酸；抗氧化性

頭花蓼為蓼科植物頭花蓼 Polygonum capitatum Buch—Han.ex D.Don 的干燥全草或地上部分， 主要分布在貴州、云南、四川、江西、湖南、湖北等地，為著名的貴州苗藥之一［1］。 民間常用頭花蓼治療泌尿系統(tǒng)感染、 血尿、濕疹、腎盂腎炎、膀胱炎、尿路結(jié)石、風(fēng)濕痛、瘡瘍、腹瀉、 痢疾等癥， 對泌尿系統(tǒng)有獨(dú)特療效［2］。 以頭花蓼為主要原料的熱淋清膠囊、熱淋清顆粒在臨床上用于治療泌尿系統(tǒng)感染， 分別被 《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》 中藥成方制劑第十二冊及2010 年版 《中國藥典》 收載。 熱淋清膠囊、熱淋清顆粒以頭花蓼水提物作為主要原料，因此，在臨床中每天的服藥量較大。大量文獻(xiàn)表明沒食子酸為頭花蓼及其制劑的主要有效成分之一［3-4］， 抗菌消炎、 抗氧效果顯著［5］， 目前作為熱淋清顆粒的定量監(jiān)控指標(biāo)［6］。 水提醇沉法是中藥制劑生產(chǎn)中常用的提取精制方法，能除去蛋白質(zhì)、 多糖、 鞣質(zhì)等雜質(zhì)， 富集有效成分［7］。 目前已成為中藥制劑生產(chǎn)中的通用工藝［8］。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 頭花蓼水提物 （浙江天昊藥業(yè)有限公司提供批號(hào) 20100802）； 蘆丁對照品 （中國藥品生物制品檢定所， 純度≥95%）； 沒食子酸對照品 （中國藥品生物制品檢定所， 純度≥99%）； ABTS 試劑 （東京仁成工業(yè)株式會(huì)社）； DPPH試劑 （梯希愛 （上海） 化成工業(yè)發(fā)展有限公司）； 色譜級(jí)甲醇 （天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）； 色譜級(jí)乙腈 （西班牙薩勞 Scharlau 有限公司）； 純凈水 （杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；無水乙醇，亞硝酸鈉， 硝酸鋁， 過硫酸鉀，氫氧化鈉均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備 可見分光光度計(jì) （721G）， 上海精科儀器有限公司； 微型漩渦混合儀 （ XW-80A）， 上海滬西分析儀器廠有限公司； 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 （ GZX-9070MBE），上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠； BS124S 電子天平， 賽多科斯科學(xué)儀器 （北京） 有限公司； 高效液相色譜， 美國Waters公司， 美國 Waters2695， 配置 PDA 2996 檢測器。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 原料預(yù)處理 頭花蓼棕褐色水提物粉末 50 g， 溶解于900 mL水中， 加入 2.1 L無水乙醇， 常溫下醇沉 48 h，4 000 r/min 離心 30min［9］； 上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀， 真空冷凍干燥， 得到頭花蓼水提乙醇溶解物 16.05 g； 將下層沉淀放置在蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上去除乙醇，冷凍干燥后，得到頭花蓼水提乙醇沉淀物 27.37 g。

2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與總黃酮的測定 準(zhǔn)確稱取干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁對照品 15.0 mg， 甲醇溶解并定容至100 mL， 配成 0.15 mg/mL的蘆丁對照溶液。 取 0、 0.5、1.0、 2.0、 3.0 和4.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液， 加入30%乙醇溶液至5 mL， 加入 5%亞硝酸鈉溶液 0.3 mL， 混勻后放置 5 min，加入 10%硝酸鋁溶液 0.3 mL， 混勻后放置 6 min， 加入1.0mol/L氫氧化鈉溶液 4mL， 用 30%乙醇定容至 10mL，放置 10 min， 以零管為空白， 搖勻后用 1cm的比色杯， 在510 nm的波長處測定吸光度， 以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 y=0.010 2x+0.005 8；r2=0.999 4。

分別準(zhǔn)確稱取 3 種提取物各 100 mg， 30%乙醇溶解并定容至 100 mL， 取 1 mL的待測液， 按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣的總黃酮的量。

2.3 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與總酚的測定 準(zhǔn)確稱取經(jīng)干燥至恒重的沒食子酸對照品15.4mg， 30%乙醇溶液溶解并定容至 100 mL， 配成 0.150 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。 取 0.05、0.10、 0.15、 0.20、 0.25 和 0.30 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液， 用水稀釋至 5.0mL， 各加入 0.5 mL未稀釋的福林試劑， 混勻后靜置 8 min， 加入 1.50 m L 20%Na2CO3水溶液， 室溫暗處靜置 2 h， 以零管為空白， 用 1 cm的比色皿在 765 nm的波長處測定吸光度，以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo) 繪 制 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線。 y=0.136 3x+0.214 7， r2= 0.999 5。

分別準(zhǔn)確稱取 3 種提取物各 100 mg， 30%乙醇溶解并定容至 100mL， 取 0.1 mL的測試樣品， 按標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣的總酚的量。

2.4 沒食子酸檢測的色譜條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 色譜柱為 Luna C18柱 （250 mm×4.60 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相為乙腈-1%乙酸 （5 ∶95）； 體積流量 1.0 mL/min； 柱溫 25 ℃；檢測波長 272 nm； 進(jìn)樣量 10μL； 在此條件下沒食子酸與其他組分能達(dá)到基線分離，如圖1所示。

圖1 頭花寥中沒食子酸色譜圖

精密稱取沒食子酸 100.8 mg， 用甲醇溶解并定容至100 mL， 搖 勻， 即 得 沒 食 子 酸 對 照 品 貯 備 液（1.008mg/mL）。 分別精密量取上述對照品貯備液， 以甲醇為溶劑， 配制成沒食子酸質(zhì)量濃度分別為 1.008、 2.016、4.032、 8.064、 10.08、 20.16、 40.32、 60.48， 80.64 和201.6 μg/mL的溶液。 用高效液相色譜進(jìn)行測定， 分別平行進(jìn)樣 3 次。 沒食子酸在 0.010 08 ～2.016 μg與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系， 回歸方程為 y=32 778x+8 800， r2= 0.999 9。

2.5 抗氧化活性的測定

2.5.1 ABTS 法［10］取 176 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液和 10mL 7 mmol/L ABTS 貯備液混合， 在室溫條件下避光儲(chǔ)備 12 ～16 h。 用無水乙醇將 ABTS+溶液稀釋至吸光度值為 0.700 ±0.02 （734 nm）， 將 3.9 mL的 ABTS+溶液與0.1 mL待測液 溶 液 混 合 搖 勻， 在室溫下 反 應(yīng) 6 min， 在734 nm波長下測定吸光值， 以 50%的甲醇為空白對照。 以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。 根據(jù)下列公式計(jì)算每種待測樣品對 ABTS自由基的清除率： 抑制率（%） =（A空白-A樣品） /A空白×100%

2.5.2 DPPH法［11］準(zhǔn)確稱取 DPPH試劑 20 mg， 用無水乙醇溶解至 500mL量瓶中， 搖勻得 0.101mmol/L的 DPPH溶液。 取待測樣溶液 0.1 mL和 3.9 mL DPPH溶液混合搖勻， 在室溫下反應(yīng) 1 h， 在 517 nm波長下測定吸光度， 以50%的甲醇為空白對照。 根據(jù)下列公式計(jì)算每種待測樣品對 DPPH自 由 基 的 清 除 率： 抑 制 率 （%） = （A空白-A樣品） /A空白×100%

3 結(jié)果分析

3.1 醇沉前后總黃酮、 總酚和沒食子酸的變化 如表 1 所示，醇沉后，無論是總黃酮、總酚還是沒食子酸的量都升高， 其中沒食子酸的量上升明顯， 升高了 156%。

表1 醇沉前后總黃酮、總酚和沒食子酸的變化

3.2 抗氧化活性 ABTS 法測定結(jié)果 由圖 2 可知， 在相同質(zhì)量濃度時(shí)， 頭花蓼水提乙醇溶解物對 ABTS 自由基的清除能力最強(qiáng)，頭花蓼水提物其次。在試驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，三者的抑制率均隨質(zhì)量濃度的升高而增大，頭花蓼醇沉后， 清除 ABTS 自由基的活性明顯增強(qiáng)。

圖2 醇沉前后樣品對 ABTS自由基的清除作用

3.3 抗氧化活性 DPPH法測定結(jié)果 由圖 3 可知， 在相同質(zhì)量濃度時(shí)， 頭花蓼水提乙醇溶解物對 DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，頭花蓼水提物其次。在試驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，三者的抑制率均隨質(zhì)量濃度的升高而增大，頭花蓼醇沉后， 清除 DPPH自由基的活性明顯增強(qiáng)。

圖3 乙醇沉淀前后樣品對 DPPH自由基的清除作用

4 討論

本實(shí)驗(yàn)研究了醇沉對頭花蓼水提物的活性成分和抗氧化活性的影響，通過測定總黃酮、總酚和沒食子酸的量來判斷醇沉對頭花蓼活性成分的影響， 通過測定 ABTS 和 DPPH自由基的清除能力， 來判斷醇沉對頭花蓼抗氧化活性的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明醇沉對頭花蓼水提物的活性成分和抗氧化活性均有較大程度的提高，其中頭花蓼及其制劑中的主要活性成分沒食子酸的量上升最為明顯， 提高了 156%。熱淋清膠囊、熱淋清顆粒以頭花蓼水提物作為主要原料。在臨床中，每天的服藥量較大。因此，采用水提后醇沉的方法能有效地除去頭花蓼水提物中蛋白質(zhì)、多糖、鞣質(zhì)等雜質(zhì)［12-13］， 富集沒食子酸等有效成分， 達(dá)到減量不減效的目標(biāo)。

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R284.1

： B

： 1001-1528（2014）05-1072-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.044

2013-04-12

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （31240054）； 國家十二五科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目 （2011BAD23B02）； 浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （Q13C200006）； 浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目 （2013R415015）； 浙江省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目 （2011R09028-12）

龔金炎 （1982—） ， 男， 博士， 副教授， 研究方向： 天然產(chǎn)物與功能性食品的研究與開發(fā)。 E-mail： gongjinyan1982@163.com