當歸腹痛寧滴丸中藁本內(nèi)酯的測定及大鼠體內(nèi)的藥動學

張海勝， 喬 華， 常 威， 張曉云， 邵婷璣， 薛 虎， 趙云峰

（1.渭源縣蓮峰中心衛(wèi)生院， 甘肅 定西 748208； 2.蘭州大學第一醫(yī)院藥物臨床試驗機構， 甘肅 蘭州730000；3.蘭州大學藥學院， 甘肅 蘭州 730000）

當歸腹痛寧滴丸中藁本內(nèi)酯的測定及大鼠體內(nèi)的藥動學

張海勝1， 喬 華2， 常 威2， 張曉云3， 邵婷璣3， 薛 虎3， 趙云峰3

（1.渭源縣蓮峰中心衛(wèi)生院， 甘肅 定西 748208； 2.蘭州大學第一醫(yī)院藥物臨床試驗機構， 甘肅 蘭州730000；3.蘭州大學藥學院， 甘肅 蘭州 730000）

目的 了解市售當歸腹痛寧滴丸中藁本內(nèi)酯的量及口服后藁本內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的藥動學。方法 用氣相色譜法測定當歸腹痛寧滴丸中藁本內(nèi)酯的量， SD大鼠灌胃給藥， 在設定的時間點采血0.3 mL， 離心分離血漿， HPLC法測定藁本內(nèi)酯的血藥濃度，計算藥動學參數(shù)，與藁本內(nèi)酯靜脈注射給藥比較，對其在大鼠體內(nèi)的藥動學特征進行評價。結果 當歸腹痛寧滴丸中藁本內(nèi)酯的量為 0.19mg/粒。 當歸腹痛寧滴丸灌胃給藥后， 藁本內(nèi)酯 25mg/kg組， 其 Cmax為 （620.395 ±47.69） μg/L， Tmax0.08 h， AUC（0-∞）（709.346 ±77.775） μg/L·h，t1/2z（4.331 ±1.278） h； 12.5 mg/kg組 Cmax為（173.902 ±13.654） μg/L， Tmax0.08 h， AUC（0-∞）（365.003 ±72.813） μg/L·h，t1/2z（2.236 ±0.188） h； 靜脈注射藁本內(nèi)酯 25mg/kg后 Cmax（ 675.965 ±41.968 ） μg/L， Tmax0.08 h， AUC（0-∞）（ 949.501 ±63.182） μg/L·h，t1/2z（ 3.085 ± 0.137） h； 靜脈注射 12.5mg/kg時 Cmax（391.402 ±25.251） μg/L， Tmax0.08 h， AUC（0-∞）（391.078 ±26.609） μg/L·h，t1/2z（2.985 ±0.241） h。 結論 當歸腹痛寧滴丸口服， 其有效成分藁本內(nèi)酯胃腸道吸收迅速， 生物利用度高， 給藥后藥時曲線呈雙吸收峰，可能與滴丸中藁本內(nèi)酯釋放特征有關。

當歸腹痛寧滴丸；藁本內(nèi)酯；藥動學

當歸腹痛寧滴丸是以當歸揮發(fā)油為主要原料制成的滴丸劑，具有解痙止痛的功效。主要用于婦女痛經(jīng)，產(chǎn)后宮縮痛，感染性腹瀉引起的急性腹痛，小兒秋季腹瀉等的治療。 藁本內(nèi)酯為其主要有效成分之一［1-2］。 研究表明： 藁本內(nèi)酯有很強的解痙、平喘、鎮(zhèn)定作用，臨床上可用于治療支氣管炎和婦科疾?。?-5］。 研 究 顯 示［6］， 藁 本 內(nèi) 酯 具 有 良好的改善微循環(huán)作用，可用于防治與微循環(huán)障礙有關的疾病， 對大鼠腦缺血有顯著保護作用［7］。 藁本內(nèi)酯對癌細胞L1210， K562 具有很強抑制作用， 其 IC50分別為 （2.27 ± 0.10）、 （ 4.78 ±0.18） μmol/L， 可用于 腫 瘤 的輔助治療［8］。 此 外， 藁 本 內(nèi) 酯 還 可 以 抑 制 平 滑 肌 增 殖［9］、 抑菌［10-11］、 松弛 平 滑 肌， 可 用 于 治 療 眼 睛 疲 勞 以 及 皮 膚 抗皺［12］。 基于以上藥理學基礎， 為了了解市售當歸婦痛寧滴丸中藁本內(nèi)酯的量，并了解其口服給藥后的藥動學特征，本實驗以大鼠為研究對象，進行當歸腹痛寧滴丸口服給藥后藁本內(nèi)酯的藥動學研究。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑 當歸腹痛寧滴丸 （蘭州和盛堂制藥有限公司， 國藥準字 Z62020027）； 藁本內(nèi)酯對照品 （川芎揮發(fā)油經(jīng)分離純化， 純度 97.26%）； 鬼臼毒素 （北京醫(yī)科大學應用藥物研究所）； 氯苯那敏 （河南九勢制藥股份有限公司）； 甲醇， 乙腈 （色譜純， 山東禹王實業(yè)有限公司）； 二氯甲烷 （色譜純， 天津市凱信化學有限公司）， 石油醚（分析純， 利安隆博華醫(yī)藥化學有限公司）； 乙酸乙酯 （分析純， 利安隆博華醫(yī)藥化學有限公司）； 肝素鈉 （上海中秦化學試劑有限公司），純水自制。

1.2 實驗動物 SD大鼠， 雌雄各半， 體質量 180 ～220 g，購自 蘭 州 大 學 動 物 中 心， 合 格 證 號： SCXK （ 甘 ）2009-0004。

1.3 實驗儀 器 Agilent 7890A氣 相 色 譜 儀 （ 氫 火 焰 檢 測器， 16 位自動 進 樣器， 美國） ； Agilent1200 高效 液 相 色 譜系統(tǒng) （G1311A四元泵， G1329A自動進樣器， G1321A熒光檢測器， G1316A柱溫箱， 德國）； DT224-S 電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）； H2050R臺式高速冷凍離心機 （ 長沙湘儀離心機有限公司）； HGC-24A氮吹儀（天津恒奧有限責任公司）。

2 實驗方法

2.1 當歸腹痛寧滴丸中藁本內(nèi)酯的測定

2.1.1 溶液配制

2.1.1.1 內(nèi)標溶液的配制 精密稱取 5.0 mg撲爾敏于5 mL量瓶中， 甲醇溶解并稀釋至刻度， 得 1.0 mg/mL的撲爾敏溶液。 精密吸取 2 mL， 置 10 mL量瓶中， 甲醇稀釋至刻度， 得 0.2 mg/mL的撲爾敏內(nèi)標溶液。

2.1.1.2 藁本內(nèi)酯標準系列溶液的配制及處理 精密稱取藁本內(nèi)酯對照品 （含藁本內(nèi)酯 97.26%） 適量， 甲醇溶解并稀釋得 0.8、 0.6、 0.4、 0.3、 0.2、 0.1、 0.04、 0.02 mg/mL的藁本內(nèi)酯標準系列溶液， -40 ℃儲存?zhèn)溆谩?分別吸取上述系列標 準 溶 液 100 μL于 1.5 mL的 離 心 管 中， 各加0.2 mg/mL撲爾敏溶液100 μL， 渦旋30 s， 10 800 r/min 離心5 min， 進樣。

2.1.1.3 當歸腹痛寧滴丸溶液的配制及處理 取當歸腹痛寧滴丸10 粒， 精密稱重， 每粒滴丸的平均質量為0.056 1 g。精密稱取 0.112 3 g（相當于兩粒滴丸） 于 10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度， 得到 11.2 mg/mL的滴丸溶液。取該溶液 100 μL于 1.5mL離心管， 加0.2mg/mL的撲爾敏內(nèi)標溶液 100 μL， 混 勻， 離 心 （10 800 r/min） 5 min 后進樣。

2.1.2 氣相色譜分離條件及方法特異性 Agilent7890A氣相色譜儀， 采用 HP-5 石英毛細管色譜柱 （30 m×320 μm ×0.25 μm）， 以氮氣為載氣， 載氣體積流量 4 mL/min， 分流比 30 ∶1， 柱溫采用程序升溫， 升溫程序為 100 ℃保持2 min后， 以 5 ℃ /min 的速度升高至 240 ℃， 并保持 2min。進樣量為 1 μL， 采集時間為 13.33 m in。 取 “2.1.1.2” 項及 “2.1.1.3” 項 溶液 進 樣 分 析， 得 藁 本 內(nèi) 酯 （8.198 m in） 、 撲爾敏 （10.175 min） 氣相色譜圖。 見圖 1 ～3。

圖1 空白氣相色譜圖

圖 2 藁本內(nèi)酯 （8.198m in） ， 撲爾敏 （10.175m in） 氣相色譜圖

圖3 當歸腹痛寧滴丸及內(nèi)標撲爾敏氣相色譜圖

2.1.3 標準曲線的制備及線性 取 “2.1.1.2” 項配制的系列溶液， 按 “2.1.2” 項色譜條件進樣分析， 以藁本內(nèi)酯與撲爾敏色譜峰面積比對溶液質量濃度線性回歸，得藁本內(nèi)酯標 準 曲 線 方 程 C=0.093 9SGBNZ/IS+0.011 4 （ r2= 0.997 8）， 線性范圍 0.02 ～0.8 mg/mL。

2.1.4 當歸腹痛寧滴丸中藁本內(nèi)酯的測定 取 “2.1.1.3”項下配制的樣品溶液， 按 “2.1.2” 項色譜條件進樣分析，平行測試兩次， 將面積比代入 “2.1.3” 項標準曲線方程，計算藁本內(nèi)酯的量，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計算得每粒滴丸中藁本內(nèi)酯的量為 0.19 mg藁本內(nèi)酯 （0.34%）。

2.2 當歸腹痛寧滴丸中藁本內(nèi)酯的藥動學

2.2.1 標準溶 液的制 備 精密稱取藁 本 內(nèi)酯對照品10.0 mg（含藁本內(nèi)酯 97.26%， 實稱 10.2 mg）， 置 10 mL量瓶中， 加乙腈并稀釋， 定容至刻度， 得 1 mg/mL藁本內(nèi)酯貯備液， -40 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?臨用時以乙腈稀釋配制成質量濃度為 0.009 7、 0.019 5、 0.039、 0.078、 0.156、0.313、 0.625、 1.25、 2.5、 4.0、 5.0、 10、 20、 40 μg/mL的藁本內(nèi)酯標準系列溶液。

精密稱取鬼臼毒素5.0mg， 置5mL量瓶中， 乙腈溶解并定容， 制成 1 mg/mL的鬼臼毒素溶液。 臨用前， 加乙腈稀釋成 10 μg/mL的鬼臼毒素內(nèi)標溶液。

精密稱取藁本內(nèi)酯 25.4 mg， 置 5 m L量瓶中， 加注射用磷脂 25 mg， 無水乙醇 200 μL， 渦旋混勻， 用生理鹽水稀釋至刻度， 搖勻制得 5 mg/mL藁本內(nèi)酯乳劑， 供大鼠口服及靜脈注射。

精密稱取當歸腹痛寧滴丸粉末 1.46 g（相當于滴丸26 粒）， 加生理鹽水混合均勻， 轉移至 5 mL量瓶中， 渦旋混勻得 0.5 g/mL的滴丸混懸液 （供低劑量組大鼠灌胃給藥）。 另取2.19 g的滴丸粉末， 同法配制0.73 g/mL的滴丸混懸液 （供高劑量組大鼠灌胃給藥）。

2.2.2 藁本內(nèi)酯血藥濃度測定的色譜條件 采用 YMC-pack ODS-A （150mm×4.6mm， 5 μL） 色譜柱， 流動相乙腈-水 （1 ∶1）， 體積流量為 1.0mL/min， 柱溫 50 ℃， 用熒光檢測器。 0 ～4 min， Ex為 290 nm， Em為 395 nm， 在4 ～14 min， Ex為 336 nm， Em為 453 nm。 進樣量 50 μL。

2.2.3 方法專屬性 取大鼠空白血漿 100 μL， 置 1.5 mL離心管中，加鬼臼毒素內(nèi)標溶液及藁本內(nèi)酯標準溶液各25 μL， 渦旋混勻， 加二氯甲烷 1 mL， NaCl少許， 渦旋提取 5min， 10 800 r/min 離心 5min， 取二氯甲烷層， 氮氣吹干， 殘渣用 100 μL流動相溶解， 按 “2.2.2” 項色譜條件進樣 50 μL。 得藁本內(nèi)酯及內(nèi)標加空白血漿的色譜圖， 見圖 4。 鬼臼毒素的保留時間約為 3.3 min， 藁本內(nèi)酯的保留時間約為 12.4 min， 同法處理用藥后采集的血漿樣品， 進樣分析，從中可以看出，藁本內(nèi)酯及內(nèi)標和內(nèi)源性雜質之間無干擾。

圖4 高效液相色譜圖

2.2.4 標準曲線的制備及線性 取 “2.2.1” 項配制的標準系列溶液， 按 “2.2.3” 項方法處理并進樣測定， 以藁本內(nèi)酯的血藥濃度為橫坐標，藁本內(nèi)酯與鬼臼毒素的色譜峰面積比為縱坐標進行線性回歸計算，得兩條標準曲線方程：Y= 133.49X-14.27 （r=0.999 5， 線性范圍為 2.44 ～156 ng/mL），Y=145.61X+13.76 （r=0.999 6， 線性范圍為 0.156 ～10 μg/mL， 藁本內(nèi)酯血藥濃度與色譜峰面積比在各自的范圍之內(nèi)線性關系良好。

2.2.5 精密度和回收率試驗 按 “2.2.3” 項方法配制質量濃度為 4.88、 39、 156、 1 250、 5 000 ng/mL的藁本內(nèi)酯大鼠血漿樣品并按該方法處理，進樣分析，一日內(nèi)連續(xù)進樣5 次， 連續(xù)測定 3 日， 計算日內(nèi)及日間 RSD。 結果見表1。將藁本內(nèi)酯與鬼臼毒素峰面積比代入標準曲線方程， 計算藁本內(nèi)酯血藥濃度，與配制濃度比較計算方法回收率（表1）。 結果顯示該方法的精密度和準確度符合定量測定的要求。

表 1 測定方法的精密度和回收率 （n=5）

2.2.6 動物實驗 取 SD大鼠 24 只， 體質量 180 ～220 g之間， 雌雄各半， 購買后適應性飼養(yǎng) 48 h， 實驗前禁食 12 h，期間自行飲水。 將 SD大鼠隨機分為4組， 每組 6只， 分別為藁本內(nèi)酯靜脈注射組 （25、 12.5 mg/kg）， 當歸腹痛寧滴丸 25 mg/kg劑量組及 12.5 mg/kg劑量組。 取 “2.2.1” 項下配制的藁本內(nèi)酯乳劑，靜脈注射組依大鼠體重尾靜脈注射給予適當?shù)乃幜?。當歸腹痛寧滴丸組則灌胃給予適當體積的滴丸混 懸液， 并于靜 脈 注 射及灌胃后 5 min、 15 min、30 min、 45 min、 1 h、 2 h、 3 h、 5 h、 8 h、 12 h、 24 h 眼眶采血 0.3mL， 肝素抗凝， 離心分離血漿， -40 ℃低溫保存?zhèn)錅y。

2.2.7 血藥濃度的測定及藥時曲線 取 “2.2.5” 項采集的血漿 100 μL， 加 內(nèi)標 25 μL， 乙腈 25 μL， 混勻， 按“2.2.3” 項方法處理， “2.2.2” 項色譜條件進樣分析， 測定血藥濃度， 繪制藥時曲線，見圖5。

2.2.8 主要藥動學參數(shù) 對上述血藥濃度時間數(shù)據(jù)， 經(jīng)DAS2.1 統(tǒng)計分析， 得主要藥動學參數(shù)， 見表 2。

3 討論

3.1 藁本內(nèi)酯具有苯肽結構， 很不穩(wěn)定， 易發(fā)生脫氫、 氧化、 水解等多種異構化或降解反應［13］， 藥品在儲存過程中成分含有量逐漸降低，影響藥效，因此，實驗對當歸腹痛寧滴丸中藁本內(nèi)酯的量進行了考察。

表2 主要藥動學參數(shù)

圖5 血藥濃度 -時間曲線圖

3.2 在藁本內(nèi)酯血藥濃度分析的過程中， 為了提高測試的靈敏度，本實驗針對藁本內(nèi)酯具有脂溶性，熒光較強的特點，采用二氯甲烷提取，熒光檢測器檢測的方法進行血藥濃度分析， 僅用 0.1mL血漿， 定量下限達 2.44 ng/mL。

3.3 從藥時曲線可以看出， 藁本內(nèi)酯靜注后在體內(nèi)的分布符合二室模型，其血藥濃度迅速達到峰值并快速向周圍組織分布形成分布項，其消除項血藥濃度降低相對較慢。當歸腹痛寧滴丸灌胃給藥后，其吸收也很迅速，并很快達到峰值，這可能與藁本內(nèi)酯具有較高的脂溶性，其中速釋部分釋放后迅速吸收有關。同靜脈注射相比，滴丸口服給藥后存在雙吸收峰，這可能與滴丸中部分藁本內(nèi)酯后續(xù)緩慢釋放有關。經(jīng)計算，當歸腹痛寧滴丸口服后在大鼠體內(nèi)的生物利用度約為 74.7% ～93.3%。

［1］ 嚴 輝，段金廒，錢大瑋， 等.我國不同產(chǎn)地當歸藥材質量的分析評價［J］.中草藥， 2009， 40（12）： 1988-1992.

［ 2 ］ 王麗君， 丁明堂.當歸腹寧滴丸治療痛經(jīng)臨床觀察［J］.甘肅醫(yī)藥， 1995， 14（5）： 300.

［3］ 閆 升，喬國芳，劉志峰.當歸油對大鼠離體子宮平滑肌收縮功能的影響［J］.中草藥， 2000， 31（8）： 604-606.

［4］ 朱 潔，榮祖元.藁本內(nèi)酯對雌性幼鼠生殖系統(tǒng)的影響［J］.中國藥理學會通訊， 2001， 18（3）： 40-41.

［5］ 陶靜儀，阮于平，梅其炳， 等.當歸成分藁本內(nèi)酯平喘作用的實驗研究［ J］ .藥學學報， 1984， 19（8） ： 561-565.

［6］ 石力夫， 鄭曉梅， 蔡 溱， 等.藁本內(nèi)酯分解前后川芎揮發(fā)油對兔球結膜微循環(huán)影響的比較［J］.中國藥理學與毒理學雜志， 1995， 9（2）： 157-158.

［ 7 ］ Peng H Y， Du JR， Zhang GY， etal.Neuropreotective effect of z-ligustilide against permanent ischemic damage in rats［ J］. Biol Pharm Bull.2007， 30（2） ： 309-312.

［ 8 ］ Chen Q C， Lee J， Jin W， et al.Cytotoxic constituents from Angelicae sinensis Radix［J］ .Arch Pharm Res， 2007， 30（ 5）：565.

［ 9 ］ 盧 群， 羅少洪.藁本內(nèi)酯調(diào)控 MAPK信號通路的血管平滑肌細胞增生 ［ J］.廣東藥學院學 報， 2010， 26 （6）：632-634.

［10］ Chou S C， Evermgam M C， Sturtz B G， et al.Antibacterial activity of components from Lomatium californicum［ J］ .Phytother Res， 2006， 20（2）： 153.

［11］ Sim Y， Shin S.Combinatorialanti-trichophyton effects of Ligusticum chuanxiong essential oil components with antibiotics［ J］. Arch Pharm Res， 2008， 31（4）： 497.

［12］ 左愛華， 王 莉， 肖紅斌.藁本內(nèi)酯藥理學和藥代動力學研究進展［J］.中國中藥雜志， 37（ 22）： 3350-3353.

［13］ 李桂生， 馬成俊， 李香玉， 等.藁本內(nèi)酯的穩(wěn)定性研究及異構化產(chǎn)物的 GC-MC分析［ J］.中草藥， 2000， 31 （6）：405-406.

R969.1

： B

： 1001-1528（2014）05-1068-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.043

2013-03-15

張海勝 （1978—） ， 男， 主管藥師， 主要從事中藥研究及調(diào)劑。 E-mail： qhbrian@163.com