三白草酮及衍生物的溶解性和保肝活性研究

徐春蕾， 薛 平， 吳玉蘭， 張 芳， 李 祥*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 南京 210023； 2.常州藥品檢驗(yàn)所， 江蘇 常州 213003）

三白草酮及衍生物的溶解性和保肝活性研究

徐春蕾1， 薛 平2， 吳玉蘭1， 張 芳1， 李 祥1*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 南京 210023； 2.常州藥品檢驗(yàn)所， 江蘇 常州 213003）

目的 考察三白草酮及衍生物的溶解性和保肝活性。 方法 采用 HPLC測(cè)定三白草酮及衍生物在常用溶劑中的溶解度和正辛醇-水/緩沖液體系中的表觀脂水分配系數(shù) （P）； 采用 CCl4小鼠肝損傷模型考察其保肝活性。 結(jié)果25 ℃時(shí)三白草酮及衍生物 A、 B、 C在水中的溶解度分別為 （0.161 ±0.007）， （12.4 ±0.57）， （0.145 ±0.006），（0.667 ±0.031） mg/L； 在正辛醇 /水中的 lgP分別為 （3.32 ±0.13）， （2.63 ±0.08）， （3.28 ±0.08）， （2.76 ±0.09）；衍生物A的保肝降酶活性較三白草酮有所提高，衍生物B與三白草酮相當(dāng)，衍生物C有肝損傷作用。結(jié)論 衍生物A的 lgP比三白草酮降低較多， 可能會(huì)通過改善體內(nèi)吸收提高藥效； 衍生物 C的 lgP雖有下降， 但三白草酮中一個(gè)次甲二氧基被破壞，顯示出肝損傷作用。

三白草酮； 衍生物； 溶解度； 脂水分配系數(shù)； HPLC； 保肝活性

三白草酮 （ sauchinone） 是從中藥三白草 Sau- rurus chinensis中分離得到的木脂素類化合物［1］， 其含有量高達(dá) 0.4%。 研究表明三白草酮具有保肝活性［2-6］， 但藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其在 體內(nèi)的 吸收差， 且消除很快［7］。 初步研究表明三白草酮的水溶性和脂溶性都很差，又因?yàn)橛嗔韬绲葮?gòu)建的活性更強(qiáng)的3 個(gè)五味子素衍生物都有次甲二氧基和羥基［8］， 可見在具有次甲二氧基的基礎(chǔ)上再引入羥基很可能會(huì)增強(qiáng)藥物保肝活性，引入羥基還可能增加水溶性，改善化合物的脂水分配。因此，為了考察三白草酮中羥基及次甲二氧基對(duì)活性的影響，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)三白草酮結(jié)構(gòu)修飾得衍生物 A、 B、 C， 本研究測(cè)定三白草酮及衍生物 （圖 1） 的平衡溶解度、 表觀脂水分配系數(shù)，并結(jié)合保肝活性，推測(cè)化合物結(jié)構(gòu)和溶解性的改變對(duì)藥效的影響。

圖1 三白草酮及衍生物 A、 B、 C結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of sauchinone， derivative A， B and C

1 儀器、試藥與動(dòng)物

Agilent1200 高效液相色譜儀，G1315D型 DAD檢測(cè)器， Agilent1200 色 譜 工 作 站； SZ-1 型 快 速 混勻器 （江蘇金壇市全城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）； Anke TGL-16C高速離心 機(jī) （ 上海 安 亭 科學(xué)儀器廠）；Thermomixer Compact恒溫混勻器 （ 德國(guó) Eppendorf公司）； PHS-25 型 pH 計(jì) （ 上 海 雷 磁 儀 器 廠）；AEL-40SM電子分析天平 （ 日本 SHIMADZU公司，精確到 0.01 mg）； 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 （海門 Boyang公司）。

三白草酮及衍生物 A、 B、 C（自制， 純度＞98.0%， 經(jīng)1H-NMR、13C-NMR確定結(jié)構(gòu)， HPLC測(cè)定純度）。 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （ALT） 測(cè)定試劑盒 （南京建成生物工程研究所， 批號(hào) 20120921）； 谷草轉(zhuǎn)氨酶 （AST） 測(cè)定試劑盒 （南京建成生物工程研究所， 批號(hào) 20120920）； 甲醇為色譜純 （江蘇漢邦科技有限公司， 批號(hào) 110738）； 水為重蒸水； 其余試劑均為分析純。

昆明種小鼠， 清潔級(jí)，初始體質(zhì)量 18 ～20 g，雄性，上海斯萊克動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào) 2007000541228。

2 方法與結(jié)果

2.1 平衡溶解度及脂水分配系數(shù)的測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Agilent HC-C18色譜柱 （4.6 mm ×250 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相甲醇-水 （85 ∶15）； 體積流量 1.0 mL/min； 取各化合物最大吸收波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)， 240 nm （三白草酮），300 nm （ A），300 nm （B）， 230 nm （C）；柱溫 25 ℃。三白草酮及衍生物 A、 B、 C的保留時(shí)間分別為 6.111、5.268、 7.896、 5.329 min。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取三白草酮及衍生物 A、 B、 C各 2.00 mg， 置 2 mL量瓶中， 加適量甲醇溶解并稀釋， 配成質(zhì)量濃度為 1 g/L的貯備液， 采用逐級(jí)稀釋法配成 100、 80、 60、 40、 20、10、 5、 1、0.5 mg/L不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取三白草酮及衍生物 A、 B、 C標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL， 注入液相色譜儀， 按 “2.1.1” 項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以各化合物的質(zhì)量濃度（mg/L） 為橫坐標(biāo)， 峰面積為縱坐標(biāo)，得其線性回歸方程分別為 Y=27.84X-8.31 （r2=0.999 7），Y=16.26X-4.19 （r2=0.999 5）， Y=14.57X-1.35 （r2=0.999 5 ）， Y=31.44X+3.95 （ r2= 0.999 4）。 結(jié)果表明，三白草酮及各 衍生物在0.5 ～100 mg/L間質(zhì)量濃度和峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 精密度考察 分別取質(zhì)量濃度為 20 mg/L的三白草酮及衍生物 A、 B、 C的對(duì)照品溶液， 按“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6 次， 每次 20 μL，記錄峰面積。 結(jié)果三白草酮及 A、 B、 C峰面積的RSD分別為 0.91%、 0.72%、 0.97% 和 0.63%，表明儀器的精密度良好。

2.1.4 準(zhǔn)確度考察 精密吸取 20 mg/L的三白草酮甲醇溶液 1 mL， 分別加入 16、 20、 24 mg/L的三白草酮對(duì)照品溶液 1 mL， 每個(gè)質(zhì)量濃度平行 3份， 搖勻，按 “2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣 20 μL，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的三白草酮的平均加樣回收率為100.36%， RSD為 1.86%； 同法測(cè) 定衍生物 A、B、 C的平均加樣回收率分別為 99.56%、 99.94%和 100.44%， RSD 分 別 為 2.21%、 2.65%和 2.72%。

2.1.5 在常用溶劑和不同 pH緩沖液中平衡溶解度考察 分別取過量的三白草酮及衍生物 A、 B、C， 置 2 mL具塞試管中， 分別加入 1.0 mL水、甲醇、乙醇、正丁醇、正辛醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醚、石油醚，平行3份。超聲溶解10 min （使成飽和溶液） 后， 于 25 ℃下恒溫混勻器中， 300 r/min 振蕩 6 h， 離 心 （ 12 000 r/min，10 min）， 各吸取上清飽和液， 除水溶液經(jīng)適當(dāng)濃縮后吸取 20 μL， 其余溶液均經(jīng)適當(dāng)稀釋后吸取10 μL，注入液相色譜儀， 記錄峰面積， 以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算三白草酮及各衍生物在各溶劑中的溶解度，見表1。

表 1 三白草酮及各衍生物在不同溶劑中的平衡溶解度 （n=3）Tab.1 Solubility of sauchinone and its derivatives in different solvents（ n=3）

由表1可見三白草酮及各衍生物在極性較大和較小的溶劑中溶解度較小，而在中等極性溶劑中溶解度較大，在水中溶解度較低， 但A、C在水中的溶解度較三白草酮已有明顯改善，A尤為明顯。

按藥典方法配制 pH為 6.86 的磷酸鹽緩沖液，分別以 0.1 mol/L NaOH和 2%H3PO4調(diào)節(jié)一系列pH 為 2.26、 4.00、 5.20、6.86、 7.40、 8.70、11.87 的磷酸鹽緩沖液。分別取適量緩沖液置2 mL具塞試管中，加入過量的三白草酮及各衍生物，平行 3 份， 超聲溶解 10 min （使成飽和溶液）后，于 25 ℃下恒溫混勻器中， 300 r/min 振蕩 6 h， 離心 （12 000 r/min， 10 min）， 各吸取上清飽和液，經(jīng)適當(dāng)濃縮后吸取20 μL， 注入液相色譜儀， 記錄峰面積。 三白草酮及衍生物 A、 B、 C在不同 pH緩沖液中的溶解度見表2。

表 2 三白草酮及各衍生物在不同 pH的緩沖液中的溶解度（n=3）Tab.2 Solubility of sauchinone and its derivatives in different pH bu ffers（n=3）

由表2可見，三白草酮及各衍生物溶解度隨pH值的增大而略有降低， 推測(cè)是由于分子中氧原子在酸性溶液中被質(zhì)子化而加大了它們的溶解度。

2.1.6 正辛醇 /水系統(tǒng) 中表觀 分配系數(shù)測(cè)定 P［9-11］

取三白草酮及各衍生物適量，溶于水飽和的正辛醇中， 使成飽和狀態(tài)， 靜置后離心 （12 000 r/min，10 min）， 精密吸取上清液 0.2 mL置 2 m L具塞試管中， 分別加入正辛醇飽和的水及一系列不同 pH的磷酸鹽緩沖液各 1.5 mL， 平行 3 份。于 25 ℃下恒溫混勻器中， 300 r/min 振蕩 6 h， 靜置 0.5 h，分別吸取正辛醇相和水相，正辛醇相經(jīng)適當(dāng)稀釋后吸取10 μL，水相經(jīng)適當(dāng)濃縮后吸取 20 μL， 注入液相色譜儀，記錄峰面積。按照下列公式計(jì)算三白草酮及各衍生物的表觀脂水分配系數(shù)。

上式中， P為表觀脂水分配系數(shù)， Cx為分配平衡時(shí)藥物在正辛醇相濃度， Cw為分配平衡時(shí)藥物在水相中的濃度， Vx為正辛醇相的體積， Vw為水相的體積。 得 25 ℃下三白草酮及衍生物 A、 B、 C在正 辛 醇 /水 中 的 lg P 分 別 為 （ 3.32 ±0.13 ），（2.63 ±0.08）， （3.28 ±0.08）， （2.76 ±0.09）。三白草酮及各衍生物在正辛醇 /緩沖液中的 lg P與pH的關(guān)系見圖 2。

由圖 2 可見三白草酮及各衍生物的 lgP隨著水相 pH的升高略有增加。 衍生物 A、 C的脂水分配系數(shù)比三白草酮減小很多，表明衍生物A、C在水相中的分配較三白草酮提高不少。

圖2 三白草酮及各衍生物在不同 pH緩沖液中的表觀分配系數(shù) （n=3）Fig.2 Partition coefficients for the n-octanol-buffer solution system s of sauchinone and its derivatives（ n=3）

2.2 保肝活性研究

2.2.1 四氯化碳肝損傷模型的建立及給藥 取小鼠 120 只， 隨機(jī)分為 12 組， 即 正常組、模型組、三白草酮組、衍生物的高、中、低劑量組，每組10只。 適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后， 除正常組和模型組給予相同體積的 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃外， 三白草酮組給予 50 mg/kg的 三白草酮灌 胃 給藥， 其他三白草酮衍生物 A、 B、 C各組分別給予 10、20、 50 mg/kg灌胃 給 藥， 1 日 1 次 ， 連 續(xù) 7 d。 末次給藥1 h后， 除正常組給予等體積的花生油外，其他各組小鼠腹腔注射 0.1%的四氯化碳花生油10 mL/kg，隨即禁 食 不 禁 水， 間 隔 16 h 后， 眼 眶靜脈取血， 血 樣 于 37 ℃ 水 浴 放 置 30 min 后， 于3 500 r/min離 心 10 min， 分 離 血 清 ， -20 ℃ 保 存待測(cè)。

2.2.2 血清 ALT、 AST檢測(cè) 按試劑盒操作說明檢測(cè)。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果用表示， 組間差異比較采用獨(dú)立樣本 t-test分析， 計(jì)算 P值。

2.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表 3 可見， A、 B的 ALT和AST值隨著藥物劑量的增加而降低， 表明兩者對(duì)CCl4形成的肝損傷有保護(hù)作用， 且保護(hù)作用隨著劑量的增大而加強(qiáng)，三白草酮衍生物A的保肝降酶效果比三白草酮好，而三白草酮衍生物B與三白草酮相當(dāng)。三白草酮衍生物C無保肝降酶作用，反而使 ALT、 AST值升高。

3 討論

本研究采用 HPLC法考察三白草酮及衍生物A、 B、C的平衡溶解度和脂水分配系數(shù)；采用CCl4肝損傷小鼠模型考察它們的保肝活性。 結(jié)果表明，三白草酮衍生物A、C較三白草酮在低極性溶劑中的溶解度提高較多，三白草酮衍生物A的提高尤為明顯；藥效學(xué)研究表明三白草酮衍生物A的保肝效果較三白草酮有所改善，說明改善化合物的脂水分配確實(shí)能提高藥效，三白草酮衍生物C中一個(gè)次甲二氧基被破壞，已顯示出肝損傷作用。

表 3 三白草酮及衍生物對(duì)血清 ALT和 AST的影響 （n= 10）Tab.3 Effect of sauchinone and its derivatives on the levels of ALT and AST（n=10）

體外測(cè)定脂水分配系數(shù)是為了模擬生物體內(nèi)藥物在水相和生物相之間的分配情況。 正辛醇-水和正辛醇-緩沖液分配系數(shù)在預(yù)測(cè)藥物吸收上具有重要意義［12］。 Lipinski規(guī)則指出， 如果一個(gè)藥物分子具有好的吸收和穿透 特 性， lg P應(yīng) 小于 5［13-14］， 又有研究表明［15］， lg P介于 0 ～3 的化合物可以口服給藥且在腸道中較易被吸收，三白草酮衍生物A、C的 lg P值均小于 3， B的 lg P值與三白草酮相當(dāng)，說明羥基的存在能提高水溶性，改善脂水分配。藥效學(xué)研究表明A的降酶效果比三白草酮提高不少，這可能是A的脂水分配改善后體內(nèi)的吸收得到提高，所以提高了藥效。但C已顯示出肝損傷作用，有文獻(xiàn)報(bào)道［8］次甲二氧基為保肝活性基團(tuán)， 可見在結(jié)構(gòu)修飾改善水溶性時(shí)不能破壞次甲二氧基。

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Solubility and hepatoprotective effect of sauchinone and its derivatives

XU Chun-lei1， XUE Ping2， WU Yu-lan1， ZHANG Fang1， LIXiang1*
（1.College of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China； 2.Changzhou Institute for Drug Control， Changzhou 213003， China）

sauchinone； derivative； solubility； oil/water partition coefficient； HPLC； hepatoprotective effect

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）05-0960-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.017

2013-08-14

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目 （81102899）； 江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目 （12KJB360006）； 南京中醫(yī)藥大學(xué)校青年自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （11XZR11）

徐春蕾 （1978—） ， 女， 講師， 博士， 研究方向： 天然藥物化學(xué)。 Tel： 13915967347， E-mail： xcl127@163.com

*通信作者： 李 祥 （1953—） ， 女， 教授， 博士， 研究方向： 天然藥物化學(xué)。 Tel： 13913925677， E-mail： lixiang_8182@163.com