雷公藤內酯醇對 C57BL/6 小鼠亞慢性毒性作用的研究

吳 娜， 劉星雨， 王篤軍， 羅 盼， 吳 瑤， 魏 淵

（江蘇大學藥學院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

雷公藤內酯醇對 C57BL/6 小鼠亞慢性毒性作用的研究

吳 娜， 劉星雨， 王篤軍， 羅 盼， 吳 瑤， 魏 淵*

（江蘇大學藥學院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

目的 探討長期應用雷公藤內酯醇對 C57BL/6 小鼠全身主要組織功能的毒性和生化指標的影響。 方法 8 周齡C57BL/6 小鼠 30 只， 隨機分為 3 組。 分別腹腔注射雷公藤內酯醇連續(xù) 30 d。 觀察小鼠體質量變化。 采用 ELISA法檢測血清中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶和尿素氮水平并檢測肝組織勻漿中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶，還原型谷胱甘肽和腎組織勻漿中還原型谷胱甘肽水平； 求臟器指數(shù)； 病理組織切片 H&E染色法觀察 C57BL/6 小鼠肝臟、 腎、 胃、 肺、 睪丸、 脾、 十二指腸等組織。 結果 與正常對照組比較， 雷公藤內酯醇組小鼠28 d 時體質量增長明顯降低； 雷公藤內酯醇高劑量組血清中的尿素氮有較顯著上升，肝組織和腎組織中的還原型谷胱甘肽水平都出現(xiàn)降低并有顯著性差異；雷公藤內酯醇組小鼠睪丸臟器指數(shù)都降低，而高劑量組小鼠脾臟臟器指數(shù)出現(xiàn)上升，其他臟器指數(shù)無顯著性差異；觀察病理組織切片發(fā)現(xiàn) C57BL/6 小鼠低劑量組與高劑量組小鼠腎、 脾臟、 睪丸均有明顯損傷， 高劑量組損傷更嚴重。結論 長期應用雷公藤內酯醇對 C57BL/6 小鼠全身主要組織功能有一定的影響， 尤其對小鼠腎、 脾臟和睪丸功能有較強的毒性作用。

雷公藤內酯醇； C57BL/6 小鼠； 亞慢性毒性

雷公藤 Tripterygium wilfordii Hook.f.為衛(wèi)矛科一年生藤本植物，廣泛分布于我國長江以南各省區(qū)及西南各地。雷公藤作為中醫(yī)臨床常用藥物，應用十分廣泛。近年來研究發(fā)現(xiàn)雷公藤對器官移植的排斥反應、自身免疫性疾病、腎病綜合征、癌癥等方面療效顯 著［1-2］。 雷 公 藤 內酯 醇 （ triptolide） 是從雷公藤中分離出的活性最高的環(huán)氧化二萜內酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一，其相關效價比雷公藤總苷高 100 ～200 倍［3］。 藥理和臨床試驗表明 其 具 有 抗 腫 瘤、 免 疫 抑 制、 抗 炎［4］及 抗 生育［5］等生物活性。此外， 耶魯大學 Crews研究組于2007 年在 《美國科學院院刊 （PNAS）》 上報道了雷公藤內酯醇能明顯減少小鼠多囊腎 （PKD） 胞囊的形成［6］， 為治療這一導致腎衰竭的重要疾病提供了新的思路。 明尼蘇達大學 Antonoff等在 2009年報道雷公藤內酯醇可降低胰腺癌細胞中的 HSP70水平，進而減少小鼠體內的腫瘤細胞，可以有效治療胰腺癌［7］。

隨著雷公藤內酯醇臨床應用的推廣，它的毒副作用也引起人們普遍關注，其不良反應主要發(fā)生在消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨髓及血液系統(tǒng)，此外還可引起水腫、血糖升高、復視等［8］。 小鼠動物模型是研究雷公藤內酯醇體內毒性的良好工具， 劉良等［9］采用昆明種小鼠進行亞慢性中毒實驗，發(fā)現(xiàn)長期應用雷公藤內酯醇能引起小鼠腎損傷及睪丸萎縮。然而雷公藤內酯醇對小鼠其他重要組織器官的亞慢性毒性作用影響目前仍不十分明確，因此急需對此進行更系統(tǒng)的研究。昆明種小鼠是我國生產(chǎn)量、使用量最大的遠交群小鼠，被廣泛應用于藥理學、毒理學等領域的研究，但存在基因雜合率高， 遺傳背景復雜的問 題［10］，在毒理學研究方面存在一定的局限性，這就為后續(xù)的研究帶來了障礙。為解決這一問題，本實驗選用C57BL/6 小鼠這一標準近交品系， 對雷公藤內酯醇亞慢性毒性作用進行了初步的研究，以期得到精度更高，可比性更好，應激反應更為均一的實驗數(shù)據(jù)，為更深入地研究雷公藤內酯醇的臨床毒性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 雷公藤內酯醇 （純度大于 99%）購買于 Chroma Dex。 谷丙轉氨酶 （alanine transaminase， ALT） 、 谷草轉氨酶 （ aspartate transaminase，AST）、尿素氮 （blood urea nitrogen，BUN） 和還原型谷胱甘肽 （ glutathione，GSH） ELISA檢 測試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所。 BCA蛋白濃度試劑盒購買于碧云天生物技術研究所。其余為國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)的分析純或生化級試劑。

1.2 藥品的配制 精密稱取雷公藤內酯醇充分溶解于吐溫 80， 再以氯化鈉注射液稀釋至所需劑量，吐溫 80 在終溶液中比例不超過 1% （V/V）， 4 ℃冰箱保存。

1.3 實驗動物 本實驗應用的 C57BL/6 小鼠， 均購買于南京大學模式動物研究所，合格證號：SCXK （蘇） 2010-0001， 體質量 18 ～22 g（20 ± 2 g）， 雄性， 8 周大小。 購買后在實驗室適應性飼養(yǎng)一周后用于正式實驗， 室溫 22 ～25 ℃， 相對濕度 65%， 12 h 明暗交替照明， 自由進食、 飲水。

將實驗動物完全隨機分為3個實驗組，每組10只， 分別設為正常對照組， 低劑量組和高劑量組。 給藥期限為 30 d， 給藥方式為每 48 h 腹腔注射 1 次， 雷公藤內酯醇小鼠腹腔注射的 LD50為0.86 mg/kg［11］， 本實驗采用正常臨床給藥劑量依次設為： 正常對照組， 用氯化鈉注射液與吐溫80按同樣比例混和作溶劑對照，按體質量給予相當量的溶劑對照液； 低劑量組， 按 100 μg/kg腹腔注射雷公藤內酯醇溶液； 高劑量組， 按 200 μg/kg腹腔注射雷公藤內酯醇溶液。每次給藥前稱定質量，末次給藥后， 隔天禁食12 h， 用二氧化碳窒息法處死小鼠。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 小鼠體質量變化觀察 分別于給藥前、 給藥 7、 14、 21、 28 d 時稱量動物體質量， 稱體質量前動物均禁食 12 h。

1.4.2 血清生化指標的測定 實驗結束后， 將 3組小鼠以二氧化碳窒息法處死。心臟取血，室溫血液自 然 凝 固 2 h， 離 心 20 min （ 3 000 r/min）收集上清， 放于 -80 ℃保存直至分析。 測定血清ALT、 AST及 BUN， 分別用于了解肝功能及腎功能。

1.4.3 組織中的生化指標的測定 處死后的小鼠， 取其各臟器稱定質量后， 將肝臟 （3/4） 腎（1/2） 凍于 -80 ℃冰箱中待用。 準確稱取肝組織的質量，按質量體積比加9倍的生理鹽水制成10%的勻漿，3 500 r/min離心 10 min， 取上清待測。 測定肝組織中的 ALT、 AST及 GSH值進一步了解肝功能。

1.4.4 臟器指數(shù)的測定 實驗結束后， 稱取所有動物的體質量，并將心臟、肝臟、脾臟、肺、腎及雙側睪丸稱定質量，求臟器指數(shù)。觀察藥物對各臟器的影響，進行初步的毒性判斷。

1.4.5 病理組織切片觀察 實驗結束后， 將各組織器官剔除脂肪組織及筋膜后稱定質量，取肝臟、腎、胃、肺、睪丸、脾、十二指腸等器官，隨即放入裝有10%中性福爾馬林固定液的標本瓶中浸泡固定， 48 h后作病理組織學檢查， 常規(guī)取材， 脫水， 石蠟包埋， 制片 （5 μm厚）， H&E染色， 光鏡觀察各個器官組織形態(tài)學變化及黏膜、黏膜下間質形態(tài)學的改變。

2 結果

2.1 雷公藤內酯醇給藥組 C57BL/6 小鼠體質量增長變緩 雷公藤內酯醇腹腔注射 C57BL/6 小鼠 7 d時所有動物體質量均較給藥前上升，增加的幅度與正常對照組基本接近或稍低。實驗進行到 14 d時各組動物體質量出現(xiàn)了明顯不同的變化。低劑量組及高劑量組小鼠體質量仍表現(xiàn)為一定程度的增加，但增加的幅度較正常對照組有較大程度的減緩。而實驗進行到21 d時， 高劑量組所有小鼠體質量與溶劑對照組小鼠相比，體質量增長幅度明顯下降，平均體質量降至接近給藥前。 實驗進行到28 d時，低劑量組和高劑量組小鼠所有體質量增長幅度與溶劑對照組相比均明顯下降，個別小鼠體質量甚至降至低于給藥前的水平， 結果見圖1。除體質量的變化外，給藥后的小鼠外觀未觀察到明顯的毒性表現(xiàn)。

2.2 雷公藤內酯醇給藥對 C57BL/6 小鼠血清中生化指標的影響 雷公藤內酯醇給藥對 C57BL/6 小鼠血清肝功能指標 ALT， AST和腎臟功能指標BUN的影響見表1。 低劑量組及高劑量組與正常對照組相比， 血清中的 ALT、AST值沒有顯著性差異； 而高劑量組血清中的 BUN有較顯著上升， 增長 34.5% （P＜0.05）， 說明高劑量雷公藤內酯醇給藥30 d后已明顯導致小鼠腎小球尿素氮濾過率降低，功能受損。

圖 1 雷公藤內酯醇給藥后對 C57B/6 小鼠體質量增長的影響 （n=10，）Fig.1 Effects of consecu tive adm inistration of triptolide on gained body weights in the C57BL/6 m ice（ n=10，）

表 1 雷公藤內酯醇給藥對 C57BL/6 小鼠血清 ALT， AST及 BUN水平的影響 （n=10，）Tab.1 Effects of triptolide-treatments on serum biochem ical parameters in the C57/BL6m ice（n=10，）

表 1 雷公藤內酯醇給藥對 C57BL/6 小鼠血清 ALT， AST及 BUN水平的影響 （n=10，）Tab.1 Effects of triptolide-treatments on serum biochem ical parameters in the C57/BL6m ice（n=10，）

注： 與正常對照組比較，*P＜0.05

組 別 ALT/（U·L-1）AST/（U·L-1）BUN/（ mmol·L-1）27.11 ±2.25 55.1 ±2.2 8.7 ±1.2雷公藤內酯醇低劑量組 29.71 ±2.43 62.7 ±4.4 9.0 ±1.1雷公藤內酯醇高劑量組 30.54 ±2.16 71.2 ±5.8 11.7 ±1.9正常對照組*

2.3 雷公藤內酯醇給藥對 C57BL/6 小鼠肝和腎組織中生化指標的影響 雷公藤內酯醇給藥對C57BL/6 小鼠組織勻漿中生化指標 ALT， AST和GSH的影響見表 2。 低劑量組及高劑量組與正常對照組相比， 肝組織中的 ALT、 AST值沒有顯著性差異； 而高劑量組肝組織和腎組織中的 GSH水平分別降低了 27.0%和 15.80%，P＜0.05 有顯著性差異。

表 2 雷公藤內酯醇給藥對 C57BL/6 小鼠肝組織中 ALT， AST及 GSH和腎組織中 GSH水平的影響 （n=10，）Tab.2 E ffects of triptolide-treatments on liver or kidney homogenates in the C57/BL6 m ice（ n=10，）

表 2 雷公藤內酯醇給藥對 C57BL/6 小鼠肝組織中 ALT， AST及 GSH和腎組織中 GSH水平的影響 （n=10，）Tab.2 E ffects of triptolide-treatments on liver or kidney homogenates in the C57/BL6 m ice（ n=10，）

注： 與正常對照組比較，*P＜0.05

組 別 肝 ALT/（ U·gprot-1） 肝 AST/（ U·gprot-1） 肝 GSH/（ μmol·g prot-1） 腎 GSH/（ μmol·g prot-1）72.5 ±4.0 72.1 ±5.4 11.4 ±3.8 12.2 ±0.7雷公藤內酯醇低劑量組 64.6 ±5.4 61.7 ±6.3 9.7 ±2.8 11.0 ±1.4雷公藤內酯醇高劑量組 60.1 ±3.2 59.6 ±4.5 8.3 ±1.5* 10.3 ±1.2正常對照組*

2.4 臟器指數(shù)的比較 雷公藤內酯醇亞慢性中毒對 C57BL/6 小鼠各臟器指數(shù)的影響， 見表 3。 低劑量組及高劑量組與正常對照組相比，小鼠的心、肝、腎臟、肺臟器指數(shù)沒有顯著性差異；低劑量組及高劑量組與溶劑組相比睪丸臟器指數(shù)顯著降低（P＜0.01）； 高劑量組脾臟器指數(shù)顯著增大 （P＜0.05）。

表 3 雷公藤內酯醇給藥對 C57BL/6 小鼠各臟器指數(shù)的影響Tab.3 Viscera index of the C57/BL6 m ice adm inistered w ith triptolide by intraperitoneal injection for 30 days

2.5 病理組織切片觀察 在光學顯微鏡下觀察各組織病理切片，發(fā)現(xiàn)雷公藤內酯醇給藥的小鼠的腎臟、脾臟和睪丸組織發(fā)生較明顯的病理變化。低劑量組小鼠腎組織中大量炎癥細胞聚集，高劑量組小鼠腎組織被大量炎性細胞浸潤，腎小球病變毛細血管袢界限不清晰 （見圖 2）。 低劑量組與高劑量組小鼠脾臟脾髓中紅髓區(qū)域增多，脾竇充血，脾細胞間隙增大 （見圖 3）。 對照組小鼠睪丸中生精小管中含有大量生殖細胞，小管中央可見小的、深染的橢圓形精子；低劑量組小鼠睪丸中顯示局灶性生精小管萎縮，睪丸間質細胞受損，殘存部分具有正常生精活性的生精小管；高劑量組小鼠睪丸中生精小管大量萎縮，少見具有正常形態(tài)的精細胞 （見圖4）。 本次實驗小鼠病理組織切片雷公藤內酯醇對小鼠的肝、肺、胃和十二指腸損傷不明顯。

圖 2 雷公藤內酯醇給藥后各組小鼠腎臟組織病理學檢查 （ ×100）Fig.2 M icrograph of kidney from a C57/BL6 rat treated with vehicle（ ×100）

圖 3 雷公藤內酯醇給藥后各組小鼠脾臟組織病理學檢查 （ ×100）Fig.3 M icrograph of spleen from a C57/BL6 rat treated with vehicle（ ×100）

3 討論

雷公藤內酯醇是中藥雷公藤的主要生物活性成分，具有包括抗炎、抗腫瘤、抗生育在內的多重生物學作用，特別值得注意的是近年報道雷公藤內酯醇對 PKD和胰腺癌細胞抑制作用［6-7］， 是學界最關注的天然活性產(chǎn)物之一。但由于雷公藤內酯醇具有較強的毒性，嚴重影響了其開發(fā)利用，如何保持其生物活性并降低其不良反應是亟待解決的問題。本實驗采用 “標準” 的近交系 C57BL/6 小鼠研究雷公藤內酯醇亞慢性中毒對其全身主要組織功能的影響，實驗精度高，均一性和可重復性較好。

圖 4 雷公藤內酯醇給藥后各組小鼠睪丸組織病理學檢查 （ ×100）Fig.4 M icrograph of testis from a C57/BL6 rat treated with vehicle（ ×100）

在本實驗中較低劑量 （100 μg/kg） 下， 雷公藤內酯醇對 C57BL/6 小鼠的腎臟、 脾臟、睪丸有明顯損傷，對肝、肺、胃及十二指腸均未見明顯影響； 在較高劑量 （200 μg/kg）下對 C57BL/6 小鼠腎臟、脾臟、睪丸損傷加重，對肝、肺、胃及十二指腸仍未見明顯影響。 與劉良等報道［9］相比， 本實驗在給藥過程中并未出現(xiàn)死亡，該品系小鼠用于亞慢性中毒實驗個體差異較小，均一性好，實驗數(shù)據(jù)更加精確。并且發(fā)現(xiàn)雷公藤內酯醇亞慢性中毒除了對小鼠睪丸和腎臟有明顯損傷外，還導致小鼠脾臟腫大，該區(qū)別是否由于小鼠品系差異導致，還有待于進一步確認。

本實驗除測定 ALT、 AST和 BUN等常規(guī)生化指標外， 還測定了肝、腎組織勻漿中 GSH水平。與正常對照組相比，雷公藤內酯醇高劑量組小鼠腎組織勻漿和肝組織勻漿中 GSH水平下降。 GSH是細胞內的氧自由基最主要的清除劑，正常情況下，組織中總谷胱甘肽水平是相對恒定的， GSH水平主要因為清除細胞內氧自由基而下降。楊凌教授等研究組［12-14］分別報道 了肝藥 酶 CYP3A是肝 臟中雷公藤內酯醇的主要解毒酶，可推測其解毒過程中產(chǎn)生的氧自由基是肝臟 GSH消耗的主要原因。 而本實驗發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟中 GSH同樣顯著降低， 腎臟中的細胞色素 P450 酶系是否同樣可以起到解毒作用并導致 GSH消耗， 是本課題組繼續(xù)研究的方向。

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Sub-chronic toxicities of triptolide to C57BL/6 m ice

WU Na， LIU Xing-yu， WANG Du-jun， LUO Pan， WU Yao， WEIYuan*
（School of Pharmacy， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China ）

AIM To investigate the sub-chronic effects of triptolide（ TP） to the major organs of C57BL/6 mice.METHODS Thirty C57BL/6micewere evenly divided into three groups（n=10） ， and treated with TP for 30 days.Their body weights were measured.The levels of alanine transaminase（ ALT） ， aspartate transaminase（ AST） ， blood urea nitrogen （ BUN） in serum， and the levels of ALT， AST， and glutathione（ GSH） in liver and kidney homogenatesweremeasured by ELISA.Weights ofmice’smajor organsweremeasured to calculate the viscera index.The histopathological changesof liver， kidney， spleen， lung，stomach， testis，and intestine in C57BL/ 6 micewere investigated by H&E staining.RESULTS Compared with the control group， the gained body weights of the TP group on the 28th day significantly decreased （P＜0.05）.The serum BUN levels in high dose TP group significantly increased.The GSH level in liver homogenates and kidney homogenates of the 200 μg/kg TP group significantly decreased.In addition，the testis indexes of both low and high dose groups significantly decreased，while the spleen index of the 200 μg/kg TP group significantly increased.CONCLUSION TP has sub-chronic intoxication on major organs of C57BL/6 mice， especially kidney， spleen and testis.

triptolide；C57BL/6 mice； sub-chronic intoxication

R966

： A

： 1001-1528（2014）05-0904-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.004

2013-04-20

國家自然科學基金青年項目 （81102522）； 江蘇省自然科學基金項目 （BK2011473）； 江蘇省博士后科研資助計劃（1201081C）

吳 娜 （1989—）， 女， 碩士生， 主要從事中藥毒理學研究。

*通信作者： 魏 淵 （1981—） ， 男， 副教授， 主要從事中 藥的藥 物代謝和毒 理學研究。 Tel： （ 0511） 88791526， E-mail： ywei@ujs. edu.cn