小兒牛黃清心散對(duì)幼年大鼠驚厥性腦損傷的保護(hù)作用

李文娟， 蔣 莉， 陳恒勝， 陳小璐

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國(guó)際科技合作基地，重慶 400014）

小兒牛黃清心散對(duì)幼年大鼠驚厥性腦損傷的保護(hù)作用

李文娟， 蔣 莉*， 陳恒勝， 陳小璐

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國(guó)際科技合作基地，重慶 400014）

目的 研究小兒牛黃清心散對(duì)幼年大鼠驚厥性腦損傷的保護(hù)作用。 方法 21 日齡 SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，小兒牛黃清心散高、中、低劑量組。除正常對(duì)照組外，各組分別給予生理鹽水、小兒牛黃清心散灌胃， 給藥 1 d 后， 給予戊四唑 （70mg/kg） 腹腔注射， 定時(shí)取腦組織標(biāo)本行病理檢查、 免疫組化檢測(cè)IL-1β和膠質(zhì)纖維性蛋白 （GFAP） 在腦組織中的表達(dá)及采用 TUNEL染色法檢測(cè)大腦皮層和海馬 CA1 神經(jīng)元的凋亡情況。 結(jié)果 小兒牛黃清心散高劑量組中各時(shí)間點(diǎn)大腦皮層和海馬 IL-1β和 GFAP表達(dá)、 凋亡指數(shù)較模型對(duì)照組顯著減少，與正常對(duì)照組比較無顯著差異；小兒牛黃清心散中劑量組上述各指標(biāo)均較模型對(duì)照組減少，但仍高于正常對(duì)照組；小兒牛黃清心散低劑量組與模型對(duì)照組比較無顯著差異。結(jié)論 小兒牛黃清心散可呈劑量依賴性對(duì)由戊四唑引起的驚厥性幼鼠腦損傷起保護(hù)作用。

小兒牛黃清心散；戊四唑；驚厥；腦損傷；腦保護(hù)；幼年大鼠

驚厥是小兒時(shí)期最常見的神經(jīng)系統(tǒng)急癥，在兒童中的發(fā)生率高達(dá) 3% ～5%， 且與成人相比， 小兒驚厥更易出現(xiàn)嚴(yán)重驚厥和驚厥持續(xù)狀態(tài) （ status convulsion， SC）［1］。既往研究 證實(shí)， SC可造成腦損傷，出現(xiàn)皮層及海馬神經(jīng)元凋亡，神經(jīng)元缺失，膠質(zhì)疤痕形成及苔蘚纖維樣變。近年眾多研究表明， 免疫系統(tǒng)也參與腦損傷的病理過程［2］。 IL-1β作為一種炎癥介質(zhì)參與驚厥性腦損傷的啟動(dòng)過程［3］，不僅介導(dǎo)驚厥持續(xù)狀態(tài)后神經(jīng)元壞死的發(fā)生［4］， 還可通過 IL-1R/IκB/NFκB信號(hào)通路介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞 （ Astrocyte， Ast）增生活化［5］。 膠質(zhì) 纖 維 性 蛋 白 （ glial fibriliary acidic protein，GFAP）是 Ast特有的細(xì)胞骨架蛋白， GFAP是反映星形膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)的有效指標(biāo)［6］， 中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時(shí) Ast會(huì)發(fā)生反應(yīng)性增生， GFAP表達(dá)上調(diào)。

小兒牛黃清心散是我國(guó)著名的中成藥之一，主要是由天麻、膽南星等十四味中藥配伍而成。前期研究表明，小兒牛黃清心散有劑量依賴性的預(yù)防大鼠驚厥的作用，但其對(duì)驚厥性腦損傷是否有保護(hù)作用，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)小兒牛黃清心散先干預(yù)再予戊四唑腹腔注射后不同時(shí)間點(diǎn)各組幼鼠大腦組織中皮層及海馬神經(jīng)元凋亡及 IL-1β、 GFAP表達(dá)動(dòng)態(tài)變化的情況， 旨在探討小兒牛黃清心散對(duì)驚厥幼鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康 SPF級(jí) 21 日齡 SD大鼠 240只， 雌雄各半， 體質(zhì)量 （45 ±5） g， 由重慶醫(yī)科大學(xué) 動(dòng) 物 實(shí) 驗(yàn) 中 心 提 供。 動(dòng) 物 許 可 證 號(hào) syxk（渝） 20040001。

1.2 主要試劑及器材 小兒牛黃清心散 （山東方健制藥有限公司提供， 國(guó)藥準(zhǔn)字 Z37020495）； 戊四唑 （ pentylenetetrazole，PTZ， 美國(guó) Sigma公司）；IL-1β抗體 （ Santacruze公司） ； GFAP抗體 （ 美國(guó)Sigma公司）； 組化試劑盒 （ 北京 中杉金橋公司）TUNEL試劑盒 （美國(guó) Roche公司）； BX-51 熒光顯微鏡及成像系統(tǒng) （日本 Olympus公司）。

1.3 動(dòng)物分組及模型制備 21 日齡 SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，小兒牛黃清心散高、中、低劑量組。各組分別給予生理鹽水 2 mL， 小兒牛黃 清 心 散 16、 8、 0.3 g/（kg·d）分早晚 2 次灌胃， 給藥 1 d， 灌胃結(jié)束后 30 min， 給 予戊四唑 （ 70 mg/kg） 腹 腔 注 射，在戊四唑注射后 4 h、 12 h、 24 h、 48 h、 72 h、 7 d時(shí)間點(diǎn)， 留取腦組織標(biāo)本 （每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8只， 若有死亡者補(bǔ)充至8只）。

1.4 尼氏染色觀察各組腦組織的病理變化 各組腦組織各時(shí)間點(diǎn)切片行尼氏染色，觀察皮層及海馬神經(jīng)元壞死情況。

1.5 DNA原位末端標(biāo)記法 （TUNEL法） 檢測(cè)胰腺組織細(xì)胞凋亡 按試劑盒說明書操作，腦組織細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞，每張切片在400 倍高倍鏡下隨機(jī)選取 5 個(gè)視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)， 凋亡指數(shù) （AI） = （凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)） ×100%

1.6 腦組織中 GFAP和 IL-1β的表達(dá) 采用 SABC免疫組化染色法檢測(cè)。具體方法參照既往報(bào)道［7］，以包漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒細(xì)胞為 GFAP、 IL-1β陽性細(xì)胞。 使用 Olympus自動(dòng)圖像采集系統(tǒng)， 每張切片在光學(xué)顯微鏡下以相同倍數(shù) （400） 于腦組織皮層和海馬各區(qū)分別隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)不相重疊的高倍鏡視野， 應(yīng)用 Image Pro Plus 5.0 專業(yè)圖像分析軟件對(duì)其測(cè)量累計(jì)光密度值 （ integrated opitical density，IOD） 進(jìn)行圖像分析。

SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析， 以 SNK-q 檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)間多重比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦組織病理變化 正常 SD大鼠神經(jīng)元細(xì)胞核大而圓，呈淡藍(lán)色，中央有清楚核仁。模型對(duì)照組腦組織切片出現(xiàn)明顯神經(jīng)元變性、 死亡， 以24 h最為顯著， 如圖 1所示，高倍鏡視野下海馬 CA1區(qū)和皮層中可見單個(gè)或散在的變性、壞死細(xì)胞，變性細(xì)胞腫脹，體積增大，胞核偏位，死亡的細(xì)胞核深染、核體積縮小，核溶解。高劑量干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)未見明顯壞死。中劑量干預(yù)組可見壞死神經(jīng)元較模型對(duì)照組明顯減少；低劑量干預(yù)組可見壞死神經(jīng)元與模型對(duì)照組無明顯差異。

圖 1 各組大鼠 24 h時(shí)間點(diǎn)腦組織中皮層及海馬神經(jīng)元尼氏染色 （ ×200 倍）Fig.1 Nissl staning of neurons in cortex and hippocam pus of the brain tissues at time point of24 hours in each group（ ×200）

2.2 各組大鼠腦組織中皮層及海馬神經(jīng)元的凋亡情況 與正常對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，模型對(duì)照組大鼠的腦組織于 SC后12 h 時(shí)間點(diǎn)海馬CA1 區(qū)和皮層 TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)開始顯著增加， 表現(xiàn)為有明顯的染色質(zhì)聚集、胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞核皺縮、周圍空泡形成及單個(gè)圓形凋亡小體，并在 48 h達(dá)高峰（P＜0.05）。 高劑量干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)海馬 CA1 區(qū)及皮層 TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)與模型組各時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 中劑量干預(yù)組中 12、 24、 48 h 各亞組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)均較模型組顯著下降 （P＜0.05）， 但仍顯著高于正常對(duì)照組 （P＜0.05）， 低劑量干預(yù)組與模型對(duì)照組比較，未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1 ～2， 圖 2 ～圖 3。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)皮層神經(jīng)元凋亡指數(shù)情況 （%，）Tab.1 Apoptotic index of neurons in cortex at different time points in each group（%，）

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)皮層神經(jīng)元凋亡指數(shù)情況 （%，）Tab.1 Apoptotic index of neurons in cortex at different time points in each group（%，）

注： 與正常對(duì)照組比較，°P＜0.05； 與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05

4 h 12 h 24 h 48 h 72 h 7 d正常對(duì)照組組別 動(dòng)物數(shù)/只8 1.16 ±0.27 1.14 ±0.26 1.16 ±0.27 1.16 ±0.32 1.36 ±0.25 1.28 ±0.31模型對(duì)照組 8 1.18 ±0.29 8.73 ±1.35° 12.36 ±2.38° 43.05 ±3.21° 28.3 ±2.75° 6.3 ±0.80°高劑量干預(yù)組 8 1.19 ±0.21 1.31 ±0.23* 1.28 ±0.18* 1.18 ±0.15* 1.15 ±0.23* 1.16 ±0.19*中劑量干預(yù)組 8 1.17 ±0.32 5.21 ±0.54* 8.35 ±1.42* 22.3 ±2.62* 11.6 ±1.83* 3.94 ±0.62*低劑量干預(yù)組8 1.16 ±0.19 8.37 ±1.63 11.59 ±2.12 41.3 ±2.14 22.4 ±1.35 6.2 ±0.42

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)情況 （%，）Tab.2 Apoptotic index of neurons in CA1 region of the hippocam pus at d ifferent time points in each group（ %，）

表2 各組各時(shí)間點(diǎn)海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)情況 （%，）Tab.2 Apoptotic index of neurons in CA1 region of the hippocam pus at d ifferent time points in each group（ %，）

注： 與正常對(duì)照組比較，°P＜0.05； 與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05

4 h 12 h 24 h 48 h 72 h 7 d正常對(duì)照組1.3 ±0.6 1.3 ±0.5 1.7 ±0.6 1.5 ±0.8 1.3 ±0.4 1.4 ±0.4模型對(duì)照組 8 1.5 ±0.4 5.50 ±1.8° 10.7 ±2.1° 19.5 ±4.3° 9.8 ±1.2° 4.1 ±0.7°高劑量干預(yù)組 8 1.3 ±0.3 1.3 ±0.6* 1.4 ±0.4* 1.4 ±0.5* 1.3 ±0.6* 1.5 ±0.6*中劑量干預(yù)組 8 1.4 ±0.5 3.2 ±0.5* 3.8 ±0.4* 4.3 ±1.1* 3.6 ±0.8* 2.8 ±0.5*低劑量干預(yù)組8 1.3 ±0.7 5.2 ±1.3 8.6 ±2.1 17.5 ±4.1 9.3 ±1.7 4.3 ±0.5 8組別 動(dòng)物數(shù)/只

圖 2 各組各時(shí)間點(diǎn)皮層神經(jīng)元凋亡情況 （ ×200 倍）Fig.2 Apoptotic neurodegeneration of neurons in cortex at different time points in each group（ ×200）

圖 3 各組各時(shí)間點(diǎn)海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元凋亡情況 （ ×200倍）Fig.3 Apoptotic neurodegeneration of neurons in the CA1 region of hippocampus at different time points in each group（ ×200）

2.3 各組腦組織中 IL-1β、 GFAP的表達(dá) 免疫組化結(jié)果如表3～6所示。 結(jié)果顯示正常對(duì)照組皮層和海馬 CA1 區(qū)中 IL-1β的表達(dá)極弱， 模型對(duì)照組大鼠 IL-1β表達(dá)在 SC后 12 h 海馬 CA1 區(qū) IL-1β陽性細(xì)胞增多， 以 24 h 最為顯著， 48 h 開始減少， IOD值也均有增高。高劑量干預(yù)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與模型組相比， IOD差值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）， 與正常對(duì)照組比較，未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。中劑量干預(yù)組中12、 24、 48 h 組 IL-1β陽性細(xì)胞數(shù)均較模型組明顯減少，但仍高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量干預(yù)組與模型對(duì)照組比較，各時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異 （P＞0.05）。

表 3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的皮層中 IL-1β的 IOD值變化的情況 （）Tab.3 Changes of IOD value of IL-1βin the cor tex at different time points in each group（）

表 3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的皮層中 IL-1β的 IOD值變化的情況 （）Tab.3 Changes of IOD value of IL-1βin the cor tex at different time points in each group（）

注： 與正常對(duì)照組比較，°P＜0.05； 與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05

4 h 12 h 24 h 48 h 72 h 7 d正常 對(duì)照 組 8 0.014 5 ±0.000 6 0.015 1 ±0.000 9 0.014 7 ±0.000 7 0.015 0 ±0.001 1 0.015 3 ±0.000 8 0.014 9 ±0.0組別 動(dòng)物數(shù)/只01 2模型 對(duì)照 組 8 0.015 3 ±0.000 7 0.031 5 ±0.001 2°0.057 3 ±0.004 2°0.051 1 ±0.003 9°0.043 8 ±0.002 7°0.031 7 ±0.001 5°高劑 量干 預(yù)組 8 0.014 7 ±0.000 6 0.015 3 ±0.001 7*0.014 8 ±0.000 7*0.015 4 ±0.001 5*0.015 2 ±0.001 3*0.014 6 ±0.001 1*中劑 量干 預(yù)組 8 0.015 1 ±0.000 8 0.022 6 ±0.001 5*0.039 9 ±0.002 4*0.037 2 ±0.002 1*0.026 5 ±0.001 3*0.021 7 ±0.001 2*低劑 量干 預(yù)組 8 0.015 6 ±0.000 9 0.032 3 ±0.001 7 0.056 9 ±0.003 1 0.051 3 ±0.003 6 0.043 2 ±0.002 7 0.032 9 ±0.001 6

表 4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬 CA1 區(qū)中 IL-1β的 IOD值變化的情況 （）Tab.4 Changes of IOD value of IL-1βin the CA1 region of the hippocam pus at different time points in each group（）

表 4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬 CA1 區(qū)中 IL-1β的 IOD值變化的情況 （）Tab.4 Changes of IOD value of IL-1βin the CA1 region of the hippocam pus at different time points in each group（）

注： 與正常對(duì)照組比較，°P＜0.05； 與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05

4 h 12 h 24 h 48 h 72 h 7 d正常 對(duì)照 組 8 0.015 2 ±0.001 7 0.015 7 ±0.000 9 0.016 1 ±0.000 7 0.014 8 ±0.001 2 0.015 6 ±0.000 8 0.015 4 ±0.組別 動(dòng)物數(shù)/只001 1模型 對(duì)照 組 8 0.015 8 ±0.001 3 0.064 1 ±0.003 5°0.115 8 ±0.017 4°0.093 3 ±0.012 6°0.069 4 ±0.007 7°0.056 2 ±0.002 9°高劑 量干 預(yù)組 8 0.016 1 ±0.001 8 0.015 9 ±0.001 5*0.015 6 ±0.001 7*0.014 9 ±0.002 1*0.015 5 ±0.001 3*0.015 8 ±0.001 1*中劑 量干 預(yù)組 8 0.015 9 ±0.001 5 0.037 7 ±0.003 1*0.062 5 ±0.005 3*0.057 7 ±0.004 6*0.038 3 ±0.003 5*0.029 9 ±0.002 4*低劑 量干 預(yù)組 8 0.016 2 ±0.001 9 0.063 5 ±0.005 2 0.109 7 ±0.012 4 0.092 2 ±0.011 7 0.065 8 ±0.005 9 0.055 3 ±0.004 7

表 5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)皮層中 GFAP的 IOD值變化的情況 （）Tab.5 Changes of IOD value of GFAP in the cortex at different tim e points in each group（）

表 5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)皮層中 GFAP的 IOD值變化的情況 （）Tab.5 Changes of IOD value of GFAP in the cortex at different tim e points in each group（）

注： 與正常對(duì)照組比較，°P＜0.05； 與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05

4 h 12 h 24 h 48 h 72 h 7 d正常 對(duì)照 組 8 0.241 3 ±0.009 2 0.241 5 ±0.008 6 0.241 8 ±0.008 3 0.242 0 ±0.007 9 0.242 3 ±0.006 5 0.238 6 ±0組別 動(dòng)物數(shù)/只.007 5模型 對(duì)照 組 8 0.270 5 ±0.011 7°0.397 3 ±0.013 0°0.469 0 ±0.012 9°0.563 6 ±0.109 5°0.599 7 ±0.113 1°0.630 2 ±0.128 2°高劑 量干 預(yù)組 8 0.252 3 ±0.009 5*0.258 3 ±0.006 7*0.243 2 ±0.012 2*0.251 7 ±0.008 7*0.238 9 ±0.009 5*0.249 5 ±0.007 8*中劑 量干 預(yù)組 8 0.260 2 ±0.023 1*0.314 5 ±0.023 2*0.382 7 ±0.031 9*0.435 9 ±0.027 4*0.492 7 ±0.039 5*0.513 8 ±0.047 5*低劑 量干 預(yù)組 8 0.269 8 ±0.013 5 0.388 5 ±0.012 7 0.463 8 ±0.021 3 0.557 8 ±0.049 9 0.601 2 ±0.110 3 0.627 7 ±0.088 2

表 6 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬 CA1 區(qū)中的 GFAP的 IOD值變化的情況 （）Tab.6 Changes of IOD value of GFAP in the CA1 region of the hippocam pus at different time points in each group（）

表 6 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬 CA1 區(qū)中的 GFAP的 IOD值變化的情況 （）Tab.6 Changes of IOD value of GFAP in the CA1 region of the hippocam pus at different time points in each group（）

注： 與正常對(duì)照組比較，°P＜0.05； 與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05

4 h 12 h 24 h 48 h 72 h 7 d正常 對(duì)照 組 8 0.213 9 ±0.008 7 0.218 7 ±0.013 8 0.215 8 ±0.013 1 0.231 6 ±0.075 0.227 1 ±0.006 3 0.226 3 ±0.組別 動(dòng)物數(shù)/只012 1模型 對(duì)照 組 8 0.268 1 ±0.012 1°0.343 7 ±0.017 5°0.437 5 ±0.023 2°0.559 3 ±0.040 9°0.601 3 ±0.041 7°0.640 7 ±0.058 5°高劑 量干 預(yù)組 8 0.214 9 ±0.006 5*0.228 9 ±0.015 7*0.216 9 ±0.013 4*0.240 6 ±0.095*0.228 3 ±0.007 3*0.229 7 ±0.015 4*中劑 量干 預(yù)組 8 0.234 7 ±0.007 2*0.279 1 ±0.008 3*0.315 7 ±0.024 5*0.392 2 ±0.031 8*0.419 5 ±0.039 7*0.452 9 ±0.041 3*低劑 量干 預(yù)組 8 0.257 3 ±0.016 3 0.339 2 ±0.027 1 0.428 9 ±0.023 7 0.547 8 ±0.031 1 0.599 6 ±0.042 2 0.641 2 ±0.087 5

正常對(duì)照組皮層和海馬 CA1 區(qū)星型膠質(zhì)細(xì)胞胞漿中 GFAP有少量表達(dá)， 模型對(duì)照組大鼠皮層和海馬 CA1 區(qū)在各時(shí)間點(diǎn)有不同程度的棕黃色陽性細(xì)胞表達(dá)， 其免疫反應(yīng)累積光密度 （IOD） 值在驚厥后4 h開始稍有升高，后逐漸增高，7 d時(shí)間點(diǎn)最為明顯，與正常對(duì)照組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較顯著增多（P＜0.05）。 高劑量干預(yù)組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與模型組相比， IOD值顯著減少 （P＜0.05）， 與正常對(duì)照組比較無顯著差異 （P＞0.05）； 而中劑量干預(yù)組大鼠皮層及海馬 CA1 區(qū) GFAP蛋白表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)較模型組均有下降 （P＜0.05）， 但仍高于正常對(duì)照組 （P＜0.05）； 低劑量干預(yù)組與模型對(duì)照組比較， 各時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異 （P＞0.05）。

3 討論

近年來， 有研究報(bào)道促炎因子如 IL-1β的激活可能 在 癇 性 發(fā) 生 中 起 著 重 要 作 用［8］，脂 多 糖（LPS） 誘導(dǎo)的炎癥性反應(yīng)會(huì)加重癲癎大鼠模型的癎性發(fā)生［9］。 IL-1β主要由腦內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞， 血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞， 神經(jīng)元， 淋巴細(xì)胞［10］通過自分泌和旁分泌的途徑產(chǎn)生， IL-1β既可通過引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)潛在的神經(jīng)毒性分子如花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物、一氧化氮等的釋放［11］而產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用， 使神經(jīng)元凋亡并壞死， 還能夠通過 IL-1 受體和 toll樣受體系統(tǒng)的激活發(fā)揮作用［12］， 刺激膠質(zhì)細(xì)胞活化從而調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)，突觸傳遞，神經(jīng)元的興奮性和自發(fā)放電的產(chǎn)生［13］。 因此，越來越多研究證實(shí)抗炎治療可能是治療癲癎的靶點(diǎn)之一［14］。

小兒牛黃清心散是我國(guó)著名的中成藥之一，主要是由天麻、膽南星、黃連、赤芍、大黃、全蝎、水牛角濃縮粉、 僵蠶 （麩炒）、 牛黃、 琥珀、 雄黃、冰片、朱砂、金礞石 （煅）這十四味中藥組合而成。 研究表明， 其成分中含有的牛黃［15］、 大黃［16］等有抗炎的作用。因此，推測(cè)小兒牛黃清心散可能通過抗炎機(jī)制發(fā)揮腦保護(hù)的生物學(xué)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)模型對(duì)照組大鼠在 SC后12 h 海馬CA1 區(qū)及皮層 IL-1β的表達(dá)開始明顯增多， 24 h 最為顯著， 48 h開始減少， 7 d 下降， 但未至正常，同時(shí)該組大鼠皮層和海馬神經(jīng)元在驚厥發(fā)作后12 h時(shí)開始凋亡率增高、 壞死增加， 這說明 IL-1β可能參與了驚厥性腦損傷的啟動(dòng)的過程， GFAP的表達(dá)從4 h開始增多，余時(shí)間點(diǎn)均持續(xù)性增高，這與文獻(xiàn)報(bào)道［7］相符。 而 48 h ～7 d 時(shí)間點(diǎn)時(shí) IL-1β的表達(dá)下調(diào)，提示可能與膠質(zhì)細(xì)胞在增生后期的分泌功能下降有關(guān)。

在給予小兒牛黃清心散干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)各相同時(shí)間點(diǎn)的高劑量小兒牛黃清心散干預(yù)組大鼠大腦皮層和海馬病理形態(tài)較好，凋亡和壞死的發(fā)生顯著減少， IL-1β及 GFAP的表達(dá)明顯下降， 與正常對(duì)照組未見明顯差異；而中劑量小兒牛黃清心散干預(yù)組的大鼠的大腦皮層和海馬壞死及凋亡減輕， IL-1β及 GFAP的表達(dá)減少但未至正常； 低劑量干預(yù)組與模型對(duì)照組的腦組織病理變化相似。提示高劑量的小兒牛黃清心散可有效減少驚厥性腦損傷，中劑量的小兒牛黃清心散可減輕幼年大鼠的驚厥性腦損傷，而低劑量的小兒牛黃清心散對(duì)驚厥性腦損傷并無顯著保護(hù)作用。

因此， 小兒牛黃清心散可能通 過下調(diào) IL-1β，減少大腦皮層和海馬神經(jīng)元壞死凋亡，抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生的下游損傷通路，發(fā)揮腦保護(hù)作用。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將進(jìn)一步闡明其中的可能機(jī)制。

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Neuroprotective effect of Xiaoer Niuhuang Qingxin Pow der on brain injury of pentylenetetrazole-induced seizure in developing rats

LIWen-juan， JIANG Li*， CHEN Heng-sheng， CHEN Xiao-lu
（Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders， Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing， Chongqing International Scienceand Technology Cooperation Center for Child Development and Disorders， Children’ s Hopital of Chongqing Medical University， Chongqing 400014， China）

AIM To study the neuroprotective effect of Xiaoer Niuhuang Qingxin Powder on brain injury of pentylenetetrazole-induced seizure.METHODS Juvenile Sprague-Dawley rats aged twenty one dayswere equally randomized into five groups， the normal group， model group， high-dose， middle-dose， and low-dose of Xiaoer Niuhuang Qingxins Powder group， which were given orally with saline and Xiaoer Niuhuang Qingxin Powder， respectively，except for the normal group， for one day.After the injection of pentylenetetrazole，rats in all groups were sacrificed in proper times for the pathological inspection of brain tissues.The expressions of IL-1 βand glial fibrillary acidic protein （GFAP） in the cortex and CA1 region of the hippocampuswere also observed and neuron apoptosis were examined by TUNEL assay.RESULTS No significant difference was observed between the highdose group and the normal group in the expressions of IL-1 βand GFAP and the apoptotic index， but thar in the middle-dose group were higher than these of the normal group and lower than these of the model group （ P＜0.05） .No significant difference were observed between the low-dose and the model group in them.CONCLUSION Xiaoer Niuhuang Qingxin Powder can protect the rat immature brain from the seizures injury caused by pentylenetetrazole in dose dependentmanner.

Xiaoer Niuhuang Qingxin Powder； pentylenetetrazole； convulsions； brain injury；neuroprotection， immature rat

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）05-0892-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.002

2013-08-18

李文娟 （1987—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 未成熟腦驚厥性腦損傷與腦保護(hù)作用。 Tel： 13983467430， E-mail： 627775752 @qq.com

*通信作者： 蔣 莉 （1964—） ， 女， 教授， 研究方向： 小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)與臨床。 Tel： （023 ） 63621892， E-mail： dr_jiangli@ 126.com