人冠狀病毒感染的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

郝春緒，沈曉玲，譚文杰

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所，北京 102206

冠狀病毒屬于套式病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬，在電子顯微鏡下呈日冕冠或皇冠狀，故得名[1]。目前冠狀病毒被分為4個(gè)屬，即α冠狀病毒屬（A系和B系）、β冠狀病毒屬（A～D系）、γ冠狀病毒屬和δ冠狀病毒屬[1]。冠狀病毒是有包膜的正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)25～32 kb，是已知所有RNA病毒中基因組最大的[2]。病毒基因組的兩端分別包含一個(gè)非翻譯區(qū)（5'-UTR和3'-UTR），其中5'端約3/4包含2個(gè)大的重疊的開放讀框ORF1a和ORF1b，主要編碼與病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶類等非結(jié)構(gòu)蛋白，3'端約1/4的基因主要編碼表面棘突（spike，S）蛋白、膜（mem?brane，M）蛋白、小包膜（small envelope membrane，E）蛋白及核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白等主要結(jié)構(gòu)蛋白[2]。

1 人冠狀病毒感染概述

冠狀病毒感染是一類動(dòng)物源性疾病，宿主范圍廣泛，與人和動(dòng)物的許多疾病有關(guān)[1-3]。2012年前發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒（human coronavirus，HCoV）包括HCoV-OC43、HCoV-229E、SARS-CoV、HCoV-NL63和HCoV-HKU1[3-5]，其中HCoV-NL63和HCoV-229E為α冠狀病毒，SARS-CoV、HCoV-OC43和HCoVHKU1均為β冠狀病毒。2012年在中東地區(qū)新發(fā)現(xiàn)的中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）為第6種人冠狀病毒[6]。在6種人冠狀病毒中，HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1等4種在人群中普遍存在并呈全球性分布，通常引起急性呼吸道癥狀，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、流涕，嚴(yán)重者表現(xiàn)為喉炎、支氣管炎、毛細(xì)支氣管炎及肺炎等，也有導(dǎo)致胃腸道與神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的報(bào)道[1-3]。2003年起源于我國(guó)廣東的SARS-CoV曾在全球多個(gè)國(guó)家與地區(qū)暴發(fā)流行，主要引起成人急性呼吸道癥狀，嚴(yán)重者造成死亡[4-5]，但2005年迄今已無(wú)新的感染病例報(bào)道。而2012年新發(fā)現(xiàn)的MERS-CoV，感染者的主要癥狀表現(xiàn)為重癥急性呼吸道感染并伴發(fā)腎功能衰竭[6]，截至2014年1月10日，WHO報(bào)道全球?qū)嶒?yàn)室確診177人感染，74人死亡，存在隱性感染病例與有限人際傳播能力[7]。

高致病性的SARS-CoV與MERS-CoV分離培養(yǎng)須在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，而其他4種HCoV的分離培養(yǎng)技術(shù)難度較大，不適于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷。目前人冠狀病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷主要有核酸檢測(cè)與血清學(xué)檢測(cè)[5，8-9]。RT-PCR與熒光定量RT-PCR等核酸檢測(cè)技術(shù)能在人冠狀病毒感染的早期進(jìn)行快速診斷，是目前應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，但它在很大程度上依賴于有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員和專業(yè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，易污染；而血清學(xué)檢測(cè)方法不僅可用于感染診斷，并可監(jiān)測(cè)感染者體內(nèi)特異性抗體的變化情況及既往感染規(guī)律、人群易感狀況等流行病學(xué)數(shù)據(jù)，可為疾病的防治與疫苗研發(fā)提供參考依據(jù)[8-10]。

2 人冠狀病毒感染的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

人冠狀病毒感染的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)目前主要包括[8-20]：針對(duì)冠狀病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白（N和S蛋白）等，采用間接免疫熒光（IFA）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、蛋白印跡等技術(shù)檢測(cè)特異性結(jié)合抗體（IgG與IgM）；檢測(cè)血清中和抗體的基于真病毒或假型病毒的體外微量中和試驗(yàn)[15-16]。此外，因N蛋白為冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白中含量最豐富和保守的蛋白質(zhì)，常在感染早期病人血清中出現(xiàn)[12]，可制備N蛋白特異性單抗，建立雙抗體夾心EIA檢測(cè)血清中的N抗原。

2.1 抗體檢測(cè)

2.1.1 抗原的選擇與優(yōu)化 結(jié)構(gòu)蛋白是冠狀病毒血清學(xué)抗體檢測(cè)的主要候選抗原[8-19]，其中報(bào)道最多的是N和S蛋白，而M和E蛋白的報(bào)道較少[8-15]。因人冠狀病毒全長(zhǎng)N蛋白序列本身在各病毒間存在一定的保守性，作為抗原檢測(cè)血清抗體易導(dǎo)致交叉反應(yīng)與假陽(yáng)性，須進(jìn)行抗原優(yōu)化。如原核表達(dá)的全長(zhǎng)SARS-CoV N蛋白，作為抗原檢測(cè)人群中血清抗體，無(wú)論是采用EIA還是蛋白印跡法，均可發(fā)現(xiàn)與其他冠狀病毒（HCoV-229E與HCoV-OC43）存在交叉反應(yīng)[20-22]。如將全長(zhǎng)SARS-CoV N蛋白抗原分為3段，即N1（1～422 aa）、N2（1～109 aa）和N3（110～422 aa）進(jìn)行表達(dá)純化，結(jié)果顯示采用N1、N3作為候選抗原可更好地提高血清學(xué)檢測(cè)的特異性[19]。若將N蛋白分成39個(gè)不同片段，從中選擇6個(gè)片段PN360（1～360 aa）、PN301（1～301 aa）、PN199（30～228 aa）、PN185（30～214 aa）、PN155b（60～214 aa）和 PN125（90～214 aa）進(jìn)行抗原性研究，結(jié)果顯示在6種片段中，PN185和PN155b更適合作為候選抗原進(jìn)行SARS特異性血清抗體的檢測(cè)[21]。

相對(duì)于N蛋白，截短型S蛋白作為抗原檢測(cè)血清抗體具有更高的特異性[22]。采用人冠狀病毒S蛋白作為抗原檢測(cè)血清抗體，很少有存在交叉反應(yīng)的報(bào)道[10-11，14]。研究證明，冠狀病毒S蛋白的受體結(jié)合區(qū)（RBD）包含多個(gè)構(gòu)象的抗原，可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的中和抗體[15-16]。相對(duì)于全長(zhǎng)S蛋白，截短型S蛋白或RBD更易于在大腸桿菌及各種真核系統(tǒng)（如昆蟲桿狀系統(tǒng)或293T細(xì)胞）中得到高效表達(dá)，獲得構(gòu)象合理的純化蛋白，可作為特異敏感檢測(cè)感染后血清抗體的候選抗原[15-18]。應(yīng)用S蛋白和N蛋白的融合片段作為抗原，可以提高血清學(xué)檢測(cè)的特異性[23]。2009年，Gimenez等以S蛋白的251～683 aa片段和N蛋白（除了25個(gè)C端氨基酸殘基序列）組成的4種人工合成多肽混合物為抗原進(jìn)行了血清學(xué)篩查，敏感性和特異性均達(dá)90%以上，而混合的多肽作為候選抗原比單個(gè)肽更適合血清學(xué)的檢測(cè)[23]。

目前，關(guān)于各HCoV抗原的選擇與優(yōu)化仍是抗體檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題。

2.1.2 常見的人冠狀病毒感染血清學(xué)抗體檢測(cè)技術(shù) 實(shí)驗(yàn)室常用的人冠狀病毒血清學(xué)抗體檢測(cè)技術(shù)包括ELISA、IFA、蛋白芯片、蛋白印跡及中和實(shí)驗(yàn)等，每種方法存在著各自的優(yōu)勢(shì)和不足[8-29]。ELISA目前已廣泛用于人冠狀病毒（尤其是SARS-CoV）感染的血清學(xué)診斷[8-9]，其優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)、快速、簡(jiǎn)便、敏感性強(qiáng)、特異性高[18-19，23]。相對(duì)于 ELISA，IFA 更易建立，因后者無(wú)須獲得純化的蛋白抗原，尤其是難于表達(dá)純化的糖蛋白結(jié)構(gòu)抗原，可通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞而直接進(jìn)行檢測(cè)[8，14，26-27]。蛋白印跡法應(yīng)用于冠狀病毒的血清學(xué)抗體雖有不少報(bào)道[13，22]，但由于操作繁瑣，不易標(biāo)準(zhǔn)化，目前很少推廣應(yīng)用。面對(duì)2012年新發(fā)現(xiàn)的MERS-CoV感染，最先建立的血清學(xué)抗體快速檢測(cè)手段即為間接免疫熒光法[27]，隨后建立了檢測(cè)特異性抗體的蛋白芯片法與高通量操作安全的基于假病毒的體外微量中和檢測(cè)法[28-29]。對(duì)于難培養(yǎng)或高致病性的人冠狀病毒感染，建立基于假病毒的體外中和抗體檢測(cè)方法，不僅可敏感、特異、高通量檢測(cè)中和抗體[15-16,29-30]，因其不需要在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中完成，還非常適合大范圍的血清流行病學(xué)研究，同時(shí)可以使我們更好地理解MERSCoV的生態(tài)學(xué)和流行病學(xué)[29,31]。

2.2 抗原檢測(cè)

人冠狀病毒抗原檢測(cè)主要針對(duì)人冠狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，通過(guò)制備基于結(jié)構(gòu)蛋白的單抗或多抗，采用特異的雙抗體夾心技術(shù)檢測(cè)血清中相應(yīng)抗原的含量，目前報(bào)道多為檢測(cè)SARS-CoV的N抗原[32-41]。2004年國(guó)內(nèi)學(xué)者車小燕篩選制備了多株SARSCoV N蛋白特異的單抗，并建立了通過(guò)檢測(cè)血清中N抗原早期診斷SARS-CoV感染的ELISA檢測(cè)試劑盒，在臨床得到廣泛應(yīng)用[33-34]。Shin等運(yùn)用昆蟲細(xì)胞表達(dá)的SARS-CoV N蛋白制備了17種單抗，篩選了3種針對(duì)N端的單抗和2種針對(duì)C端的單抗，發(fā)現(xiàn)它們與其他人冠狀病毒的N蛋白沒(méi)有交叉反應(yīng)，證實(shí)這些單抗對(duì)SARS-CoV臨床診斷試劑盒的開發(fā)很有價(jià)值[32]?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)冠狀病毒抗原，可以快速、敏感地檢測(cè)到2 pg/mL濃度以下的目的蛋白。Fujimo?to等制備了與化學(xué)發(fā)光相結(jié)合的單抗，檢測(cè)SARS病人鼻咽抽取液中的N蛋白，發(fā)現(xiàn)它們與普通冠狀病毒（229E、NL63、OC43）的重組N蛋白沒(méi)有交叉反應(yīng)，與感染229E、NL63、OC43的溶解產(chǎn)物均沒(méi)有交叉反應(yīng)。作者同時(shí)檢測(cè)了18份陽(yáng)性標(biāo)本和20份陰性標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)其敏感性和特異性均達(dá)到100%，遠(yuǎn)高于以前的ELISA和RT-PCR檢測(cè)技術(shù)[35]。近期Kammila等建立了一種針對(duì)SARS-CoV N蛋白的雙功能單抗和雞多抗的Immunoswab方法，可在40～60 min發(fā)現(xiàn)病人體液中的N蛋白，是一種非常實(shí)用的方法[36]。Palaniyappan等將在大腸桿菌中表達(dá)的SARS-CoV全長(zhǎng)N蛋白制備出鼠單抗和雞多抗，結(jié)果顯示2種針對(duì)N蛋白的抗體都很敏感，最重要的是使用雞多抗不僅在檢測(cè)抗原方面非常敏感，而且價(jià)格很便宜，是一種具有開發(fā)前景的診斷試劑[37]。最近也有學(xué)者報(bào)道了通過(guò)建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)抗原的方法，可鑒別診斷2種常見Ⅰ型人冠狀病毒（HCoVNL63與HCoV-229E）感染[38]。

除了雙抗體夾心ELISA方法外，近年來(lái)許多新的分子（核酸適配體）或電化學(xué)標(biāo)記技術(shù)也應(yīng)用于SARS-CoV N抗原的檢測(cè)，并呈現(xiàn)出超高靈敏度與自動(dòng)化檢測(cè)應(yīng)用前景[39-41]。此外，通過(guò)制備篩選S蛋白特異性單抗，也可建立靈敏特異地檢測(cè)SARSCoV S抗原的雙抗體夾心ELISA方法[42]。

3 結(jié)語(yǔ)

綜合上述進(jìn)展可以看出，自2003年SARS暴發(fā)至今，通過(guò)各國(guó)科學(xué)家的積極努力，人冠狀病毒在血清學(xué)方面的研究在近幾年已獲得了眾多進(jìn)展，尤其是目前SARS-CoV感染的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)比較成熟，已建立試劑評(píng)價(jià)的血清盤[43]，相關(guān)診斷試劑盒已批準(zhǔn)上市并已得到廣泛應(yīng)用。但其他人冠狀病毒（如新發(fā)的MERS-CoV）感染的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)仍在發(fā)展與應(yīng)用評(píng)價(jià)中，主要的瓶頸是缺乏合適的血清標(biāo)準(zhǔn)品，有很多血清學(xué)應(yīng)答特點(diǎn)（抗原的選擇與優(yōu)化，血清抗體交叉反應(yīng)等）還需要深入研究。為有效防控近期新發(fā)的MERS-CoV的感染傳播，盡快建立檢測(cè)MERS-CoV感染的抗體、抗原等血清學(xué)檢測(cè)方法，并對(duì)MERS-CoV的中和抗體進(jìn)行深入研究，已成為目前人冠狀病毒研究領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。

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