蛋白質(zhì)組學(xué)在疾病研究中的應(yīng)用

林虹君，張愛紅，李高偉，吉會海，周學(xué)志

1.空軍防化大隊，北京 102206；2.防化學(xué)院，北京 102205

1984年Wilkins和Williams首先提出蛋白質(zhì)組（proteome）的概念[1]，即一個基因組在特定時刻表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）是一門以蛋白質(zhì)組為研究對象，以全面的蛋白質(zhì)性質(zhì)研究為基礎(chǔ)，在蛋白質(zhì)水平對疾病機(jī)理、細(xì)胞模式、功能聯(lián)系等方面進(jìn)行探討的科學(xué)。目前蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要依賴三大技術(shù)：蛋白質(zhì)分離技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)及主要技術(shù)

1.1 雙向凝膠電泳技術(shù)（two dimensional polyacryl?amide gel electrophoresis，2D-PAGE）[2]

2D技術(shù)是目前蛋白質(zhì)分離的主要技術(shù)。第一向電泳利用固相pH值梯度（immobilized pH gradi?ent，IPG）膠條進(jìn)行等電點聚焦電泳，將不同等電點的蛋白質(zhì)分離；第二向在第一向的垂直方向進(jìn)行SDS-PAGE，從而將蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點和相對分子質(zhì)量的差異在凝膠上分離成獨立的蛋白質(zhì)點。為避免不同凝膠之間的差異對結(jié)果分析帶來的困難，發(fā)展了差異凝膠電泳技術(shù)（differential in-gel elec?trophoresis），將不同蛋白樣品用不同激發(fā)波長的熒光標(biāo)記后，在同一塊膠上進(jìn)行分離，保證了實驗條件的一致性，有利于差異表達(dá)點的篩選。

1.2 質(zhì)譜技術(shù)（mass spectrometry，MS）[3-4]

質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)。將感興趣的蛋白質(zhì)點從凝膠上切下后，進(jìn)行膠內(nèi)酶切，將蛋白質(zhì)降解為多肽片段，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）或電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）技術(shù)使樣品分子離子化，根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比（m/z）的差異來分離并確定相對分子質(zhì)量。在蛋白質(zhì)組學(xué)中，目前最為常用的質(zhì)譜分析系統(tǒng)包括兩大類，即以單一質(zhì)譜為基礎(chǔ)的和以串聯(lián)質(zhì)譜為基礎(chǔ)的。以單一質(zhì)譜為基礎(chǔ)的質(zhì)譜分析系統(tǒng)以MALDI-TOF MS為代表，串聯(lián)質(zhì)譜以ESI-MS MS為代表。

MALDI-TOF MS[5-7]是將作為離子源的MALDI和分析檢測飛行時間質(zhì)譜連用。用一定波長的激光打在樣品上，使樣品離子化，然后在電場力作用下飛行，通過檢測離子的飛行時間計算出其質(zhì)量電荷比，從而得到一系列酶解肽段的分子質(zhì)量或部分肽序列等數(shù)據(jù)，最后通過相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫搜索來鑒定蛋白質(zhì)。該技術(shù)精度高、分析時間短，可同時處理許多樣品，是高通量鑒定的首選方法，常用于蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜（peptide mass fingerprinting，PMF）鑒定。ESI-MS MS[8-10]是在噴射過程中利用電場完成多肽樣品的離子化，離子化的肽段轉(zhuǎn)移進(jìn)入質(zhì)量分析儀，根據(jù)不同離子的質(zhì)荷比差異分離，并確定分子質(zhì)量。用此法分析肽混合物、鑒定蛋白質(zhì)時，可對每一肽段進(jìn)行序列分析，綜合MS數(shù)據(jù)鑒定蛋白質(zhì)，大大提高了鑒定的準(zhǔn)確度。ESI-MS MS可檢測出飛摩爾（fmol）數(shù)量級的樣品，精確度可達(dá)0.005%。質(zhì)譜還可用于翻譯后修飾分析，如磷酸化、糖基化等。

1.3 生物信息學(xué)（bioinformatics）

生物信息學(xué)是生物學(xué)與計算機(jī)技術(shù)、應(yīng)用數(shù)學(xué)、網(wǎng)絡(luò)技術(shù)等結(jié)合建構(gòu)起來的一門新興學(xué)科[11-12]。它將大量系統(tǒng)的生物學(xué)數(shù)據(jù)與數(shù)學(xué)和計算機(jī)科學(xué)的分析理論和實用工具聯(lián)系起來，通過對生物學(xué)實驗數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲、檢索與分析，達(dá)到解釋數(shù)據(jù)所蘊含的生物學(xué)意義的目的。生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的作用主要有兩個方面：一是分析和構(gòu)建雙向電泳數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)；二是搜索與構(gòu)建蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。隨著蛋白質(zhì)組研究的推廣，全球建立的與蛋白質(zhì)相關(guān)的數(shù)據(jù)越來越多。已經(jīng)建立的如Medline、PDB等數(shù)據(jù)庫，包括了人血漿、尿液、腦脊液、正常組織和腫瘤組織及各種微生物的蛋白質(zhì)圖譜。生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的重要組成部分，Swissprot是世界上使用最廣泛的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，能提供多種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，如蛋白質(zhì)功能、結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾等。質(zhì)譜鑒定得到的有關(guān)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，可以通過軟件在數(shù)據(jù)庫中查找匹配的可能蛋白質(zhì)。

2 蛋白質(zhì)組在疾病研究中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展對于疾病的研究非常及時，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究將直接闡明疾病在生理或病理條件下的變化機(jī)制。

2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在心血管疾病研究中的應(yīng)用[13]

心臟蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要涉及心肌病、心臟衰竭、心肌缺血、慢性應(yīng)激、心臟衰老等。心肌病尤其是擴(kuò)張型心肌病蛋白質(zhì)組學(xué)研究最受關(guān)注，主要是分析病變心肌與正常心肌組織或細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組，包括肌球蛋白輕鏈2（MLC2）、結(jié)合蛋白等細(xì)胞骨架蛋白，ATP合成酶、肌酸激酶、泛素C端水解酶等與線粒體能量產(chǎn)生相關(guān)蛋白，及熱激蛋白HSP60、HSP70等應(yīng)激相關(guān)蛋白。對心肌缺血保護(hù)機(jī)制的研究主要集中于對蛋白激酶C（PKC）功能蛋白質(zhì)組學(xué)的探討。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究心臟衰老保護(hù)機(jī)制的性別差異，發(fā)現(xiàn)心臟中糖酵解和線粒體的代謝改變可能是心肌衰老的機(jī)制。慢性抑制應(yīng)激狀態(tài)可誘發(fā)心功能不全及心肌病，應(yīng)用2DE-MS探討與應(yīng)激損傷有關(guān)的線粒體蛋白，發(fā)現(xiàn)慢性抑制應(yīng)激狀態(tài)的心肌線粒體與對照組相比有11個差異蛋白點，鑒定出5個蛋白表達(dá)減少，且與Krebs循環(huán)和脂質(zhì)代謝有關(guān)。

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在肝病研究中的應(yīng)用[14-16]

由于蛋白質(zhì)組學(xué)研究更接近生命現(xiàn)象的本質(zhì)，并在藥靶研究中具有潛在價值，所以已被廣泛用于疾病相關(guān)研究。在肝臟研究領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學(xué)可用來研究肝臟的生理與病理、肝臟發(fā)育及肝臟疾病等，主要肝臟疾病包括肝臟腫瘤，肝硬化，毒、藥物肝損傷等。肝硬化是一種或多種病因長期或反復(fù)作用造成的彌漫性肝臟損傷，其中肝星狀細(xì)胞的活化是啟動肝纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。受損的肝細(xì)胞、鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞和血小板都可激活肝星狀細(xì)胞，促其合成大量細(xì)胞外基質(zhì)。因此，肝星狀細(xì)胞也成為肝硬化相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的目標(biāo)。Kawada等通過對大鼠星狀細(xì)胞的蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)了一種新蛋白STAP（stellate cellactivationassosiated protein），它只在星狀細(xì)胞中被檢測到，在纖維化肝中分離到的體內(nèi)激活星狀細(xì)胞和體外原代培養(yǎng)的活化星狀細(xì)胞中高表達(dá)，可能通過清除過氧化物發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

Kristensen等對比了靜態(tài)和激活的大鼠肝星狀細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有27種蛋白在體內(nèi)和體外激活的星狀細(xì)胞中都有相同表達(dá)變化，其中鈣周期蛋白、calgizza?rin、半乳糖凝集素1上調(diào)，肝羧酸酯酶10、絲氨酸蛋白酶抑制物3下調(diào)，還列出了150余種星狀細(xì)胞蛋白，從而加深了在蛋白質(zhì)水平對星狀細(xì)胞活化這一肝纖維化關(guān)鍵事件的認(rèn)識。隨著肝臟疾病蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，將會不斷產(chǎn)生新的和更權(quán)威的具有診斷潛能的生物分子靶標(biāo)，通過分析和監(jiān)視相應(yīng)蛋白質(zhì)的變化，能及時掌握患者病程特點和進(jìn)展趨勢，對于患者的個體化治療具有重要價值；更有意義的是，早期發(fā)現(xiàn)這些預(yù)警分子不僅有助于臨床診斷治療肝臟疾病，甚至可以發(fā)現(xiàn)患病的高危人群，及早采取相應(yīng)措施，從而做到防患于未然。

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)在胰腺疾病研究中的應(yīng)用[17]

胰腺疾病的發(fā)生是機(jī)體正常細(xì)胞在多因素、多基因作用下發(fā)生轉(zhuǎn)變的結(jié)果。在這一病變過程中，環(huán)境因素或遺傳因素最終都必須通過基因及其相應(yīng)的蛋白質(zhì)發(fā)揮作用。在人類基因組計劃的推動下，人們在基因水平對胰腺的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行了廣泛研究，但基因的功能活動最終靠蛋白質(zhì)體現(xiàn)。蛋白質(zhì)組學(xué)在胰腺疾病研究中常用的樣品為胰腺組織、胰液及血清。樣品處理的好壞是雙向電泳及質(zhì)譜分析成功與否的關(guān)鍵，也是影響分辨率及重復(fù)性的主要因素。胰腺是體內(nèi)含各種蛋白酶最豐富的組織，因此，胰腺組織中的蛋白質(zhì)組分比其他組織更容易被蛋白酶降解，樣品處理涉及到溶解、變性和還原，從而能去除蛋白質(zhì)之間的相互作用。標(biāo)本的采集從活體到離體的時間應(yīng)盡量短，然后立即置于液氮中或含有蛋白酶抑制劑的緩沖液中。蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解作用很強(qiáng)，并能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾，易使圖譜中蛋白質(zhì)點的數(shù)量和位置發(fā)生改變，因此使用足夠的蛋白酶抑制劑，可使蛋白酶對蛋白質(zhì)的水解作用的影響減小到最低程度，蛋白酶抑制劑含量比處理其他組織略多，這是保證胰腺蛋白質(zhì)組分穩(wěn)定的關(guān)鍵步驟。采用2-DE和MALDI-TOF MS測定人體正常胰腺組織蛋白質(zhì)，共檢測出302種蛋白質(zhì)，其中27%為具有催化活性與代謝相關(guān)的酶類，19%是結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架蛋白，11%是與氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì)，還包括5%熱激蛋白、5%核功能蛋白和4%信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白等。其中胰石蛋白、胰腺炎相關(guān)蛋白（PAP）僅在胰腺組織中表達(dá)，前者的功能與胰腺結(jié)石形成有關(guān)，PAP的功能不明。另外，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)蛋白的分析，胰腺的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能與GTP酶、穿膜受體蛋白、細(xì)胞間G蛋白、酪氨酸激酶系統(tǒng)等有關(guān)。對正常胰腺2-DE的蛋白質(zhì)譜分析，可對胰腺組織蛋白質(zhì)分析的條件進(jìn)行優(yōu)化，同時也為胰腺疾病的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供一定的基礎(chǔ)。

作為一種全新的研究手段，蛋白質(zhì)組學(xué)便于在更為全面完整的高度探討胰腺疾病的發(fā)病機(jī)理和治療機(jī)制，為胰腺疾病的早期診斷和有效治療提供有力的理論依據(jù)和新思路。但是，目前的研究方法還存在不足之處，如低豐度蛋白質(zhì)檢測的局限性、血清樣品大分子蛋白質(zhì)的有效去除、質(zhì)譜和數(shù)據(jù)搜索引擎尚不能完整考慮氨基酸的修飾，以及檢測費用昂貴等，這對蛋白質(zhì)研究提出了新的挑戰(zhàn)。

2.4 蛋白質(zhì)組學(xué)在自身免疫性疾病中的應(yīng)用[18]

自身免疫性疾病是機(jī)體對自身成分發(fā)生免疫應(yīng)答而導(dǎo)致的疾病狀態(tài)，可分為器官特異性自身免疫性疾病和全身性自身免疫性疾病。器官特異性自身免疫性疾病患者的病變局限于某一特定的器官，由對器官特異性抗原的免疫應(yīng)答引起。全身性自身免疫性疾病，又稱系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其病變可見于多種器官和組織。自身抗體和（或）自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的對自身成分發(fā)生的獲得性免疫應(yīng)答是自身免疫性疾病發(fā)生的原因。然而，在這些器官特異性和系統(tǒng)性自身免疫性疾病中，大多數(shù)疾病的發(fā)病機(jī)制還不十分清楚。蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)，為探討自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制提供了有力工具。

Ⅰ型糖尿病是一種器官特異性自身免疫性疾病，在遺傳易感性的基礎(chǔ)上，絕大部分胰島B細(xì)胞被自身免疫反應(yīng)所破壞，從而引起胰島素分泌不足與血糖升高。Ⅰ型糖尿病病因不明，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，可能與多種因素有關(guān)。Purohit等通過SELDITOF技術(shù)檢測Ⅰ型糖尿病患者和抗胰島細(xì)胞自身抗體陰性的健康者的血清樣本，利用單變量和多變量分析，試圖尋找Ⅰ型糖尿病的標(biāo)志物，共發(fā)現(xiàn)146個具有統(tǒng)計學(xué)差異的蛋白峰，為進(jìn)一步篩選Ⅰ型糖尿病的診斷生物標(biāo)志物提供了有力的基礎(chǔ)。復(fù)發(fā)性多發(fā)軟骨炎（RP）是一種全身性（系統(tǒng)性）炎癥疾病，發(fā)病機(jī)制不完全清楚，有學(xué)者認(rèn)為軟骨相關(guān)成分的自身免疫可能與疾病發(fā)病有關(guān)。Tanaka等應(yīng)用2-DE免疫印跡聯(lián)合質(zhì)譜的方法，用細(xì)胞提取蛋白作為抗原來源，檢測到15種自身抗原，并進(jìn)一步鑒定了其中的5種，這5種自身抗原相對自身抗體出現(xiàn)的頻率依次是微管素α/6為91%、波形蛋白為46%、α-烯醇化酶為36%、鈣網(wǎng)織蛋白為82%、膠原蛋白1/2為36%。數(shù)據(jù)顯示，自身免疫反應(yīng)并不受軟骨相關(guān)成分的束縛，更準(zhǔn)確地說，在RP中有多種自身免疫反應(yīng)發(fā)生，進(jìn)一步探討了RP發(fā)病機(jī)制的原因。

蛋白質(zhì)組學(xué)以其深入揭示疾病狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)所有蛋白質(zhì)表達(dá)規(guī)律的優(yōu)勢，在闡明自身免疫性疾病的特異抗原、抗體和分子機(jī)制方面表現(xiàn)出極大的潛力。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的日趨完善，現(xiàn)行的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)必然向功能蛋白質(zhì)組學(xué)過渡，為自身免疫性疾病的早期診斷、新藥研發(fā)及疾病康復(fù)開辟新的思路。

3 結(jié)語

蛋白質(zhì)組學(xué)是一門在蛋白質(zhì)分子水平認(rèn)識生命機(jī)制的新興學(xué)科，目前它的許多理論和技術(shù)還處于實驗室探索階段，但已顯示出可喜的應(yīng)用前景。功能蛋白質(zhì)組研究在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用具有巨大的潛力，在生物制藥領(lǐng)域中也具有難以估量的應(yīng)用前景?？赡茉诓贿h(yuǎn)的將來，人類將能全面了解人類疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸機(jī)制，在揭示人類生命的奧秘方面獲得重大進(jìn)展。

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