依達(dá)拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞NF—κB和IL—6，IL—8表達(dá)及凋亡的影響

王媛媛+曹建+陳勤+等

1.南昌市第三醫(yī)院心內(nèi)科，江西南昌 330009；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，江西南昌 330006

[摘要] 目的 探討依達(dá)拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的影響及NF-κB和白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）表達(dá)。 方法 體外培養(yǎng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，用過氧化氫氧化應(yīng)激建立肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡細(xì)胞模型，將細(xì)胞分為對照組、過氧化氫組、依達(dá)拉奉-過氧化氫組。用MTT法檢測依達(dá)拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖能力的影響，流式細(xì)胞儀檢測依達(dá)拉奉對氧化應(yīng)激肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響，采用ELISA試劑盒及谷胱甘肽（GSH）、脂質(zhì)過氧化物（MDA）試劑盒檢測IL-6、IL-8及GSH、MDA含量，用Western-blot方法檢測氧化應(yīng)激肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中的NF-κB蛋白表達(dá)。 結(jié)果 依達(dá)拉奉-過氧化氫組細(xì)胞生長抑制率為（22.3±3.1）%，明顯低于過氧化氫組[（37.5±2.4）%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。依達(dá)拉奉-過氧化氫組MDA含量低于過氧化氫組，GSH含量高于過氧化氫組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。依達(dá)拉奉-過氧化氫組IL-6、IL-8含量低于過氧化氫組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。依達(dá)拉奉-過氧化氫組細(xì)胞凋亡率[（14.67±0.50）%]明顯低于過氧化氫組[（38.88±0.80）%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。過氧化氫+依達(dá)拉奉組NF-κB蛋白水平（2.106±0.012）低于過氧化氫組（4.216±0.127），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 依達(dá)拉奉具有抑制氧化應(yīng)激后所誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡、下調(diào)NF-kB和IL-6、IL-8表達(dá)的作用。

[關(guān)鍵詞] 依達(dá)拉奉；氧化應(yīng)激；核因子-κB；白介素-6；白介素-8；肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞；凋亡

[中圖分類號] R563 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）03（a）-0008-05

Effects of Edaravone on apoptosis and the expressions of NF-κB， IL-6， IL-8 in lung epithelial type Ⅱ cells

WANG Yuanyuan1 CAO Jian2 CHEN Qin1 OUYANG Xianguo1 SONG Guoliang1

1.Department of Cardiology， the Third Hospital of Nanchang City， Jiangxi Province， Nanchang 330009， China； 2.Department of Anesthesiology， the Second Affiliated Hospital of Nanchang University， Jiangxi Province， Nanchang 330006， China

[Abstract] Objective To explore the effects of Edaravone on apoptosis and the expressions of NF-κB， IL-6， IL-8 in lung epithelial type Ⅱ cells. Methods Lung epithelial type Ⅱ cells were cultured in vitro， the apoptosis of lung epithelial type Ⅱ cells model was established by hydrogen peroxid. Lung epithelial type Ⅱ cells were divided into three groups： control group， hydrogen peroxide group and edaravone-hydrogen peroxide group， lung epithelial type Ⅱ cells was treated by edaravone. The proliferation rate of lung epithelial type Ⅱ cells were detected by MTT； the apoptosis rate of lung epithelial type Ⅱ cells was determined though flow cytometry； the expression of IL-6， IL-8， GSH， MDA was detected by ELISA kit， GSH kit， MDA kit， the NF-κB protein expression after edaravone treatment was examined through Western-blot. Results Cell growth inhibition rate in edaravone-hydrogen peroxide group [（22.3±3.1） %] was lower than that in hydrogen peroxide group [（37.5±2.4） %]， the difference was statistically significant （P < 0.05）. MDA content in edaravone-hydrogen peroxide group was lower than that in hydrogen peroxide group， GSH content in edaravone-hydrogen peroxide group was higher than that in hydrogen peroxide group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. IL-6， IL-8 content in edaravone-hydrogen peroxide group was lower than that in hydrogen peroxide group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Cell apoptosis rate in edaravone-hydrogen peroxide group [（14.67±0.50） %] was lower than that in hydrogen peroxide group [（38.88±0.80） %]， the difference was statistically significant （P < 0.05）. NF-κB protein level in edaravone-hydrogen peroxide group （2.106±0.012） was lower than that in hydrogen peroxide group （4.216±0.127）， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Edaravone can inhibit lung epithelial type Ⅱ cells apoptosis against -oxidative stress and down-regulate the expressions of NF-κB and IL-6， IL-8.

[Key words] Edaravone； Oxidative stress； NF-κB； IL-6； IL-8； Lung epithelial type Ⅱ cells； Apoptosis

急性肺損傷發(fā)病過程中，細(xì)胞因子可能通過抑制炎癥細(xì)胞凋亡延長炎性反應(yīng)時間，促進肺泡上皮細(xì)胞凋亡而參與急性肺損傷的炎性反應(yīng)過程[1]。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞是肺部特異性細(xì)胞，可以分泌肺泡表面活性物質(zhì)，能降低肺泡表面張力，對穩(wěn)定肺泡形態(tài)有一定作用。Ⅱ型細(xì)胞又是肺泡的儲備細(xì)胞，當(dāng)肺上皮遭受損害，會導(dǎo)致其增生，它是急性肺損傷發(fā)病過程中的重要效應(yīng)細(xì)胞[2]。依達(dá)拉奉目前研究表明具有清除自由基，抑制氧化性應(yīng)激，抑制細(xì)胞凋亡，可用于治療氧化應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的神經(jīng)退行性疾病[3]。本研究通過建立氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡模型，探討依達(dá)拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的影響及其與炎癥因子的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI1640培養(yǎng)基HEPES，四氮唑藍(lán)（MTT），二甲基亞砜（DMSO）小牛血清（Gibico公司），IL-6，IL-8 ELISA試劑盒：武漢博士德公司。AnnexinⅤ-PI凋亡檢測試劑盒（北京寶賽生物技術(shù)有限公司），堿性磷酸酶（AP）顯色底物，anti-NF-κB，小鼠單抗辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG；anti-β-actin山羊單抗（SantaCruz產(chǎn)品）。依達(dá)拉奉（先聲藥業(yè)）。

1.2 人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)氧化應(yīng)激

人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞由南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科實驗室凍存。細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在5%CO2，37℃，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長，用0.25%的胰酶和0.02%EDTA（1∶1）消化傳代，用于實驗的細(xì)胞均處于指數(shù)生長期。根據(jù)文獻(xiàn)[4]報道方法，分別選用0.1、0.5、1.0 mmol/L過氧化氫（H2O2）處理肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞24 h。實驗分為對照組（無H2O2處理的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞）、過氧化氫處理的過氧化氫組及依達(dá)拉奉（20 μmol/L）-過氧化氫處理的依達(dá)拉奉-過氧化氫組。

1.3 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞體外生長活性的檢測（MTT法）及谷胱甘肽（GSH），脂質(zhì)過氧化物（MDA）含量測定

取指數(shù)生長期的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，分別用生理鹽水及各濃度過氧化氫（0.1、0.5、1.0 mmol/L）處理，采用0.25%胰蛋白酶消化，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)液做空白對照。以1×104/孔的密度接種于96孔板，每孔設(shè)3個復(fù)孔。觀察肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞貼壁后，加入20 μmol/L依達(dá)拉奉，置于孵箱（37℃，CO2）培養(yǎng)24、48、72 h。再加入MTT 20 μl顯色，吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO，震搖15 min溶解結(jié)晶，用酶聯(lián)免疫儀測490 nm處的吸光度（A490）值。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞生長抑制率=（1-實驗組平均A490值/對照組平均A490值）×100%。采用GSH試劑盒，MDA試劑盒檢測GSH、MDA含量。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗

人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞按1×104/孔接種于96孔板上，分為對照組、氧化應(yīng)激組、依達(dá)拉奉-過氧化氫組，培養(yǎng)結(jié)束后收集上清，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果對上清進行適當(dāng)稀釋，按ELISA試劑盒說明進行試驗。

1.5 AnnexinV-PI

雙標(biāo)記法分析肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡率。如上法收集氧化應(yīng)激組及藥物處理72 h后各組細(xì)胞，將細(xì)胞收獲后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，-20℃ 75%乙醇固定過夜，取出離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入10 g/L Rnase 37℃孵育15 min，再加入碘化丙錠（PI）染色30min，尼龍網(wǎng)過濾，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，采用CELIQUEST 軟件分析早期細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blot法檢測NF-κB蛋白水平

取對照組、過氧化氫組、依達(dá)拉奉-過氧化氫組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，收集上清液，考馬斯亮藍(lán)法進行擔(dān)保定量。SDS-PAGE分離樣品后電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，TBST常溫下封閉過夜后，分別加入anti-NF-κB小鼠單抗（一抗）、室溫下免疫沉淀1 h，加入辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG（二抗）2 h。洗膜，顯色。用Gel-ProAnalyzer分析軟件分析通道蛋白的灰度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 依達(dá)拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞生長增殖能力的影響

過氧化氫氧化應(yīng)激處理肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞后，過氧化氫組細(xì)胞生長抑制率為（37.5±2.4）%，明顯高于對照組的（3.8±0.8）%，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致細(xì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的增殖能力下降。依達(dá)拉奉干預(yù)后，依達(dá)拉奉-過氧化氫組細(xì)胞生長抑制率為（22.3±3.1）%，與過氧化氫組比較，細(xì)胞生長抑制率下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），細(xì)胞的增殖能力較前升高。提示依達(dá)拉奉-過氧化氫組可以改善氧化應(yīng)激對肺泡Ⅱ上皮細(xì)胞的細(xì)胞抑制，提高細(xì)胞增殖能力。見表1。

表1 各組肺泡II型上皮細(xì)胞抑制率比較（%，x±s）

注：對照組比較，*P < 0.01；與過氧化氫組比較，#P < 0.05

2.2 依達(dá)拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物、谷胱甘肽水平的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化的分解產(chǎn)物，是反映組織氧化損傷水平的指標(biāo)之一。GSH在細(xì)胞內(nèi)能清除過氧化物代謝產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，從而起到保護細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的作用。本實驗提示，過氧化氫處理后，與對照組比較，細(xì)胞產(chǎn)生MDA顯著增加，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），細(xì)胞在氧化應(yīng)激后，細(xì)胞損傷程度明顯增加。過氧化氫處理后，與對照組比較，GSH含量顯著下降，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），氧化應(yīng)激可以通過減少谷胱甘肽對細(xì)胞的保護作用引起細(xì)胞損傷。經(jīng)依達(dá)拉奉處理后，與過氧化氫組相比，MDA含量下降（P < 0.05），GSH含量升高（P < 0.05），提示依達(dá)拉奉可以通過增加谷胱甘肽含量，清除過氧化物代謝，從而減少細(xì)胞氧化損傷水平。見表2。

表2 各組脂質(zhì)過氧化物、谷胱甘肽水平比較（x±s，n = 6）

注：與對照組比較，*P < 0.01，與過氧化氫組比較，#P < 0.05；MDA：脂質(zhì)過氧化物；GSH：谷胱甘肽

2.3 依達(dá)拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞IL-6、IL-8含量的影響

對照組IL-6、IL-8含量較低，過氧化氫組IL-6、IL-8表達(dá)升高，提示氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)炎癥因子IL-6、IL-8釋放。依達(dá)拉奉處理24 h后，可以減少炎癥因子表達(dá)，改善氧化應(yīng)激損傷，炎癥因子IL-6、IL-8含量下降，與過氧化氫組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

表3 依達(dá)拉奉對氧化應(yīng)激后肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌IL-6

和IL-8的影響（ng/L，n = 6，x±s）

注：對照組比較，*P < 0.01；與過氧化氫組比較，#P < 0.05；IL-6：白介素-6；IL-8：白介素-8

2.4 依達(dá)拉奉對氧化應(yīng)激后肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡率的影響

通過流式細(xì)胞儀檢測，對照組、過氧化氫組、過氧化氫-依達(dá)拉奉組細(xì)胞的凋亡率分別為（4.97±0.40）%、（38.88±0.80）%、（14.67±0.50）%，氧化應(yīng)激對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞損傷，細(xì)胞凋亡率明顯增加，在依達(dá)拉奉處理后，可以減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)和炎性反應(yīng)，減少細(xì)胞損傷，從而減少細(xì)胞凋亡。見表4。

表4 依達(dá)拉奉對氧化應(yīng)激后肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡率的影響（%，x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.01；與過氧化氫組比較，#P < 0.05

2.5 依達(dá)拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞細(xì)胞NF-κB蛋白水平的影響

過氧化氫處理建立氧化應(yīng)激模型后，NF-κB在細(xì)胞外刺激下被激活，過氧化氫組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞細(xì)胞NF-κB蛋白水平增高，與對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。依達(dá)拉奉干預(yù)后，過氧化氫-依達(dá)拉奉組NF-κB蛋白水平與過氧化氫組比較有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），可以抑制炎性反應(yīng)。見表5。

表5 各組細(xì)胞NF-κB蛋白水平的影響（x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.01；與過氧化氫組比較，#P < 0.05

3 討論

目前認(rèn)為，急性肺損傷是機體過度炎性反應(yīng)導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞廣泛破壞的結(jié)果。急性肺損傷時出現(xiàn)的表面活性物質(zhì)衰竭的共同的病理特點是肺泡的機械性損傷和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的過度凋亡[5]。

本研究通過氧化應(yīng)激建立肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡模型，通過MDA及GSH試劑盒檢測MDA、GSH水平，MDA是脂質(zhì)過氧化的分解產(chǎn)物，是反映組織氧化損傷水平的指標(biāo)之一。GSH在細(xì)胞內(nèi)能阻斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，從而起到保護細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的作用。近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡過程中具有還原性GSH耗竭現(xiàn)象，GSH水平與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。實驗發(fā)現(xiàn)過氧化氫處理后，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞GSH含量下降，MDA升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，細(xì)胞生長抑制率增加，細(xì)胞凋亡率升高。

NF-κB是一種重要的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等過程中起著重要的作用。NF-κB通常處于非激活狀態(tài)，當(dāng)受到細(xì)胞外刺激，在IKK酶的激活作用下磷酸化，啟動調(diào)節(jié)炎癥因子，本研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可激活NF-κB，誘導(dǎo)產(chǎn)生多種促炎癥細(xì)胞因子（如IL-6，TNF-α、IL-1、IL-8等）[6-7]，加重促炎性和抗炎癥細(xì)胞因子之間的失衡。

IL-8是中性粒細(xì)胞重要的趨化因子，是炎癥性疾病的重要介質(zhì)，在抗感染、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)以及抗腫瘤方面有重要作用。IL-8對特異性和非特異性的免疫細(xì)胞具有強烈的趨化作用，其中主要是對嗜中性粒細(xì)胞的趨化和激活作用，導(dǎo)致細(xì)胞變形反應(yīng)，釋放溶酶體，形成超氧化物，從而促進炎性反應(yīng)[8-9]，對淋巴細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞也有趨化作用。IL -6可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞的ICAM-1，并使內(nèi)皮表達(dá)E-選擇素，使中性粒細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，形成小栓子，導(dǎo)致微循環(huán)障礙[10-11]，還能促進中性粒細(xì)胞氧化反應(yīng)，從而使中性粒細(xì)胞在炎性反應(yīng)部位數(shù)量增多，延緩中性粒細(xì)胞的凋亡，超氧陰離子釋放增多，加重炎性反應(yīng)[12-13]。

本研究通過氧化應(yīng)激建立肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的凋亡模型，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時，炎癥因子IL-6、IL-8、NF-κB表達(dá)增高，而采用依達(dá)拉奉干預(yù)后，細(xì)胞凋亡減少，IL-6、IL-8、NF-κB表達(dá)下降。

由此推測，采用雙氧水對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞進行處理后，氧化應(yīng)激激活了NF-κB的表達(dá)，進而啟動了IL-6、IL-8等炎性因子的表達(dá)，從而導(dǎo)致一系列的炎性反應(yīng)和內(nèi)皮通透性增高，構(gòu)成了肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡的物質(zhì)基礎(chǔ)。

而依達(dá)拉奉是一種強效的新型羥自由基清除劑，經(jīng)單電子轉(zhuǎn)移作用清除自由基，通過自由基中間體轉(zhuǎn)化，變?yōu)榉€(wěn)定的氧化產(chǎn)物[14-15]?？梢詼p輕中性粒細(xì)胞浸潤及細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，抑制脂質(zhì)自由基生成，促炎細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)[16-17]。

因此依達(dá)拉奉干預(yù)后，不僅可以通過自由基清除功能減輕氧化應(yīng)激的作用，減少氧化應(yīng)激對NF-κB的活化影響，還有可能直接影響NF-κB、IL-6、IL-8的表達(dá)抑制炎性反應(yīng)的影響，減輕凋亡。此外，有研究證實，NF-κB上調(diào)可促進部分細(xì)胞存活基因和凋亡抑制基因表達(dá)，或活化持續(xù)性生長信號，從而保護細(xì)胞免于調(diào)亡[18-19]。本研究顯示，NF-κB下調(diào)，IL-6、IL-8表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞凋亡減少。提示肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡受炎癥因子的影響更加明顯，而NF-κB下調(diào)所致凋亡基因升高在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡處于次要地位，其具體機制還需要進一步深入研究。

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（收稿日期：2013-11-18 本文編輯：李繼翔）

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（收稿日期：2013-11-18 本文編輯：李繼翔）