健康人外周血煙曲霉硫氧還蛋白還原酶抗原特異性T淋巴細胞檢測與結果評價

史利寧，胡毓安，廖紅，韓雪，韓丹丹，李曉軍，李芳秋

0 引言

在惡性血液病、造血干細胞移植及器官移植患者中，由于存在免疫功能缺陷，侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis，IA)是感染死亡的主要原因之一［1］。長期使用皮質類固醇藥物和粒細胞缺乏癥是IA最主要的危險因素［2］?，F(xiàn)有的抗真菌藥物對IA的療效有限，且有較強的毒副作用;因此亟需開辟新的治療途徑，而以曲霉疫苗為基礎的預防接種法開始受到越來越多的重視［3］。

早期研究表明曲霉疫苗可在免疫抑制宿主中誘導出保護性免疫應答，從而降低宿主的死亡率。雖然曲霉疫苗保護作用的機制尚不清楚，但已證明T細胞免疫尤其是CD4+Th1型細胞免疫在控制曲霉感染中發(fā)揮了極其重要的作用［4］。因此，目前曲霉疫苗的研究主要是尋找可增強或激活Th1細胞免疫的曲霉保護性抗原。但到目前為止，已篩選鑒定的曲霉保護性抗原極少，且無成熟有效的曲霉疫苗可用于臨床。

本課題組在前期研究中篩選鑒定了一個新的強免疫反應性煙曲霉硫氧還蛋白還原酶GliT抗原(thioredoxin reductase GliT，TR)［5］。為評估煙曲霉TR蛋白是否具有保護性抗原的潛能，建立并優(yōu)化了檢測TR/抗原特異性T淋巴細胞(TR/AST)分泌干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)和白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)的ELISPOT方法，分析健康人在TR的刺激下產(chǎn)生免疫應答的類型，探討TR抗原特異性T淋巴細胞在IA中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取我院門診20名健康體檢者，男性12名，女性8名，年齡25～35歲。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(倫理批件號:2013GJJ-063)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器TR抗原由中心實驗科分子生物實驗室利用基因工程技術自制提?。?］，IFN-γ及IL-4 ELISPOT檢測試劑盒、EZ-Culture無血清培養(yǎng)基，Biosys Bioreader 4000 PRO斑點分析儀及分析軟件均為深圳市達科為生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要方法

1.3.1 外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分離采空腹靜脈血5～10 mL，無菌肝素抗凝，加等量等滲鹽水稀釋后加在淋巴細胞分離液上，800×g離心30 min，分離PBMC，用EZCulture液洗滌800×g 10 min離心2次，以EZ-Culture無血清培養(yǎng)液重懸并行細胞計數(shù)。

1.3.2 確定ELISPOT試驗條件隨機選擇2名健康人進行試驗，用方陣滴定法優(yōu)化ELISPOT反應條件。設定TR抗原終濃度為45，30，20，10，5μg/孔五個濃度，PBMC用量為1×106，3×105，1×105，3×104個/孔四個濃度。根據(jù)系列抗原濃度及PBMC用量獲得的IFN-γ陽性斑點形成細胞(spot forming cell，SFC)頻數(shù)結果，確定TR抗原的工作濃度及PBMC的用量。

1.3.3 特異性分泌IFN-γ SFC及IL-4 SFC的ELISPOT檢測無菌條件下使用ELISPOT板及相關試劑，具體實驗步驟如下:每孔加入200μL EZ-Culture無血清培養(yǎng)基，室溫靜置5～10 min后傾去。每孔加入100 μL 3×105PBMC，以10 μL TR抗原(10 μg/孔)作為特異性抗原刺激物，每份檢測標本設3個重復孔。同時設2個陽性對照孔、2個陰性對照孔、2個試劑對照孔，陰、陽性對照孔細胞濃度為每孔1×105細胞，試劑對照孔加EZ-Culture無血清培養(yǎng)基，陽性對照孔的刺激物為PHA/PMA，陰性對照孔的刺激物為無血清培養(yǎng)基。放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h。快速傾倒孔內細胞后，每孔加200μL 4℃預冷的去離子水，冰浴10 min低滲裂解細胞。傾去液體，每孔加250 μL磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗滌7次后在干凈紗布上拍干。每孔加100 μL相應的生物素標記抗體，于37℃孵育1h。PBST洗滌5次后，揭開板底的塑料保護層，用PBST沖洗。每孔加100 μL工作濃度酶標鏈霉親和素，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，最后每孔加100 μL現(xiàn)配的AEC顯色液，于室溫條件下避光靜置25 min顯色。用自來水洗滌3次以終止顯色反應。將板放置在室溫陰涼處晾干。用Biosys Bioreader 4000 PRO斑點分析儀計數(shù)特異性分泌細胞因子的陽性SFC頻數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學分析應用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，各組檢出的特異性分泌IFN-γ SFC和IL-4 SFC為非正態(tài)分布，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗;TR與其他曲霉保護性抗原特異性T淋巴細胞的比較用χ2檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ELISPOT試驗條件的確定健康人PBMC對不同量TR抗原刺激所產(chǎn)生的IFN-γ SFC頻數(shù)無明顯差異;在相同量TR抗原刺激下，產(chǎn)生的IFN-γ SFC頻數(shù)隨PBMC用量的減少而減少。根據(jù)方陣滴定法確定TR抗原的終濃度為10 μg/孔，PBMC用量為3×105/孔。在此條件下特異性分泌IFN-γ SFC頻數(shù)最優(yōu)，2名健康人的陽性SFC頻數(shù)分別為53個和143個。見圖1。

圖1 不同抗原濃度及PBMC用量獲得的IFN-γ SFC頻數(shù)結果Figure 1 Frequencies of IFN-γ spot－forming cells induced with different TR antigen concentrations and peripheral blood mononuclear cells(PBMC)

2.2 ELISPOT檢測T淋巴細胞特異性分泌IFN-γ SFC與IL-4 SFC的結果TR刺激后，健康人特異性分泌IFN-γ和IL-4的SFC頻數(shù)分別為15(3.5，59.5)個和0(0，0)個。IFN-γ的SFC頻數(shù)顯著高于IL-4(P＜0.001)，其中刺激后產(chǎn)生強IFN-γ應答(SFC≥20個)的健康人占45%(9/20)，而19名健康人在TR刺激后不產(chǎn)生IL-4應答，僅1名產(chǎn)生IL-4應答。見圖2。

圖2 20名健康人特異性分泌IFN-γ和IL-4的SFC頻數(shù)比較Figure 2 Frequencies of IFN-γ and IL-4 spot－formingcells(SFC)in the 20 healthy individuals

2.3 與文獻報道的曲霉保護性抗原的比較與文獻報道的曲霉保護性抗原Asp f3和Asp f9/16相比［4，7－8］，TR抗原刺激健康人PBMC所產(chǎn)生的強IFN-γ應答無顯著差異，但IL-4應答明顯低于Asp f3(P＜0.001)。見表1。

表1 TR與其他曲霉保護性抗原在誘導IFN-γ和IL-4免疫應答中的比較(n)Table 1 Comparison of TR and other Aspergillus protective antigens in inducing IFN-γ and IL-4 immune responses(n)

3 討論

IA的有效治療仍是目前臨床亟待解決的重要問題，而預防接種正成為IA治療的新手段，尋找高效的曲霉保護性抗原則是預防接種能否成功的關鍵。動物試驗表明在小鼠IA動物模型中Th1/Th2比例的失調及向Th2型免疫反應的轉變導致了IA的惡化及不良結局［9］。臨床試驗觀察在健康人群和發(fā)生IA后存活的患者中均發(fā)現(xiàn)了顯著的產(chǎn)生IFN-γ抗原特異性淋巴細胞增殖［9］，證實了Th1型免疫反應在控制曲霉感染中發(fā)揮了極其關鍵的作用［10］。

當T細胞受到某種抗原刺激時，針對該抗原的特異性T淋巴細胞就會活化，產(chǎn)生特定的細胞因子。ELISPOT技術可通過檢測其分泌特定細胞因子的SFC頻數(shù)來直觀地反映T細胞的免疫反應類型。本研究以煙曲霉TR為刺激物，觀察其刺激正常人外周血淋巴細胞后的免疫應答。結果顯示:TR刺激后可產(chǎn)生特異性T淋巴細胞的活化，主要表現(xiàn)為IFN-γ SFC頻數(shù)的明顯增加，而IL-4 SFC頻數(shù)幾乎為零，且45%的健康人表現(xiàn)為強IFN-γ應答。由此可見，健康人體內普遍存在TR特異性T細胞族群，可經(jīng)TR刺激后呈Th1優(yōu)勢狀態(tài)，該免疫反應可以提高機體對未來曲霉感染的防御能力，表明TR具有作為保護性抗原的潛能。由于不同的人對TR刺激后產(chǎn)生的免疫反應強度不一且差異較大，因此還需尋找其他方法，比如使用佐劑等來增強機體對TR抗原刺激的免疫效應，誘導機體產(chǎn)生有效的免疫保護反應。

文獻報道的煙曲霉保護性抗原有Asp f3和Asp f9/16等，其中最早檢測的是曲霉變應原Asp f9/16［7，11－13］。Bozza等［9］發(fā)現(xiàn)，在中性粒細胞缺乏癥小鼠模型中，鼻內接種重組Asp f9/16和佐劑CpG ODN可誘導抗煙曲霉感染的保護性應答。有研究證明重組Asp f3和截短Asp f3(去除了IgE結合位點)均可提高皮質類固醇免疫抑制小鼠在煙曲霉孢子肺感染中的存活率(40%)［11－13］。而Chaudhary等［4］用ELISPOT方法進一步證實，Asp f3和Asp f9/16可誘導健康人PBMC產(chǎn)生較強的Th1型免疫應答。與Asp f3和Asp f9/16相比，煙曲霉TR抗原也可刺激機體產(chǎn)生較強的Th1性應答，與前者無顯著差異;且TR幾乎不刺激機體產(chǎn)生Th2型應答，優(yōu)于Asp f3和Asp f9/16。這可能是因為Asp f3和Asp f9/16本身是煙曲霉變應原，能刺激機體產(chǎn)生過敏反應，而TR不屬于煙曲霉的變應原，過敏性肺曲霉病患者的血清中幾乎檢測不到抗TR的IgE型抗體［14］。

綜上所述，煙曲霉TR抗原可刺激機體淋巴細胞產(chǎn)生較強的Th1型應答且?guī)缀醪划a(chǎn)生Th2型應答，表明TR抗原具有作為保護性抗原的潛能;但仍需要進一步的研究來加以驗證。

［1］李芳秋.重新認識特異性抗體對侵襲性真菌病的診斷價值［J］.醫(yī)學研究生學報，2012，25(4):337-340.

［2］Kriengkauykiat J，Ito JI，Dadwal SS.Epidemiology and treatment approaches in management of invasive fungal infections［J］.Clin Epidemiol，2011，3:175-191.

［3］Ito JI，Lyons JM，Diaz-Arevalo D，et al.Vaccine progress［J］.Med Mycol，2009，47(Suppl 1):S394-S400.

［4］Chaudhary N.Staab JF，Marr KA.Healthy human t-cell responses to aspergillus fumigatus antigens［J］.PLoS One，2010，5(2):e9036.

［5］Shi LN，Li FQ，Huang M，et al.Immunoproteomics based identification of thioredoxin reductase GliT and novel Aspergillus fumigatus antigens for serologic diagnosis of invasive aspergillosis［J］.BMC Microbiol，2012，12(1):11.

［6］史利寧，邵世和，李芳秋，等.煙曲硫氧還蛋白還原酶重組蛋白的原核表達及抗原性分析［J］.臨床檢驗雜志，2011，29(8):599-601.

［7］Bellocchio S，Bozza S，Montagnoli C，et al.Immunity to aspergillus fumigatus:the basis for immunotherapy and vaccination［J］.Med Mycol，2005，43(Suppl 1):S181-S188.

［8］Cenci E，Mencacci A，Bacci A，et al.T cell vaccination in mice with invasive pulmonary aspergillosis［J］.J Immunol，2000，165(1):381-388.

［9］Bozza S，Gaziano R，Lipford GB，et al.Vaccination of mice against invasive aspergillosis with recombinant Aspergillus proteins and CpG oligodeoxynucleotides as adjuvants［J］.Microbes Infect，2002，4(13):1281-1290.

［10］盧鑫，孫文逵，吳曉東，等.氣管插管法建立免疫抑制小鼠侵襲性肺曲霉病模型［J］.醫(yī)學研究生學報，2012，25(4):344-347.

［11］Ito JI，Lyons JM，Hong TB，et al.Vaccinations with recombinant variants of Aspergillus fumigatus allergen Asp f 3 protect mice against invasive aspergillosis［J］.Infect Immun，2006，74(9):5075-5084.

［12］Diaz-Arevalo D，Bagramyan K，Hong TB，et al.CD4+T cells mediate the protective effect of the recombinant Asp f3-based anti-aspergillosis vaccine［J］.Infect Immun，2011，79(6):2257-2266.

［13］Diaz-Arevalo D，Ito JI，Kalkum M.Protective effector cells of the recombinant asp f3 Anti-Aspergillosis vaccine［J］.Front Microbiol，2012，3:299.

［14］Kumar A，Ahmed R，Singh PK，et al.Identification of virulence factors and diagnostic markers using immunosecretome of Aspergillus fumigatus［J］.J Proteomics，2011，74(7):1104-1112.