慢性傷口細菌生物膜的臨床識別和影響因素的研究進展

徐元玲綜述，王建東，蔣琪霞審校

0 引 言

慢性傷口因持續(xù)時間長、影響因素多而易發(fā)感染甚至形成難以處理的細菌生物膜，增加了治療難度，影響愈合效果［1］。臨床多見于壓瘡、糖尿病足潰瘍、下肢動靜脈潰瘍等慢性傷口［2］。如何識別細菌生物膜及其病原菌是臨床有效干預(yù)的前提，文中就慢性傷口細菌生物膜的臨床識別和生物膜形成的影響因素進行綜述。

1 慢性傷口細菌生物膜臨床識別

1.1 細菌生物膜感染的檢測識別技術(shù) 慢性傷口細菌生物膜就是細菌附于傷口床，與自身分泌的細胞外基質(zhì)成分相互融合形成的一種膜狀組織［1］。由于其結(jié)構(gòu)微小，肉眼難以識別，臨床上通常使用細菌培養(yǎng)來檢測傷口中存在的細菌。細菌培養(yǎng)對診斷急性傷口感染相當(dāng)準(zhǔn)確，但對于細菌生物膜引發(fā)的慢性感染的診斷卻并不可靠［3］。傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)取樣用無菌拭子擦拭傷口床獲取分泌物樣本，由于細菌定植部位的隱蔽性，大量厭氧菌隱藏于傷口深部組織，無菌拭子并不能充分全面地觸及傷口基底，因此培養(yǎng)結(jié)果通常無法發(fā)現(xiàn)厭氧菌存在［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，在生物膜感染病例中，陰性培養(yǎng)結(jié)果常與明顯的感染癥狀和體征不符，造成這一現(xiàn)象的原因可能與樣本取材不充分、培養(yǎng)時間不長或培養(yǎng)基中養(yǎng)分缺乏有關(guān)［5］。此外，細菌培養(yǎng)是采用實驗技術(shù)方法使細菌生長繁殖，培養(yǎng)過程中易受污染，且耗時長、特異性差、敏感度低，易導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果，所以傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)技術(shù)常會低估慢性傷口中細菌數(shù)量和種類。為提高慢性感染性疾病生物膜內(nèi)細菌的檢出率，現(xiàn)已發(fā)展出一些新的檢測手段，如聚合酶鏈反應(yīng)、熒光原位雜交技術(shù)、變性梯度凝膠電泳及16S核糖體核糖核酸序列分析等分子生物技術(shù)［6］。這些技術(shù)主要是對細菌染色體或染色體外的DNA片段進行分析，從遺傳進化的角度和分子水平進行細菌分類鑒定，從而使細菌分類更科學(xué)、更精確，特別是分子技術(shù)花費時間短，通常24h即能反饋細菌培養(yǎng)結(jié)果，為臨床有針對性的傷口干預(yù)措施提供有效證據(jù)。另有研究發(fā)現(xiàn)，通過傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法和革蘭氏染色法在分泌性中耳炎患者耳腔中檢測到的細菌陽性率低于30%，而使用分子生物技術(shù)檢測陽性率則高達90%以上［7］。因此，分子生物技術(shù)的發(fā)展大大提高識別菌膜感染的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。

1.2 細菌生物膜感染的實驗和臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 細菌生物膜感染的實驗診斷標(biāo)準(zhǔn) Parsek等［8］提出了通過檢測臨床相關(guān)標(biāo)本診斷生物膜感染的Parsek-Singh實驗診斷標(biāo)準(zhǔn)，具體包括:①與傷口表面相關(guān)的細菌感染;②獲取的傷口組織病理檢查見細菌聚集并包被于基質(zhì)中;③感染局限于宿主的某一特定部位，伴或不伴全身感染;④細菌對敏感抗生素產(chǎn)生耐藥性?；谏锬じ腥镜目股啬退幪匦院涂顾拗髅庖叻磻?yīng)的特性，Stoodley等［9］在2008年建議對上述生物膜感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)作如下2點補充:①應(yīng)用細菌直接活力染色法結(jié)合分子診斷學(xué)技術(shù)如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或熒光原位雜交技術(shù)證實有活性細菌聚集物的存在;②宿主組織中散在分布有細菌聚集群(大菌落)并伴炎性細胞浸潤，證明宿主無有效清除細菌的能力。

1.2.2 細菌生物膜感染的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn) 既往研究報道，細菌生物膜感染病例的臨床特征包括:蒼白的傷口床，黃色滲液，壞死組織，清亮組織液，有腐臭味，脆弱的肉芽組織及細菌培養(yǎng)結(jié)果［10］。通常當(dāng)傷口出現(xiàn)上述特征之一時，建議在嚴(yán)格無菌操作下取組織活檢或行細菌培養(yǎng)，再使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到包裹在細菌表面的胞外多糖物質(zhì)，這是診斷生物膜存在的重要陽性特征［11］。目前對可疑病例采用分子技術(shù)準(zhǔn)確快速識別傷口中的細菌生物膜已成為研究熱點。未來需要根據(jù)臨床表現(xiàn)結(jié)合實驗結(jié)果，制定更為明確可行的細菌生物膜診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 慢性傷口細菌生物膜中的細菌識別結(jié)果 慢性傷口細菌生物膜中細菌種類繁多，通常有3～10種占主導(dǎo)地位的微生物，另有數(shù)以百計的其他不同類微生物，且不同類型的慢性傷口，其細菌生物膜內(nèi)所含細菌亦不相同［12］。

過往研究對不同類型的慢性傷口提取標(biāo)本，使用細菌標(biāo)記的焦磷酸擴增測序法(Bacterial tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing，bTEFAP)檢測和總結(jié)出傷口生物膜中的細菌種類和分布規(guī)律［12］。Dowd等［12］在2008年收集了40例不同糖尿病足潰瘍患者傷口清創(chuàng)物質(zhì)的標(biāo)本，通過提取DNA，使用bTEFAP技術(shù)檢測觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)棒桿菌屬最常見的厭氧菌，其它細菌包括沙雷氏菌、鏈球菌、金葡菌及腸球菌等。Wolcott等［13］在2009年觀察了40例慢性下肢靜脈性潰瘍生物膜中的細菌分布，主要為金黃葡萄球菌、鏈球菌、假單胞菌、沙雷菌、棒狀桿菌屬、大腸埃希菌、凝固酶陰性的葡萄球菌、真菌和厭氧菌等，還有許多尚不知名的細菌，其中 兼性厭氧菌占51%，專性厭氧菌占30%。Smith等［14］在2010年對49例壓瘡組織樣本進行檢測，主要為鏈球菌、棒桿菌屬、金黃色葡萄球菌、厭氧菌及假單胞菌等共212個菌屬，487個細菌種類，其中厭氧菌占31%，兼性厭氧菌占43%。

傷口感染是多種細菌共同作用的結(jié)果，特別是厭氧菌的存在，盡管數(shù)量微小，卻可能破壞傷口正常生理愈合機制［15－16］。因此，在臨床傷口處理中需要特別關(guān)注類如外口小內(nèi)腔大的壓瘡傷口、竇道等無氧環(huán)境下有無厭氧菌或兼性厭氧菌的生存，如有可疑，建議取深部組織送分子病理檢測，同時局部使用3%過氧化氫溶液沖洗，與局部充分作用后再用等滲鹽水二次沖洗，填充或覆蓋廣譜抗菌的銀敷料抑制其生長繁殖［17］，且每周至少跟蹤評價2次臨床效果，每2－3周跟蹤評價細菌檢測結(jié)果。

2 慢性細菌生物膜形成的影響因素

在傷口由急性轉(zhuǎn)為慢性的過程中，細菌受到各種因素影響，如極度營養(yǎng)缺乏或過剩、低pH值、高滲透壓、氧化、抗菌劑和抗生素使用等，這些因素與生物膜的形成與否密切相關(guān)。

2.1 pH值 體外實驗發(fā)現(xiàn)變異鏈球菌在pH=7.0時12～24h內(nèi)即可形成穩(wěn)定的生物膜，該生物膜還能抵抗pH=5.0的酸性環(huán)境［18］。還有細菌形成的生物膜能抵抗堿性環(huán)境，如糞腸球菌能在pH值為7～9的堿性環(huán)境中形成穩(wěn)定的生物膜［19］。但在過酸(pH＜5.0)和過堿(pH＞9.0)的環(huán)境中生物膜均不能生長［20］。生物膜有此特性可能與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，細菌生物膜是由細胞外基質(zhì)包裹的細菌群體相互粘附形成三維立體結(jié)構(gòu)，在這種狀態(tài)下，酸堿成分只對膜內(nèi)表層細菌有影響，而無法對深層細菌發(fā)揮作用［21－22］。其次，生物膜中營養(yǎng)成分的濃度由外向內(nèi)呈現(xiàn)梯度下降，致使深層細菌長期處于營養(yǎng)缺失狀態(tài)而生長緩慢，對酸堿的敏感性也降低，表層菌脫落后代謝產(chǎn)物的積聚也容易有效抵御酸堿的快速滲透。

傷口修復(fù)過程中肉芽組織生長需弱酸性環(huán)境，堿性環(huán)境不僅不利于肉芽組織生長，且有可能激活基質(zhì)金屬蛋白酶，造成傷口組織自噬。我們懷疑生物膜與肉芽生長的弱酸性環(huán)境相競爭，從而抑制肉芽組織的生長。有文獻報道，建議酸化菌膜定植的慢性傷口，營造適宜于肉芽組織生長又能控制菌膜的傷口pH微環(huán)境，促進傷口組織修復(fù)［23］。但需要更多臨床試驗證實傷口pH值與生物膜形成的相關(guān)性。

2.2 溫度 溫度也是影響細菌生物膜形成的一個重要因素。體外實驗發(fā)現(xiàn)隨著溫度的不斷升高，細菌生物膜形成速度加快，但超過40℃時穩(wěn)定性逐漸降低，30℃ ～35℃是細菌形成生物膜的合適溫度［20］。而此溫度又是傷口組織生長需要的適宜溫度，推測在溫度方面生物膜也與肉芽組織存在競爭性抑制。臨床上使用物理干預(yù)輔助治療傷口，如遠紅外線通過熱輻射效應(yīng)，能提升傷口溫度2℃ ～3℃(33℃ ～35℃)，可促進傷口局部血液循環(huán)達到消炎消腫，減輕疼痛的作用，還可促進膠原形成和成纖維細胞增殖而促進傷口愈合［24］。此結(jié)果引發(fā)思考:熱輻射提升傷口溫度后對生物膜形成有何影響?是否肉芽組織良好生長能夠抑制生物膜的生長?如果存在這種競爭性抑制，通過什么途徑調(diào)控?上述問題還有待進一步研究。

2.3 抗生素和疾病 抗生素治療細菌生物膜歷來存在爭議，有文獻報道，抗生素雖然可殺滅鏈球菌，但卻促進銅綠假單胞菌和沙雷菌等其他細菌形成生物膜，這些細菌定植于傷口的深層，抗生素難以發(fā)揮作用，導(dǎo)致細菌持續(xù)存在從而延緩傷口的愈合［25］。疾病也能影響細菌生物膜生存與否，如糖尿病患者傷口中的鏈球菌是非糖尿病的63倍［25］。

2.4 細菌基因蛋白改變對生物膜形成的影響 細菌間可利用結(jié)合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)進行基因交換，使浮游細菌有能力形成生物膜［26］。生物膜成熟過程中約35%基因表達發(fā)生改變，如銅綠假單胞菌生物膜的形成過程中蛋白發(fā)生變異的多達800余種，增加了臨床處理難度［27］。細菌定植部位也影響基因活性，銅綠假單胞菌定植部位距離傷口表面通常大于金黃色葡萄球菌，但通過分泌?；呓z氨酸和鼠李糖脂，可使機體激活巨噬細胞的能力減弱，中性粒細胞凋亡速度加快，且激活基質(zhì)金屬蛋白酶，產(chǎn)生對傷口組織的自噬作用從而影響傷口愈合［28］。生物膜中的細菌還可互相利用其優(yōu)點達到共生目的，金黃葡萄球菌利用白色念珠菌的菌絲穿透上皮層而達到黏附、入侵破壞組織的目的，兩者互相影響基因和蛋白的表達，共同促進形成生物膜，抵抗機體免疫和抗生素治療［29－30］。協(xié)同生長增加了生物膜的致病性，早期定植細菌的代謝產(chǎn)物可成為晚期定植細菌生存的基床，所以細菌生物膜結(jié)構(gòu)堅實穩(wěn)定，不易被破壞［31］。

3 結(jié) 語

目前關(guān)于傷口細菌生物膜的研究以體外研究為主，得到的大多為實驗數(shù)據(jù)，未來需要進一步在臨床實驗得到驗證，且患者個體差異性是否影響生物膜形成尚需進一步研究。此外，臨床在標(biāo)本收集，預(yù)處理及技術(shù)檢測分析等方面還有待于統(tǒng)一操作流程和加以規(guī)范，避免污染以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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