紅樹植物桐花樹葉片多酚提取物對酪氨酸酶活性抑制及抗自由基和抗菌活性分析

黃曉冬, 吳雅清, 許瑞安, 劉 嘉, 俞 愉, 蔡建秀

(1. 泉州師范學院 分子生物與藥物化學福建省高等學校重點實驗室, 福建 泉州 362000；2. 華僑大學 分子藥物教育部工程中心, 福建 泉州 362021)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1，tyrosinase)是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于動植物、真菌及微生物體內(nèi)[1]，是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶，具有獨特的雙重催化功能，能先后催化黑色素生成過程中的3個反應途徑：單酚(L-酪氨酸)的羥基化、二酚(L-多巴)的氧化及二羥基吲哚(DHI)的脫氫[2]。它首先催化L-酪氨酸羥基化形成L-多巴，再氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌經(jīng)一系列的酶促和非酶促反應生成中間體DHI，后者最終形成黑色素[2-4]。在人體內(nèi)，酪氨酸酶引起皮膚、眼和頭發(fā)等的黑化，但其異常過量表達可導致人體雀斑、黃褐斑與老年斑等色素沉著[5]；植物源食品包含的酪氨酸酶會引發(fā)不利的酶促褐變，使其營養(yǎng)質(zhì)量下降，并導致經(jīng)濟損失[6]；昆蟲表皮的酪氨酸酶催化產(chǎn)生的黑色素可以保護其免受紫外線輻射，酪氨酸酶還與昆蟲蛻皮過程中的鞣化作用有關(guān)，并影響昆蟲的免疫系統(tǒng)和生長[5,7]。因此，研發(fā)與應用酪氨酸酶抑制劑(tyrosinase inhibitors，TI)抑制酪氨酸酶活性，是防止果蔬褐變和色素沉著[8]、研制美白化妝品和生物源殺蟲劑[9]的一種重要途徑。

迄今，研究者發(fā)現(xiàn)了大量天然或合成的酪氨酸酶抑制劑[10]，但同時也發(fā)現(xiàn)一些酪氨酸酶抑制劑存在著黑色素細胞毒性與副作用[11]，比如氫醌的致敏作用[12]和曲酸的致癌作用[13]等。因此，許多學者致力于尋找和開發(fā)無毒、高效和特異性強的酪氨酸酶抑制劑。由于植物次生代謝產(chǎn)物種類多樣且含量較豐富，并具有多種生物活性且相對較安全，成為酪氨酸酶抑制劑篩選的主要來源與熱點。近年來的研究結(jié)果表明：植物來源的酪氨酸酶抑制劑涵蓋糖苷類、黃酮及多酚類和醛類等多種化學成分，其中，植物多酚(plant ployphenols)廣泛存在于植物體內(nèi)，含量僅次于纖維素、半纖維素與木質(zhì)素；其具有的1個或多個酚羥基能及時清除過氧自由基，進而可減弱酪氨酸的氧化作用，并且酚羥基還可能與酪氨酸酶分子中的Cu2+絡合而抑制該酶活性[14]。因而，植物多酚被普遍認為是理想的且有開發(fā)前景的酪氨酸酶抑制劑之一。據(jù)報道，從薔薇科(Rosaceae)李屬(PrunusLinn.)植物青梅(P.mumeSieb. et Zucc.)花中提取的多酚提取物[15]、從薔薇科蘋果屬(MalusMill.)植物蘋果(M.pumilaMill.)中純化的蘋果多酚[5]和茶多酚(TPP)[16]、從柿樹科(Ebenaceae)柿屬(DiospyrosLinn.)植物柿樹(D.kakiThunb.)中分離的多酚[17]、從?？?Moraceae)桑屬(MorusLinn.)植物魯桑〔M.lhou(Ser.) Koidz.〕中分離的多酚[18]等均具有酪氨酸酶抑制活性。

桐花樹〔Aegicerascorniculatum(Linn.) Blanco〕為紫金?？?Myrsinaceae)蠟燭果屬(AegicerasGaertn.)的紅樹植物，是紅樹林的廣布種之一，生于海邊灘涂上，為了適應海洋鹽生環(huán)境該種體內(nèi)富含單寧等多酚類化合物[19-20]。目前，對桐花樹多酚作為酪氨酸酶抑制劑的研究尚未見報道。作者以自然分布于泉州灣河口濕地的桐花樹葉片為實驗材料，初步制備桐花樹葉片多酚提取物，并研究該多酚提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用，同時測定其對DPPH·自由基的清除能力及對化妝品中常見腐敗菌的抑菌作用，以期為桐花樹葉片多酚提取物的開發(fā)應用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器和試劑

1.1.1 多酚提取物獲得和樣液配制 供試桐花樹葉片于2012年5月份采自福建泉州灣紅樹林濕地，洗凈去雜后用水蒸氣加熱2～5 min，使樣品中酚氧化酶PPO等喪失活性[20]；瀝干并陰干后磨成粉末，過60目篩；為去除葉綠素并脫脂和脫蠟，置于索氏提取器中用石油醚(30 ℃～60 ℃)提取至浸出液無色為止；自然揮發(fā)去除石油醚后，密封遮光冷藏(-20 ℃)備用。取處理后的桐花樹粉末按料液比(W∶V)1∶20的比例加入體積分數(shù)50%乙醇，于溫度70 ℃條件下超聲波(功率210 W、頻率80 kHz)輔助提取70 min，抽濾后的濾液即為多酚提取液。將提取液減壓濃縮(約50 ℃，-0.01 kPa)去醇至一定體積后， 按30 mL加 0.5 g的比例加入AlCl3，并用1 mol·L-1NaHCO3調(diào)節(jié)至pH 5.1～pH 6.0，靜置待多酚沉淀，離心；沉淀用0.5 mol·L-1HCl轉(zhuǎn)溶，再按照V∶V=1∶1的比例用乙酸乙酯萃取3次，每次5 min；合并乙酸乙酯萃取液并減壓蒸餾(40 ℃，-0.01 kPa)除去乙酸乙酯，殘渣干燥后即得多酚提取物，避光保存于-20 ℃，備用。

使用時用DMSO配成質(zhì)量濃度1.000 g·L-1母液，并稀釋成質(zhì)量濃度0.100～1.000 g·L-1的多酚提取物樣液Ⅰ，供酪氨酸酶活性抑制測定與自由基清除能力測定；另將多酚提取物預先用體積分數(shù)95%乙醇助溶，以無菌水稀釋配成2倍比濃度系列的樣液Ⅱ(12.5～100 g·L-1)，對應溶媒乙醇的體積分數(shù)為4.75%～38.00%,供抗菌活性測定；取一定量的多酚提取物，用體積分數(shù)70%乙醇溶解并定容至50 mL，作為供測樣液Ⅲ。

1.1.2 儀器和試劑 主要儀器：L5紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；PHB-4便攜式酸度計(上海偉業(yè)儀器廠)；TGL-10B高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；KQ-300VDE臺式雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

主要試劑：酪氨酸酶(1 680 U·mg-1，美國Worthington公司)，用50 mmol·L-1PBS配制成相應濃度；沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，純度89.9%，批號110831-201204)；槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所，純度97.3%，批號100081-200406)；左旋多巴(L-DOPA)(美國Sigma公司)；防腐劑布羅波爾Bronopol(日用化工級，廣州冠志化工有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 供試菌種 供試菌種大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)均由福建師范大學生物工程學院微生物教研組提供。

1.2 方法

1.2.1 多酚提取物中多酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu法[21]測定多酚含量。取0.2 mL樣液Ⅲ，加入1.0 mL蒸餾水和1.0 mL Folin酚試劑，漩渦振蕩，暗處放置8 min后加入1.0 mL質(zhì)量體積分數(shù)7.5%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至25 mL，充分混合，室溫靜置120 min顯色，于波長760 nm處測定吸光度值。按同法用沒食子酸對照品作標準曲線，1 g提取物中的多酚含量以沒食子酸當量(gallic acid equivalent，GAE)計。

1.2.2 多酚提取物抑制酪氨酸酶活性的測定 酪氨酸酶活性測定參照石嘉懌[15]的方法并略加修改。在總體積3.0 mL的酶活反應測定體系中，依次加入多酚提取物樣液Ⅰ 0.1 mL、200 U·mL-1酪氨酸酶溶液0.1 mL 和0.5 mmol·L-1L-DOPA底物溶液2.8 mL，充分混勻，37 ℃水浴保溫10 min后，于波長475 nm處測得樣液組吸光度值A3；以DMSO代替樣液Ⅰ，測得空白對照組吸光度值A1；以50 mmol·L-1PBS(pH 6.8)代替樣液Ⅰ和酪氨酸酶溶液，測得空白對照組背景吸光度值A2；以50 mmol·L-1PBS(pH 6.8)代替酪氨酸酶溶液，測得樣液組背景吸光度值A4。提取物對酪氨酸酶活性的抑制率(I)按下式計算：I=〔1-(A3-A4)/(A1-A2)〕×100%。以槲皮素為陽性對照，實驗重復3次。

在上述的酶活反應測定體系中，改變酪氨酸酶濃度([E]分別為25、50、100、150和200 U·mL-1)，分別測定質(zhì)量濃度0.000、0.650和0.950 g·L-1的多酚提取物樣液Ⅰ對不同濃度酪氨酸酶活性的影響，于波長475 nm處測定吸光度值，實驗重復3次。酪氨酸酶催化反應速率v以酶活反應測定體系反應終止后測得的吸光度值A475定量表征[22]。A475的計算公式為A475=A3-A4，其中，A3和A4分別是樣液組吸光度值和樣液組背景吸光度值。以酪氨酸酶濃度[E]為X軸、以A475為Y軸作圖，并依此判斷多酚提取物樣液對酪氨酸酶活性抑制作用的類型。

1.2.3 多酚提取物對酪氨酸酶活性抑制的動力學分析 上述酶活反應測定體系中，改變L-DOPA底物濃度([S]分別為0.200、0.250、0.333、0.500、1.000和2.000 mmol·L-1)，測定不同質(zhì)量濃度([I]分別為0.000、0.350和0.650 g·L-1)多酚提取物樣液Ⅰ對酪氨酸酶活性的影響，于波長475 nm處測定吸光度值，實驗重復3次。按上法表征酪氨酸酶催化反應的速率v。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法[23]79作圖，通過米氏常數(shù)Km和酶促反應最大速率vm的變化來判斷抑制類型。

1.2.4 多酚提取物對DPPH·自由基清除能力的測定 多酚提取物對DPPH·自由基清除能力的測定參照鐘瑞敏等[24]的方法并略加修改。分別取200 μL各濃度測試樣液Ⅰ，與0.06 mmol·L-1DPPH·甲醇溶液4 mL混勻，15 min后于波長517 nm處測得吸光度值AS；以200 μL甲醇代替樣液測得空白對照組吸光度值A0；考慮樣液本身的顏色，以甲醇代替DPPH·甲醇溶液測得樣液本底吸光度值AB；自由基清除率(D)的計算公式為：D=[1-(AS-AB)/A0]×100%。以槲皮素為陽性對照，DPPH·自由基清除能力以自由基清除率D與等量槲皮素(quercetin equivalent，QE)表示，實驗設3次重復。

1.2.5 多酚提取物抗菌活性的測定 采用管碟法[25]測定抑菌圈直徑。用無菌移液槍分別吸取0.2 mL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌菌懸液(0.5×107CFU·mL-1)均勻涂布于平板(內(nèi)徑90 mm)表面，在每平板上等距離放入4只滅菌牛津杯(10.0 mm×7.8 mm×6.0 mm)，并在每個牛津杯中加入樣液Ⅱ 200 μL，以相應溶媒作空白對照；37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察并用游標卡尺測量抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑(d)評價抑菌效果，計算公式為：d=樣液抑制圈直徑-空白對照抑制圈直徑。實驗重復3次并計算平均值。

參照文獻[25]測定最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。用無菌移液槍吸取1.0 mL樣液Ⅱ，與15 mL無菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(溫度低于45 ℃)充分混勻，冷卻后制成含樣液平板，以相應溶媒作空白對照、Bronopol為陽性對照；吸取上述菌懸液0.1 mL均勻涂布于各平板上，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h后觀察3種細菌的生長狀況，以完全無細菌生長的最低樣液濃度作為最低抑菌濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

桐花樹葉片醇提取物和多酚提取物得率的計算公式分別為：醇提取物得率=醇提取物質(zhì)量/桐花樹葉片粉末質(zhì)量；多酚提取物得率=多酚提取物質(zhì)量/桐花樹葉片粉末質(zhì)量。

采用EXCEL 2003和SPSS Statistics V17.0等軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，采用EXCEL軟件作圖；實驗數(shù)據(jù)均為3次重復的平均值，采用獨立樣本t檢驗進行組間均值方差分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 桐花樹葉片多酚提取物的得率與多酚含量

經(jīng)超聲波輔助提取，桐花樹葉片醇提取物得率為(281.2±25.6) mg·g-1，醇提液經(jīng)金屬鹽沉淀、鹽酸轉(zhuǎn)溶沉淀和乙酸乙酯萃取后獲得多酚提取物，得率約為(122.0±31.4) mg·g-1，經(jīng)Folin-Ciocalteu法測得該多酚提取物中多酚含量為(521.8±17.2) mg·g-1。

2.2 桐花樹葉片多酚提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用分析

2.2.1 多酚提取物對酪氨酸酶活性的影響 桐花樹葉片多酚提取物和槲皮素對酪氨酸酶活性抑制率的量效關(guān)系見圖1。由圖1可見：多酚提取物和陽性對照槲皮素對酪氨酸酶活性的抑制率均隨其質(zhì)量濃度的提高而增大，呈明顯正相關(guān)的量效關(guān)系(R2分別為0.957 1和0.930 4)。質(zhì)量濃度0.950 g·L-1多酚提取物和槲皮素對酪氨酸酶活性的抑制率分別高達73.36%和82.17%，但二者差異不顯著(P>0.05)。根據(jù)二者的線性回歸方程獲得多酚提取物與槲皮素對酪氨酸酶活性的半抑制濃度(IC50)分別為0.650和0.600 g·L-1，提示桐花樹葉片多酚提取物和槲皮素對酪氨酸酶活性的抑制能力相近。

●: 多酚提取物Polyphenol extracts; ○: 槲皮素Quercetin.

2.2.2 多酚提取物對不同濃度酪氨酸酶活性的抑制作用 實驗結(jié)果顯示(圖2)：在底物濃度和桐花樹葉片多酚提取物質(zhì)量濃度不變的條件下，隨著酪氨酸酶濃度的提高，反應體系的吸光度值A475呈線性增加；而在底物濃度和酪氨酸酶濃度不變的情況下，A475隨多酚提取物質(zhì)量濃度的提高而下降。以A475對酪氨酸酶濃度[E]作圖可得3條通過原點的直線(圖2)，直線斜率隨提取物質(zhì)量濃度增加而下降，說明桐花樹葉片多酚提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用不是通過降低有效酶量而是通過降低酶活性實現(xiàn)的，表現(xiàn)為可逆性抑制作用。

○: 0.000 g·L-1多酚提取物 0.000 g·L-1 polyphenol extracts;

2.2.3 多酚提取物對酪氨酸酶活性的抑制動力學由Lineweaver-Burk方程(表1)可見：隨提取物質(zhì)量濃度的提高,米氏常數(shù)Km值增大、酶促反應最大速率vm值減小，這與混合Ⅰ型抑制類型的動力學特征相符，即桐花樹葉片多酚提取物既可以與游離酶(E)結(jié)合，也可以與酶-底物絡合物(ES)在非活性中心結(jié)合，導致酪氨酸酶活性降低。以1/v對1/[S]進行Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，得到1組相交于第二象限的直線(圖3-a)。進一步以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖的斜率與截距對相應的多酚提取物濃度二次作圖均呈直線(見圖3-b，c)。計算結(jié)果顯示：桐花樹葉片多酚提取物對游離酪氨酸酶活性的抑制常數(shù)Ki為0.833 g·L-1、對酶-底物絡合物的抑制常數(shù)Kis為1.823 g·L-1，Kis為Ki的2.19倍，說明桐花樹葉片多酚提取物與游離酶的親和力大于其與酶-底物絡合物的親和力。

表1 不同濃度桐花樹葉片多酚提取物對酪氨酸酶活性抑制作用的動力學參數(shù)1)

2.3 桐花樹葉片多酚提取物對DPPH·自由基的清除能力

自由基能上調(diào)酪氨酸酶mRNA的表達，抗氧化作用是酪氨酸酶抑制機制之一[26]。DPPH·自由基反應體系由于具有簡便、快速、重復性好等特點而廣泛應用于自由基清除劑的篩選及純抗氧化劑或植物提取物的體外抗氧化活性測定[27]。不同濃度桐花樹葉片多酚提取物對DPPH·自由基的清除作用見表2。由表2可知：桐花樹葉片多酚提取物對DPPH·自由基表現(xiàn)出較強的清除能力，清除率隨提取物質(zhì)量濃度的提高而增大。在質(zhì)量濃度0.000～0.600 g·L-1范圍內(nèi)提取物與DPPH·自由基清除率有明顯的量效關(guān)系，線性回歸方程為：y=106.45x+17.638(R2=0.971 0，P<0.01)。以此計算出桐花樹葉片多酚提取物對DPPH·自由基的半抑制濃度IC50為0.304 g·L-1，與0.036 g·L-1槲皮素等效。

○: 0.000 g·L-1多酚提取物 0.000 g·L-1 polyphenol extracts; ●: 0.350 g·L-1多酚提取物 0.350 g·L-1 polyphenol extracts; ▲: 0.650 g·L-1多酚提取物 0.650 g·L-1 polyphenol extracts. [S]: L-DOPA濃度Concentration of L-DOPA (mmol·L-1); v: 用波長475 nm處的吸光度值A475表征 Represented by absorbance value A475 in wavelength 475 nm; [I]: 多酚提取物濃度Concentration of polyphenol extracts (g·L-1).

表2 不同濃度桐花樹葉片多酚提取物對DPPH·自由基的清除作用

2.4 桐花樹葉片多酚提取物的抑菌活性

不同濃度桐花樹葉片多酚提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑見表3。由表3可知：多酚提取物對3種供試菌的抑菌圈直徑均隨提取物質(zhì)量濃度的提高而增大，50 g·L-1多酚提取物對3種供試菌均表現(xiàn)出抑菌作用，質(zhì)量濃度為100 g·L-1時，多酚提取物對3種供試菌的抑菌圈直徑均達15 mm以上，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達20 mm以上。最小抑菌濃度(MIC)測定結(jié)果進一步顯示：桐花樹葉片多酚提取物對供試3種細菌的MIC均為25 g·L-1，相當于化妝品防腐劑Bronopol對供試3種細菌的MIC(對大腸桿菌的MIC小于或等于2 g·L-1，對金黃色葡萄球菌的MIC為4 g·L-1，對枯草芽孢桿菌的MIC為4 g·L-1)。

表3 不同濃度桐花樹葉片多酚提取物的抑菌圈直徑比較

3 討 論

人體皮膚黑化、色素沉著性疾病及黑色素瘤的發(fā)生與黑色素合成最關(guān)鍵的限速酶——酪氨酸酶的催化活力升高和過量表達有關(guān)。酪氨酸酶抑制劑(TI)可以通過抑制酪氨酸酶的活性來預防和治療色素沉著并使皮膚美白。為了篩選TI并探明其作用機制，研究者常采用體外化學模型體系的酪氨酸酶活性抑制實驗、動力學分析[26]以及基于細胞培養(yǎng)的酪氨酸酶活性檢測技術(shù)[28]。從天然植物組織中分離提取、從商品化合物中篩選和有機合成新化合物是目前尋找TI的3個主要路徑[5]，其中植物源TI因具有高效、無毒的特點而備受青睞，并已廣泛應用于增白美容化妝品中。植物多酚就是美白化妝品TI的理想選項之一，其吸收紫外線、抗氧化與清除自由基以及對酪氨酸酶活性抑制能力強等特點使之具有與眾不同的美白綜合效應[29]。

紅樹植物是一類常年生長于鹽生環(huán)境中的特殊植物，較高含量的多酚(單寧)是一些紅樹植物提高抗腐蝕性以適應鹽生環(huán)境的生存策略之一[19]。柴緯明等[30]從紅樹植物秋茄樹〔Kandeliacandel(Linn.) Druce〕葉片中獲得縮合單寧，并發(fā)現(xiàn)它對蘑菇酪氨酸酶具有很強的抑制作用，IC50僅為30.0 μg·mL-1，這一研究結(jié)果顯示出紅樹植物中的多酚類物質(zhì)作為TI開發(fā)的可能性與獨特性。同為紅樹植物的桐花樹，葉片解剖結(jié)構(gòu)及成分分析的研究結(jié)果均顯示其體內(nèi)含有較高水平的多酚[19,31]。鑒于此，作者選用金屬鹽沉淀-乙酸乙酯萃取相結(jié)合的方法獲得桐花樹葉片多酚提取物，其葉片多酚提取物的多酚含量約為521.8 mg·g-1；根據(jù)酚類分子量與乙酸乙酯溶劑的關(guān)系，初步判斷經(jīng)乙酸乙酯萃取獲得的多酚可能主要為中等分子量的多酚類成分[32]，相比于大分子量多酚的強收斂性所產(chǎn)生的皮膚刺激副作用，桐花樹葉片多酚提取物更適合作為化妝品添加劑。

為了探明桐花樹葉片多酚提取物的酪氨酸酶活性抑制能力，作者選用相對簡單、便捷的體外化學模型體系進行酪氨酸酶抑制活性檢測，由于桐花樹葉片多酚提取物在水溶液中的溶解度相對較小，一般的有機溶劑(如乙醇等)對酪氨酸酶又具有一定的抑制作用[33]25，故而選用DMSO作為溶媒。邱凌[33]25認為DMSO-H2O體系不會對酪氨酸酶活性產(chǎn)生抑制作用；但陳懿等[34]研究了DMSO對酪氨酸酶活性的影響，認為DMSO體積分數(shù)大于25%時酪氨酸酶活性會急劇下降；而更多的研究者通常將反應體系中DMSO的用量控制為體積分數(shù)3.33%[26],[33]26，以盡量避免DMSO的影響并保證實驗效果。因此，在本研究中作者也將反應體系中DMSO的用量設定為體積分數(shù)3.33%。研究結(jié)果表明：桐花樹葉片多酚提取物具有明顯的酪氨酸酶活性抑制作用，IC50為0.650 g·L-1，其酪氨酸酶活性抑制能力與槲皮素(IC50為0.600 g·L-1)相近，而在黃酮類化合物中槲皮素是對酪氨酸酶活性抑制率較高的可逆抑制劑[35]。由此可見，桐花樹葉片多酚提取物是一種潛在的、有效的酪氨酸酶活性抑制劑，可通過柱色譜分離技術(shù)和活性追蹤方法進一步篩選出該多酚提取物中高效的TI組分或單體成分。

根據(jù)抑制劑與酶作用的特點，酶抑制類型可分為可逆抑制和不可逆抑制2類，前者又可分為競爭性抑制、反競爭性抑制、非競爭性抑制和混合型抑制等4種類型。李航等[14]認為：對酪氨酸酶活性的可逆抑制類型中還應包括一種緩慢結(jié)合型抑制，即抑制劑與酶快速形成EI復合物后緩慢的可逆異構(gòu)化。在判定酶抑制類型時，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖分析是一種常用的有效方法，作圖后如果得到一組相交于Y軸的直線則為競爭性抑制，如果得到一組相交于X軸的直線則為非競爭性抑制，如果得到一組平行的直線則為反競爭性抑制，如果得到一組相交于第二或第四象限的直線則為混合Ⅰ型(兼具競爭性與非競爭性抑制)或混合Ⅱ型抑制(兼具反競爭性與非競爭性抑制)[36]。在這些抑制類型中，混合型抑制較為常見[23]120。本研究結(jié)果表明：桐花樹葉片多酚提取物對酪氨酸酶活性抑制作用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖所得直線相交于第二象限，動力學參數(shù)表現(xiàn)為隨提取物質(zhì)量濃度提高Km值增大、vm值減小，抑制類型屬于可逆的混合Ⅰ型抑制，其實現(xiàn)對酶活性的抑制一方面是通過與底物的競爭，另一方面是通過與酶-底物絡合物(ES)的親和，這種抑制作用兼具競爭性和非競爭性抑制的特點。進一步的分析結(jié)果顯示：桐花樹葉片多酚提取物對游離酶活性的抑制常數(shù)Ki(0.833 g·L-1)小于該多酚提取物對酶-底物絡合物的抑制常數(shù)Kis(1.823 g·L-1)，說明該多酚提取物對游離酶活性的抑制作用強于其對酶-底物絡合物的抑制作用。這些特征與秋茄樹葉片中的縮合單寧[30]、青梅花提取物[15]和葉下珠(PhyllanthusurinariaLinn.)提取物[26]對酪氨酸酶活性的抑制類型相似。

有關(guān)酪氨酸酶抑制劑對酪氨酸酶活性抑制的機制主要包括3個方面：結(jié)構(gòu)與酶底物相似；絡合酪氨酸酶的Cu2+；清除活性氧并拮抗氧對酪氨酸酶的激活[37]。根據(jù)桐花樹葉片多酚提取物具有酚羥基的結(jié)構(gòu)特點及其對酪氨酸酶活性抑制作用的混合Ⅰ型抑制作用特征，初步判斷其對酪氨酸酶活性的抑制具有多維機制。一方面，該提取物含有與L-DOPA分子結(jié)構(gòu)相似的多羥基化學成分[30]，可以被酪氨酸酶催化[15]并作為競爭性底物與酪氨酸酶結(jié)合，削弱酪氨酸酶的催化氧化作用[9]；酚羥基的孤對電子可與酪氨酸酶分子中的Cu2+絡合而抑制酶活性，酚羥基還可與酶-底物絡合物的非活性中心結(jié)合并可能對酶活性中心雙核銅間的內(nèi)源橋基產(chǎn)生影響[14]，體現(xiàn)出該提取物混合Ⅰ型抑制劑的特點。另一方面，酪氨酸酶是一種含銅需氧酶，其催化功能必須在氧自由基參與下才能完成，通過清除氧自由基可以減弱或阻斷酪氨酸酶的催化反應[33]6,157；桐花樹葉片多酚提取物清除DPPH·自由基的IC50為0.304 g·L-1，表明其具有較強的抗氧化與清除自由基能力，清除氧自由基、終止自由基鏈的引發(fā)以及拮抗氧對酪氨酸酶的激活也是桐花樹葉片多酚提取物抑制酪氨酸酶活性的一個重要機制。除了抑制酪氨酸酶活性，桐花樹葉片多酚提取物是否可以通過下調(diào)酪氨酸酶mRNA表達來降低酪氨酸酶水平？以及是否影響酪氨酸酶表達的信號通路？這些疑問均有待綜合運用細胞培養(yǎng)、RT-PCR和Western Blot等實驗手段加以揭示與探明。

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌是引起化妝品變質(zhì)、腐敗以及色澤和氣味變化的常見腐敗菌。防止化妝品腐敗變質(zhì)的簡單有效方法是向化妝品中加入防腐劑，但是合成防腐劑往往具有一定的皮膚毒性且易誘發(fā)過敏反應[38]，因而，人們傾向于以植物源防腐劑代替化學合成防腐劑。本實驗結(jié)果表明：桐花樹葉片多酚提取物對3種常見的化妝品腐敗菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌)均有抑菌作用，其抑菌強度隨提取物濃度提高而增加；其中，對金黃色葡萄球菌的抑制作用較為突出，100 g·L-1提取物的抑菌圈直徑達20 mm以上。從MIC來看，桐花樹葉片多酚提取物對供試3種細菌的MIC均為25 g·L-1，大于化妝品防腐劑Bronopol的MIC。由于國家對化妝品防腐劑的使用量有嚴格規(guī)定，《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007版)規(guī)定Bronopol最大允許使用濃度為質(zhì)量分數(shù)0.1%[39]，均低于Bronopol對3種供試菌的MIC，對化妝品的防腐性有一定影響。因此，將具有抑菌活性的桐花樹葉片多酚提取物用于化妝品中，既可以提升化妝品的防腐性，也可降低Bronopol等化學合成防腐劑的使用量與副作用。研究結(jié)果顯示：桐花樹葉片多酚提取物可作為具有輔助防腐抑菌功能的新型酪氨酸酶抑制劑應用于美白化妝品的研制。

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