鐵皮石斛種質資源研究進展

劉 莉，張 庭，潘 俊，李智敏，查應洪，張金渝*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院，藥用植物研究所，云南 昆明650223;2.云南群鑫石斛種植有限公司，云南 屏邊661200)

鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)系蘭科石斛屬植物，國家二級保護植物［1］，為我國傳統(tǒng)名貴藥材，以新鮮或干燥的莖入藥，有味甘、質重、黏性大等特點。鐵皮石斛在《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中均被列為上品，被譽為“中華九大仙草”之首，具有“養(yǎng)陰生津，潤喉護嗓，溫胃明目，補腎益力，延年益壽”的功效［2］?，F(xiàn)代的化學成分和藥理研究表明鐵皮石斛還具有抗腫瘤、抗衰老、增強機體免疫力和有效減輕肝損傷等作用［3－5］。鐵皮石斛是藥典記錄加工楓斗的惟一來源［6］，鐵皮楓斗是石斛類藥材中一個較為著名的商品，常被視為價格昂貴的極品［7］。

鐵皮石斛近年來價格呈逐年上漲趨勢，當前市場鮮品價格為1500元/kg左右，而鐵皮石斛軟腳最高達到5 000元/kg。特別是云南廣南軟腳鐵皮石斛更是特殊，目前用石斛的莖加工而成的鐵皮楓斗國內市場價格超過50 000元/kg，日本、香港、泰國、新加坡等國的市場價格更高達8 000～10 000美元/kg，在我國華東、華南的一些大城市，特別在香港、臺灣以及日本、東南亞一帶普遍認為石斛是一種高檔保健飲品。

鐵皮石斛根據(jù)《中國植物志》(1999)，鐵皮石斛屬蘭科石斛屬植物［1］。中國產(chǎn)石斛根據(jù)Rshclechter(1919)的屬下等級可分為12個組，鐵皮石斛屬石斛組Sect.Dnedrobimu。鐵皮石斛主要分布在東亞、東南亞、澳大利亞等地區(qū)。中國的鐵皮石斛主要分布在浙江、廣西、云南、貴州等省區(qū)［6－8］，尤以云南省分布面積最廣據(jù)不完全統(tǒng)計云南有7個地州市涉及瑞麗、潞西、盈江、隴川、梁河、騰沖、龍陵、鎮(zhèn)康、滄源、耿馬、云縣、思茅、勐海、景洪、勐臘、綠春、金平、屏邊、瀘西、文山、廣南等21個縣(市、區(qū))，有野生鐵皮石斛分布。云南省種植鐵皮石斛的企業(yè)和農(nóng)戶近100家，分布于全省的鐵皮石斛居群主要包括云南省幾家大型組培苗公司自主選育的鐵皮石斛品種和由浙江、廣東、廣西等地采購的優(yōu)質鐵皮石斛種苗，居群數(shù)量不下30個。

1 鐵皮石斛形態(tài)結構的差異

近幾年來，一些學者對鐵皮石斛的形態(tài)結構開展了一些研究工作。丁小余等對產(chǎn)于廣西、貴州、云南三省區(qū)的鐵皮石斛某些居群形態(tài)結構進行了比較分析，通常認為根據(jù)鐵皮石斛的加工品質，可以分為便于加工的軟腳鐵皮(F型)和不便于加工的硬腳鐵皮(H型)兩種變異類型［9］。二者的形態(tài)結構具有明顯差異。F型總體莖圓、柔軟，莖表皮具較豐富的蠟質，適合做楓斗;H型鐵皮石斛則具有莖較長，質地較硬等特征。F型鐵皮石斛的莖不具有下皮層，橫切面上維管束密度小，維管束內外側纖維群不發(fā)達，基本組織中含有豐富的多糖粘性成分，莖短且柔軟，具有粘性，是加工鐵皮楓斗的優(yōu)質材料;而H型的莖較長，具有發(fā)達厚壁的下皮層，橫切面上維管束數(shù)目多、維管束鞘纖維發(fā)達，基本組織中的多糖成分少，因而莖桿較硬，粘性差，不適于鐵皮楓斗的加工。Ding通過9年的時間對中國鐵皮石斛居群進行了調查，根據(jù)產(chǎn)地的不同劃分為8個居群，并認為GSC(韶山.廣東)和FSC(順昌.福建)兩個種群是制作鐵皮楓斗最佳的材料來源，且在高溫高濕的環(huán)境下有很好的抗病性［10］。

2 鐵皮石斛不同居群的化學成分研究

不同居群的鐵皮石斛其化學成分含量不盡相同，據(jù)報道，種質顯著影響鐵皮石斛的甘露糖［11］，多糖和生物堿質量分數(shù)［12］。人工栽培鐵皮石斛其有效成分含量的差異主要來自遺傳差異，因此認為品種選育是提高鐵皮石斛有效成分含量的有效途徑。另外，應用指紋圖譜技術對不同產(chǎn)地鐵皮石斛藥材在主要化學成分含量上的差異進行聚類分析可將云南鐵皮石斛產(chǎn)地分為兩大類，勐海與文山為一類，思茅、德宏、紅河和玉溪為一類［13］。指紋圖譜技術雖存在一些不足(如指紋圖譜標準和評價體系不完善，僅對部分化學成分定性而未量化，化學信息與藥理作用研究脫節(jié)等)，但在石斛種質資源鑒定和質量控制方面得到了廣泛應用，并在不斷發(fā)展和完善［14－15］。

鐵皮石斛研究還應強化依據(jù)指紋圖譜技術建立主要石斛類藥材的質量標準，深入研究有效成分的藥理作用。DAD－ELSD［16］聯(lián)用可對指紋圖譜的信息進行相互補充、完善，得到更廣泛的信息量。但對強揮發(fā)性而未有很好紫外吸收的物質，是DAD－ELSD聯(lián)用技術的一個盲區(qū)，需串聯(lián)MS等檢測器進行補充和完善。樣品共有峰和相似度對評價中藥材質量的共性有重要價值，但不同品種指紋圖譜相互間的差異也有重要意義，可采用統(tǒng)計軟件進行聚類分析、多重方差分析及主成分分析等，為石斛的系統(tǒng)研究提供可靠的數(shù)學依據(jù)。另外，HPLC以及HPLC/UV/MS指紋圖譜技術已成為一種石斛種質鑒定和全面質量控制的有效手段之一。DNA指紋圖譜簡單便捷，它側重于對石斛種源的鑒定，對辨別石斛不同的種或品種以及石斛藥材真?zhèn)蔚确矫媸钟行А；瘜W指紋圖譜則側重于對石斛品質的鑒定，它作為石斛自身的化學條碼，所反映的化學成分信息既有種內的共性，又因產(chǎn)地不同而具有道地性，這為區(qū)分石斛藥材的真?zhèn)闻c優(yōu)劣，實行石斛藥材質量控制提供了強而有力的技術支持［17］。

3 鐵皮石斛不同居群的分子生物學研究

近年來，隨著分子生物技術的不斷發(fā)展，將分子生物技術手段應用于鐵皮石斛遺傳多樣性研究也是一個熱點。在鐵皮石斛遺傳多樣性應用較多的技術主要包括:AFLP、RAPD、ISSR和SCoT技術。通過研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛遺傳多樣性豐富，遺傳差異大，有利于開展優(yōu)良種源的選擇。Li用AFLP的方法結合POPGENE軟件分析出鐵皮石斛遺傳多樣性(HE=0.269);用AMOVA軟件分析時顯示，種群的相互之間遺傳差異有輕微的變化，(ΦST系數(shù)=0.047～0.578)［18］。

RAPD技術分析鐵皮石斛的遺傳多樣性研究顯示各居群的多態(tài)性位點比率為91.35%［19］，說明鐵皮石斛具有較為豐富的遺傳多樣性。鐵皮石斛種質的親緣關系遠近與其地理種源具有顯著的相關性，與栽培地點無關［11］。

近年來，ISSR已成功用于植物遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜繪制、分子生態(tài)學研究等領域［20－26］。該技術無需預知受試基因組序列，成本低，操作簡單且穩(wěn)定性好，被認為是非常理想的研究居群問題的分子標記。盧家仕、沈潔等建立了鐵皮石斛ISSR穩(wěn)定可靠的反應體系，并用于遺傳多態(tài)性分析［27－28］。ISSR技術可以較好地應用于鐵皮石斛的居群鑒別及居群分子生態(tài)的研究。盧家仕采用ISSR分子標記技術和非加權平均距離法對24份不同產(chǎn)地石斛屬樣品的遺傳多樣性和親緣關系進行分析出其多態(tài)性為100%［29］。汪尚結合形態(tài)學性狀，釆用SSR技術分析出其平均多態(tài)性比率為86.5%［30］。

目標起始密碼子多態(tài)性分子標記(SCoT)技術應用于鐵皮石斛的遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)不同來源的鐵皮石斛人工栽培種存在較大的遺傳差異，遺傳多樣性豐富，多態(tài)率達到90.3%［31］。SCoT和SSR標記相結合能夠更明確了不同來源的鐵皮石斛種質資源的親緣關系和地理緯度關系密切，更進一步證明了SCoT和SSR標記對鐵皮石斛遺傳多樣性、親緣關系分析的可靠性［32］。

利用分子生物技術的手段，發(fā)掘重要性狀的相關基因或緊密連鎖的遺傳標記，進行分子育種。

(1)隨著基因組分析技術與生物信息學的發(fā)展，通過高效、廉價的基因組測序與GWAS技術，結合核心種質庫的選擇與多親本群體或育種高世代群體的利用，可以有效地進行復雜性狀相關的基因組區(qū)域與關聯(lián)SNP的標記。為調控復雜性狀的功能“模塊”解析在全基因組水平上提供候選基因［33］?；诟咄炕蚪M測序的基因型鑒定方法比目前廣泛應用的分子標記分辨率提高35倍;成功開展了水稻重要農(nóng)藝性狀的基因組關聯(lián)分析(GWAS)［34］;利用RNA－Seq技術成功分析了水稻全基因組的轉錄組;克隆了相應的全長cDNA并構建數(shù)據(jù)庫。與水稻高產(chǎn)、優(yōu)質、抗性和營養(yǎng)等重要農(nóng)藝性狀基因得到分離克?。?5－37］。

鐵皮石斛基因克隆涉及關于蔗糖合成酶(sucrose synthase，SS)［38］和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC)［39］的基因克隆;NAC轉錄因子、鐵皮石斛細胞周期蛋白依賴激酶基因［40］促分裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)［41］介導的級聯(lián)途徑和鈣依賴蛋白激酶(calcium－dependent protein kinase，CDPK)在植物－根瘤/從枝菌根共生系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用［42］等方面的研究。

4 鐵皮石斛開發(fā)利用中存在的問題及展望

鐵皮石斛是云南省高經(jīng)濟價值的藥用植物，其粗加工品“楓斗”曾是我省出口創(chuàng)匯的醫(yī)藥品種之一。云南省鐵皮石斛資源十分豐富，廣泛分布于紅河、文山、保山、德宏、普洱、西雙版納等州市。現(xiàn)有過百家企業(yè)建立了石斛種植基地，種植面積超過1萬畝。由于鐵皮石斛蘊涵極高的經(jīng)濟價值，且長期忽視培育與保護，過度采集利用導致野生資源瀕臨稀缺的狀況。隨著人工馴化栽培技術的日趨成熟，鐵皮石斛的人工種植面積逐年增大，發(fā)展勢頭強勁。

鐵皮石斛開發(fā)利用的主要問題:一是，某些產(chǎn)地分布的鐵皮石斛因過度采挖種質資源逐漸消失，種群喪失，極不利于資源保護，應該加強野生石斛資源的系統(tǒng)收集、評價與利用;二是，缺乏經(jīng)科學鑒定的優(yōu)良品種。種植鐵皮石斛的企業(yè)和農(nóng)戶盲目引種或采集野生資源作種源，對其生物學特性、有效成分的含量、區(qū)域適應性等缺乏了解，導致種植失敗或造成重大經(jīng)濟損失。因此開展鐵皮石斛多樣性研究和優(yōu)異種質的發(fā)掘十分必要。通過優(yōu)異種質的發(fā)掘，從眾多居群中發(fā)掘出有效成分含量高、豐產(chǎn)性好、適應性強的優(yōu)異種質，為進一步開展鐵皮石斛優(yōu)良品種選育奠定前期工作基礎;三是，鐵皮石斛深加工產(chǎn)品品種單一，競爭力低而且無品牌效應，質量難保障，因此應該深入基礎研究，加強功能與功效的宣傳加強深度開發(fā)和利用，擺脫產(chǎn)品單一的局面。與此同時，加強政府的引導，防止產(chǎn)業(yè)盲目擴大［43－44］。

現(xiàn)代分子標記技術主要用于鐵皮石斛的分子鑒定和遺傳多樣性的研究。鐵皮石斛在分子育種方面的研究尚屬空白。分子標記輔助育種需要繼續(xù)加強分子標記研究，開發(fā)更多與優(yōu)良農(nóng)藝性狀基因緊密連鎖的分子標記，為通過遺傳操作培育出高產(chǎn)優(yōu)質的鐵皮石斛新種質創(chuàng)造基礎。鐵皮石斛功能基因的研究僅包括cDNA文庫構建和基因克隆分析兩個方面，目前尚缺乏系統(tǒng)的基因組和轉錄組研究。功能基因的相關報道也僅限于克隆和表達模式分析，轉基因功能驗證方面的工作開展較少。因此，利用新一代高通量測序技術結合生物信息學解析鐵皮石斛基因組和轉錄組信息，大規(guī)模發(fā)掘基因資源，以全面揭示鐵皮石斛生長發(fā)育、代謝調控、菌根互作的分子基礎［45］。分子生物學、動植物生物化學及遺傳學的協(xié)同發(fā)展，推動了動植物功能基因組研究的快速進步，使大規(guī)模分離和鑒定調控基因及其作用網(wǎng)絡，系統(tǒng)分析性狀建成和調控機理成為可能，為“模塊”的解析和組裝提供了理論和技術保障;現(xiàn)代農(nóng)學學科及農(nóng)業(yè)生物育種學科的發(fā)展，越來越依賴合成生物學與系統(tǒng)生物學的理念，最終將實現(xiàn)農(nóng)藝性狀在全基因組水平上的優(yōu)化與選擇，達到復雜性狀得以改良的新品種培育目標。以備利用基因工程手段為鐵皮石斛的育種和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展服務。

［1］吉占和.中國植物志［M］.北京:科學出版社，1999，19:5－146.

［2］包雪聲，順慶生，陳立鉆.中國藥用石斛［M］.上海:復旦大學出版社，2001:13－28.

［3］楊一令，來平凡，蔣士鵬.鐵皮石斛研究進展［J］.山東中醫(yī)藥大學學報，2008，32(1):82－85.

［4］楊 虹，王順春，王崢濤，等.鐵皮石斛多糖的研究［J］.中國藥學雜志，2004，39(4):257－257.

［5］劉 莉，蕭鳳回.石斛屬藥用植物多糖研究進展［J］.現(xiàn)代中藥研究與實踐，2009，23(1):77－80.

［6］高等植物圖鑒編組.高等植物圖鑒:第4冊［M］.北京:科學出版社，1973.

［7］張治國.名貴中藥－鐵皮石斛［M］.上海:上?？茖W技術文獻出版社，2006.

［8］包雪聲.中國藥用石斛［M］.上海:復旦大學出版社，2001.

［9］丁小余，徐珞珊，王崢濤.鐵皮石斛居群差異的研究(H)植物體形態(tài)結構差異［J］.中草藥，2001，32(9):828－831.

［10］GE D，GUO HX，W C Z，et al.Preliminary geoherbalism study of Dendrobium officinale food by DNA molecular markers［J］.Eur Food Res Technol，2007，10:812－813.

［11］苑 鶴，林二培，朱 波，等.鐵皮石斛人工栽培居群的遺傳多樣性研究［J］.中草藥，2011，3:566－569.

［12］諸 燕，張愛蓮，何伯偉.鐵皮石斛總生物堿含量變化規(guī)律［J］.中國中藥雜志，2010，18:2 388－2 391.

［13］劉文杰，孫志蓉，杜 遠，等.不同產(chǎn)地鐵皮石斛主要化學成分及指紋圖譜研究［J］.北京中醫(yī)藥大學學報，2013，36(2):117－120.

［14］NG T B，LIU JY，WONG J H，et al.Review of research on Dendrobium，a prized folk medicine［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2012，93:1 795－1 803.

［15］HOSSAIN M M.Therapeutic orchids:traditional uses and recent advances－An overview［J］.Fitoterapia，2011，82:102－140.

［16］石媛慧，郭 力，許 莉，等.不同品種石斛的HPLC－DAD－ELSD指紋圖譜研究.世界科學技術—中醫(yī)藥現(xiàn)代化［J］.2013，15(6):1 329－1 332.

［17］李 杰，章金輝，朱根發(fā)，等.石斛屬植物種質資源鑒定及指紋圖譜應用研究進展［J］.中國農(nóng)學通報，2013，29(16):63－68.

［18］LI X X，DING X Y，CHU B H，et al.Genetic diversity analysis and conservation of the endangered Chinese endemic herb Dendrobium officinale Kimura et Migo(Orchidaceae)based on AFLP［J］.Gentica，2007，10:9 196－9 198.

［19］丁 鴿，丁小余，沈 潔，等.鐵皮石斛野生居群遺傳多樣性的RAPD分析與鑒別［J］.藥學學報，2005，40(11):1028－1 032.

［20］AMMIRAJU JSS，DHOLAKIA B B，SANTRA D K，et al.Identificat ion of inters imple sequence repeat(ISSR)markers associated with seed size in wheat［J］.Theor Appl Genet，2001，102:726－728.

［21］CASASOH M，MATTIONI C，CHERUBIN A，et al.A geneti c linkage map of European chestnu(Castanea sativa Mill.)based on RAPD、ISSR and isozyme markers［J］.Theor Appl Genet，2001，102:1 190－1 193.

［22］邱英雄，傅承新，吳斐捷.明黨參與川明參群體遺傳結構及分子鑒定的ISSR分析［J］.中國中藥雜志，2003，28(7):598－601.

［23］李海生，陳桂珠，施蘇華.海南海桑遺傳多樣性的ISSR研究［J］.中山大學學報(自然科學版)，2004，43(2):67－69.

［24］何華勤，賈小麗，梁義元.RAPD和ISSR標記對水稻化感種質資源遺傳多態(tài)性的分析［J］.遺傳學報，2004，31(9):888－891.

［25］JIN Y，ZHANGW J，F(xiàn)U D X，et al.Sampling strat egy within a wild soybean population based on its genetic variat ion detected by ISSR markers［J］.Acta Botanica Sinica，2003，45(8):995－998.

［26］LI H S，CHEN G ZH.Genetic diversity of Sonneratia alba in China detected by inter－simple Sequence repeats(ISSR)analysis［J］.Acta Botanica Sinica，2004，46(5):515－520.

［27］盧家仕，卜朝陽，呂維莉，等.20份蘭科植物的ISSR遺傳多樣性分析［J］.西南農(nóng)業(yè)學報，2012，25(6):2 252－2 257.

［28］沈 潔，丁小余，丁 鴿，等.鐵皮石斛居群差異的研究ISSR指紋標記方法的建立與優(yōu)化［J］.中國中藥雜志，2006，31(4):291－294.

［29］盧家仕，卜朝陽，呂維莉，等.不同產(chǎn)地石斛屬種質資源的ISSR遺傳多樣性分析［J］.中草藥，2013，44(1):96－100.

［30］汪 尚.鐵皮石斛種質資源遺傳多祥性評價及其遺傳連鎖圖譜的構建［D］.杭州:杭州師范大學，2012:27－45.

［31］徐旭棟，蔣瑞彬，藍小明，等.人工栽培鐵皮石斛種質資源遺傳多樣性的SCoT分析［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2013，28(7):2 123－2 125.

［32］趙瑞強.2012.基于分子標記的皮石斛種質資源遺傳多樣性研究［D］.杭州:浙江農(nóng)林大學，2012:13－52.

［33］薛勇彪，段子淵，種 康，等.面向未來的新一代生物育種技術——分子模塊設計育種［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，2013，28(3):203－314.

［34］HUANG X H，WEI X H，SANGT.et al.Genome－wide association studies of 14 agronomic traits in rice land－races.Nature Genetics，2010，42:961－967.

［35］HUANG X，QIAN Q，LIU Z，et al.Natural variation at the DEP1 locus enhances grain yield in rice.Nature Genetics，2009，41:494－497.

［36］LI X，QIAN Q，F(xiàn)U Z.et al.Control of tillering in rice.Nature，2003，422:618－621.

［37］JIAO Y，WANG Y，XUE D.et al.Regulation of OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice.Nature Genetics，2010，42:541－544.

［38］孟衡玲，段承俐，蕭鳳回，等.鐵皮石斛蔗糖合成酶基因的克隆及表達分析［J］.中國中藥雜志)，2011，36(7):833－837.

［39］曾淑華，文國松，徐紹忠，等.鐵皮石斛磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及表達分析［J］.中草藥，2012，43(4):766－771.

［40］ZHAO P，WANG W J，SUN M X.Characterization and expression pattern analysis of DcNAC gene in somatic embryos of Dendrobium candidum Wall ex Lindl［J］.Plant Cell Tiss Organ Cult，2011，107:151－159.

［41］ZHANG G，SONG C，ZHAO M M，et al.Characterization of an A－type cyclin－dependent kinase gene from Dendrobium candidum［J］.Biologia，2012，67(2):360－368.

［42］PARNISKE M.Arbuscular mycorrhiza:The mother of plant root endosymbioses［J］.Nat Rev Microbiol，2008，6:763－775.

［43］李 光，路 娟，陳 曦.鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在的問題與對策［J］.中國中藥雜志，2013，38(4):469－471.

［44］吳韻琴，斯金平.鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及可持續(xù)發(fā)展的探討［J］.中國中藥雜志，2010，35(15):2 033－2 036.

［45］張 崗，張大為，趙明明，等.鐵皮石斛分子生物學研究進展［J］.中國藥學雜志2013，48(19):1 614－1 619.