存放時間對稀有白甲魚血清樣品生化指標測定結果的影響

岳曉烔

(貴州省貴陽市花溪區(qū)馬鈴鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)服務中心，貴州 貴陽 550025)

魚類血液生化指標是反映魚體生理狀態(tài)的重要參數(shù)，也是診斷魚類疾病的重要指標;魚體一旦產(chǎn)生疾病，其血液生化指標就會發(fā)生相應的改變［1］。血液生化指標常經(jīng)常被用來評價魚類的健康狀況、營養(yǎng)狀況及對環(huán)境的適應狀況，是魚類極為重要的生理、病理和毒理學指標［2］。此外，魚類的血清指標在遺傳育種研究方面也具有重要的意義［3］。研究表明，魚類的血液指標具有較大的變化范圍，受自身與外界因素的影響而波動，主要與魚類的品種、年齡、養(yǎng)殖密度、水溫、鹽度、飼料成分以及攝食狀態(tài)等有關［4-7］。除此之外，血清樣品在離開動物體后，仍在不斷地發(fā)生著各種反應［8］，因而血清樣品在受檢前的保存時間、方式等可對其生化指標的測定結果產(chǎn)生影響?？梢?，樣品保存處理是檢驗前質量控制的一個重要環(huán)節(jié)，在全程質控中非常重要［9］。與其他材料的樣品檢測一樣，魚類血清檢測中也經(jīng)常會遇到許多意想不到的情況，例如儀器故障、試劑短缺、停水停電、遠程檢驗需要進行樣品的郵寄以及待測樣本太多等，進而使樣品采集后得不到及時檢測［9］。由此，待測血樣的保存方式及時間長短將對其血清生化指標的測定產(chǎn)生影響。目前，關于血樣保存條件對常規(guī)生化指標影響的研究主要集中在人體臨床醫(yī)學中［9-12］，而有關動物的相關研究則主要是針對哺乳動物，如大白鼠等［13］。到目前為止，未見有關魚類血樣的保存方式及時間長短對其血清生化指標測定結果影響的研究報道。本研究以瀕危野生魚類稀有白甲魚的血清樣品為材料，在-20℃貯存條件下，檢驗血清樣品保存時間的長短對其常規(guī)生化指標測定結果的影響，旨在為魚類血清的保存及其生化指標測定結果的可靠性分析提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

稀有白甲魚實驗魚于2012年6月采自貴州省境內清水江(沅江水系)，共24尾。晚上乘漁船攔網(wǎng)采集實驗魚個體，并將裝有實驗魚的網(wǎng)兜置于河水暫養(yǎng)達12 h以上，期間網(wǎng)兜內外水流相通，溶氧充足，魚體無食物來源，為避免因運輸導致魚體產(chǎn)生應激反應，實驗人員于次日攜帶采血裝備于岸邊就地取血。實驗魚體長為191.04±42.02 mm，體重為207.64±148.25 g。

1.2 測定方法

采血時按邱郁春［14］的方法，自活體尾靜脈采血2～3 mL，注入5 mL EP離心管用冰袋保存，迅速移至室內4℃冰箱中靜置10 min。待上清液析出時，在4 000 r/min條件下離心10 min，取上清液。將分別裝有24尾稀有白甲魚血清的EP離心管隨機分成兩組，每組12個血樣，全部密封放置于-20℃冰柜中冰凍保存。然后將兩組血清樣本分別于第10 d、第60 d按照所購試劑盒附帶方法(表1)測定其15項生化指標，包括總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血紅蛋白(Hb)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、肌酐(CREA)、總膽紅素(TBIL)、谷草轉氨酶(GOT)、谷丙轉氨酶(GPT)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酸激酶(CK)，記錄測定結果。每組樣本均于當天測定完畢;試劑盒現(xiàn)用現(xiàn)購，全部試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所。

表1 稀有白甲魚血清生化指標的測定方法Tab.1 Determination methods of biochemical parameters for serum samples from Onychostoma rara

1.2 數(shù)據(jù)處理

應用EXCEL軟件和SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)結果以±s表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 糖類、脂類、蛋白質及其代謝產(chǎn)物

由表2可知，在檢測的稀有白甲魚血清糖類、脂類、蛋白質及其代謝產(chǎn)物共計10項生化指標中，血紅蛋白(Hb)、總膽固醇(TC)、尿素氮(BUN)和總膽紅素(TBIL)等4項生化指標在血清樣本保存60 d時的測定值顯著低于保存10 d時的測定值(P＜0.05)?？梢?，該4項生化指標在保存60 d時的測定值可信度差。在余下的6項生化指標中，與保存10 d時的測定值相比，總蛋白(TP)和肌酐(CREA)在血清樣本保存60 d的測定值有所增加，而白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、尿酸(UA)在60 d時的測定值則出現(xiàn)了減少，但這6項生化指標在前后兩個時間點的測定值均無顯著差異(P＞0.05)。因此，參照保存10 d時的測定值，該6項生化指標在血清樣本保存60 d時的測定值依然具有較好的穩(wěn)定性和可信度。

2.2 血清酶活性

在測定的稀有白甲魚5項血清酶活性中，谷草轉氨酶(GOT)與肌酸激酶(CK)在血清樣本保存60 d時的測定值顯著低于保存10 d時的測定值(P＜0.05)。而谷丙轉氨酶(GPT)、乳酸脫氫酶(LDH)和堿性磷酸酶(ALP)在血清樣品保存60 d時的酶活性與保存10 d時無顯著差異(P＞0.05)，僅谷丙轉氨酶(GPT)的酶活性隨保存時間的增長略有增加(P＞0.05)(表2)。由此，在這5種血清酶活性中，參照保存10 d時的測定值，在血清樣本保存 60 d時谷丙轉氨酶(GPT)、乳酸脫氫酶(LDH)和堿性磷酸酶(ALP)的穩(wěn)定性較好、可信度較高，而谷草轉氨酶(GOT)與肌酸激酶(CK)則顯著降低。

表2 不同保存時間的稀有白甲魚血清生化指標測定(±s)Tab.2 Comparison of biochemical parameters of Onychostoma rara serum samples stored for different times

表2 不同保存時間的稀有白甲魚血清生化指標測定(±s)Tab.2 Comparison of biochemical parameters of Onychostoma rara serum samples stored for different times

images/BZ_19_253_1109_1195_1242.png總蛋白g/L TP 101.30±6.80 104.34±8.21-0.988 0.334白蛋白g/L ALB 17.39±4.29 14.62±1.54 2.108 0.054血紅蛋白g/100mL Hb 14.92±3.29 11.25±1.90 3.344 0.003葡萄糖mmol/L GLU 7.35±0.35 7.21±0.40 0.884 0.386甘油三酯mmol/L TG 4.32±1.24 4.15±0.78 0.416 0.682總膽固醇mmol/L TC 5.65±1.77 4.18±1.26 2.341 0.029尿素氮mmol/L BUN 7.27±0.20 6.00±0.24 13.884 0.000尿酸mg/L UA 37.14±6.32 32.64±9.73 1.344 0.193肌酐umol/L CREA 15.02±3.68 16.01±2.58 -0.768 0.450總膽紅素μmol/L TBIL 79.04±44.57 40.28±25.64 2.612 0.018谷草轉氨酶U/L GOT 134.73±16.88 108.80±10.42 4.529 0.000谷丙轉氨酶U/L GPT 55.90±23.00 68.83±33.57-1.067 0.298乳酸脫氫酶U/mL LDH 22.83±4.42 21.30±3.23 0.965 0.345堿性磷酸酶U/L ALP 18.45±3.15 15.73±3.33 2.055 0.052肌酸激酶U/mL CK 29.03±2.05 24.25±4.96 3.086 0.008

3 討論

血液生化指標是魚類的重要血液學特征。準確測定魚類血液生化指標是深入了解魚類血液學特征的基礎。實驗方法的選擇得當與否對魚類血液學指標測定有一定影響［15］，尤其是采集魚類血液的方法。對同一種魚采取不同采血方法測定結果有一定的差異，特別是當對魚體的刺激過大時，其血液指標尤其是生化指標的影響較明顯［16］。華文青等曾用尾靜脈抽血和斷尾柄采血兩種方法采集羅非魚血樣進行了對比研究，結果表明兩種方法所得血樣中的AST、ALT、AKP、CPK、N 及 P有明顯差異，而 GLU、TC、TP、Mg及氯化物沒有顯著差異［17］。這是由于斷尾柄采血對實驗魚刺激較大可能引起了血液生化指標較大的波動。因此，在本研究中，采用的是對魚體刺激相對較小的尾靜脈抽血法來獲得魚血。然而，血液在離開魚體后仍然會發(fā)生著一系列的變化和反應。因此，保存后的血液樣品，其質量也會受很多因素的影響［18］。有關人體血液樣品保存對其生化檢驗結果的影響國內外已有報道［19-20］。一般認為，血液樣品冷藏可抑制細胞代謝、穩(wěn)定某些理化成分，但全血樣品一般不宜冷藏，因此臨床上一般均為冷藏其血清樣品［9］。按照我國有關部門規(guī)定，用于檢測的血清樣本在22～25℃保存不能超過8 h，8 h內不能完成試驗的應置4～8℃保存，48 h內不能完成試驗的應于-20℃保存［21］。由此，本實驗中，先將稀有白甲魚全血冷凍離心后提取其血清進行低溫(-20℃)保存，然后再用保存的血清進行其血液生化指標的測定。

本研究中，共計檢測了稀有白甲魚血清中15項生化指標，其中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、尿酸(UA)、肌酐(CREA)、谷丙轉氨酶(GPT)、乳酸脫氫酶(LDH)和堿性磷酸酶(ALP)等9項指標在經(jīng)過不同保存時間后的測定結果無顯著差異，表明該9項生化指標在保存60 d時的測定結果是可信的，這為保存魚類血清樣品及合理安排試驗時間提供了依據(jù)。本實驗中最長的保存時間為60 d，此時這9項生化指標在低溫(-20℃)、密閉的保存條件下仍較穩(wěn)定，至于其在更長保存時間后的穩(wěn)定性尚需進一步探討。而血紅蛋白(Hb)、總膽固醇(TC)、尿素氮(BUN)、總膽紅素(TBIL)、谷草轉氨酶(GOT)和肌酸激酶(CK)等6項生化指標在不同保存時間后的檢查結果則顯示了明顯的差異，說明這6項生化指標在血清樣本較長保存時間后的測定值穩(wěn)定性低、可信度差。然而，盡管不同血液生化指標允許血清樣本保存的時間長短不同，為了保證血液生化指標測定結果的準確性，血液樣本采集后應盡快進行相關生化指標的測定［22-23］。

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