葡萄酒釀酒酵母果糖利用影響因素的研究進(jìn)展

趙文英 賈萬利

（中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，太原 030051）

葡萄酒釀酒酵母果糖利用影響因素的研究進(jìn)展

趙文英 賈萬利

（中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，太原 030051）

葡萄酒酒精發(fā)酵后期，釀酒酵母果糖利用能力與酒精發(fā)酵中止和發(fā)酵不徹底密切相關(guān)，而且殘余果糖還可能帶來微生物污染和酒體失衡的危險。從釀酒酵母己糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、己糖胞內(nèi)磷酸化及發(fā)酵條件（葡萄糖濃度、乙醇和溫度）對果糖利用影響等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，對篩選和構(gòu)建高果糖利用優(yōu)良葡萄酒釀酒酵母研究，以及生產(chǎn)中合理控制酒精發(fā)酵過程具有重要指導(dǎo)意義。

葡萄酒 釀酒酵母 果糖

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）常常被篩選作為葡萄酒酒精發(fā)酵菌種［1］。葡萄漿汁中葡萄糖和果糖含量基本相等，但在酒精發(fā)酵過程中，釀酒酵母利用葡萄糖的能力通常比利用果糖的能力強(qiáng)。其結(jié)果是果糖與葡萄糖比例隨著發(fā)酵的進(jìn)行不斷升高，以致在發(fā)酵后期果糖成了主導(dǎo)糖。葡萄酒酵母必須在長期饑餓和大量乙醇存在的情況下發(fā)酵果糖。由于果糖攝取困難造成營養(yǎng)的不平衡，脅迫因素可能被放大，從而改變了酵母活性，導(dǎo)致酒精發(fā)酵中止［2，3］。而且釀酒酵母的低果糖利用能力也與發(fā)酵后期低發(fā)酵速率和發(fā)酵不徹底有關(guān)［4，5］。另外，由于果糖不能被有效利用而殘留在葡萄酒中，一方面果糖甜度高，會造成葡萄酒口感失衡；另一方面，酒中殘?zhí)堑拇嬖诰哂幸l(fā)微生物污染的危險［1，5］。因此，釀酒酵母的果糖利用能力影響因素的研究備受關(guān)注。

不同釀酒酵母菌果糖發(fā)酵能力不同，Liccioli等［6］對20株商業(yè)用釀酒酵母進(jìn)行了果糖利用能力的測定。其中FERMICHAMP果糖利用能力最強(qiáng)，BORDEAUX RED最弱。趙文英等［7］通過數(shù)學(xué)方程擬合了不同菌體在模擬葡萄汁培養(yǎng)基條件下，發(fā)酵情況與單糖利用之間的關(guān)系，也表明不同釀酒酵母

的葡萄糖果糖利用能力不同。為尋找釀酒酵母利用葡萄糖和果糖的差異，需要考慮1，6-二磷酸果糖形成前的一些步驟，包括己糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及胞內(nèi)磷酸化，以及發(fā)酵過程中，不斷變化的環(huán)境因素對果糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。

1 己糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)對釀酒酵母果糖利用的影響

己糖的吸收是個主動轉(zhuǎn)運(yùn)的過程。釀酒酵母中己糖的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是糖代謝的關(guān)鍵步驟，其己糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體組成強(qiáng)烈影響著菌體的發(fā)酵特性［8］。已鑒定出約20個基因編碼相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和感受體（HXT1 to HXT17、GAL2、SFN3 和 RGT2）參與己糖的轉(zhuǎn)運(yùn)［9］。

研究表明，Hxt1-7p是釀酒酵母中發(fā)揮主要作用的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對發(fā)酵條件下的葡萄糖和果糖的利用非常重要。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在底物專一性和親和力方面有差異。HXT1和HXT3編碼的是低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體，HXT6、HXT7編碼的是高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體，其他基因編碼的是中等親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體［8］。轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白對單糖親和力的高低會影響不同單糖的代謝速率，通常，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對葡萄糖的親和力大于對果糖的親和力，這是造成葡萄糖發(fā)酵速率高的重要原因［9］。盡管Hxt3p對糖的親和力低，但在發(fā)酵過程中對糖的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮著尤為重要的作用［10］。Kapella等［11］發(fā)現(xiàn)缺乏HXT3的菌株在5%乙醇培養(yǎng)基中不能徹底發(fā)酵，這也說明Hxt3p在發(fā)酵過程中，在有乙醇存在的情況下，對糖的轉(zhuǎn)運(yùn)至關(guān)重要。

釀酒酵母FERMICHAMP通常能使葡萄酒發(fā)酵至干，具有較強(qiáng)的果糖利用能力［5，12］。通過分析該菌體HXT己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因發(fā)現(xiàn)，該酵母菌具有突變的HXT3等位基因。通過在hxt1-7Δ全缺陷菌體中表達(dá)該HXT3突變基因發(fā)現(xiàn)，該基因具有高果糖的利用能力。推測該基因?qū)ERMICHAMP發(fā)酵過程中的葡萄糖/果糖比值變化起著重要作用［12］。

除HXT系 列 基 因 之 外，Galeote 等［13］在EC1118及其他一些葡萄酒釀酒酵母基因測序過程中鑒定出了FSY1基因，該基因與巴斯德酵母（Saccharomyces pastorianus）中的果糖轉(zhuǎn)運(yùn)體Fsy1p的基因序列具有同源性。利用hxt1-7Δ全缺陷的菌體來表達(dá)該基因后，結(jié)果表明，F(xiàn)SY1對果糖具有高親和性，而且乙醇可誘導(dǎo)其表達(dá)。Lin等［15］在分析有氧發(fā)酵酵母和有氧酵母的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因組成時發(fā)現(xiàn)，己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因拷貝數(shù)與有氧發(fā)酵強(qiáng)度具有強(qiáng)烈正相關(guān)性，即轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因拷貝數(shù)的增加有助于釀酒酵母向有氧發(fā)酵方向進(jìn)化。通過菌種間水平基因轉(zhuǎn)移獲得的FSY1可增強(qiáng)EC1118的高果糖利用能力。

被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)的葡萄糖和果糖分子可通過己糖激酶進(jìn)行磷酸化，然后進(jìn)入糖酵解途徑。己糖激酶Hxk1對果糖最大反應(yīng)速率是葡萄糖的3倍，Hxk2對葡萄糖反應(yīng)速率略微大于果糖。但隨著底物濃度的降低，這兩個磷酸化酶對葡萄糖和果糖的磷酸化速率也發(fā)生著變化［16］。Berthels等［17］認(rèn)為葡萄糖果糖發(fā)酵能力的差異受己糖激酶活性影響，在實驗室酵母體內(nèi)過量表達(dá)己糖激酶Hxk1，可增強(qiáng)果糖的發(fā)酵速率。高果糖/葡萄糖磷酸化的速率和果糖磷酸化激酶對果糖的低Km可作為篩選高果糖利用菌株的參考。但也有很多學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)糖的磷酸化能力超過了被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)的糖，因此己糖磷酸化不是造成發(fā)酵速率差異的根本原因［10，11，14］。這有待于進(jìn)一步論證。

2 發(fā)酵條件對釀酒酵母果糖利用的影響

在葡萄酒發(fā)酵過程中，酵母處于高度變化的環(huán)境條件之中。己糖濃度從160-300 g/L降低至2 g/L，而乙醇濃度增加至15%。氮的耗竭使得細(xì)胞生長停滯，大多數(shù)糖被氮饑餓的細(xì)胞發(fā)酵所用。在整個酒精發(fā)酵過程中，酵母調(diào)整自身的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白組成及磷酸化酶的活性以確保應(yīng)對環(huán)境變化的最佳己糖轉(zhuǎn)運(yùn)和利用［14］。發(fā)酵環(huán)境因素包括葡萄糖濃度、乙醇、溫度及氮源等，將對釀酒酵母轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及己糖激酶基因表達(dá)有重要影響。

2.1 葡萄糖濃度的影響

葡萄糖不僅是釀酒酵母的碳源，而且是酵母代謝和生長的整體調(diào)節(jié)因子［4］。有研究表明，高葡萄糖濃度可抑制釀酒酵母果糖的消耗量，低葡萄糖濃度可增強(qiáng)果糖的利用能力［18］。HXT基因的表達(dá)受環(huán)境因素的調(diào)節(jié)，特別是細(xì)胞外己糖濃度的影響，而葡萄糖是控制HXT基因表達(dá)的主要因素［6］。HXT2只在遲滯期短暫的表達(dá)，可能與啟動生長的蛋白生成有關(guān)。低親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)體HXT1只局限在發(fā)酵前

期表達(dá)，尤其在細(xì)胞的生長階段表達(dá)旺盛，但在穩(wěn)定期不發(fā)揮作用。HXT5的表達(dá)取決于釀酒酵母的生長速率［19］。高親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HXT6和HXT7在葡萄糖濃度低時被誘導(dǎo)，在葡萄糖濃度高時被抑制，即在發(fā)酵末期與糖的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。而HXT3受葡萄糖濃度的調(diào)節(jié)很微弱，它也是唯一的在整個發(fā)酵過程中一直被表達(dá)的載體蛋白，在生長停滯期有最大量的表達(dá)，在穩(wěn)定期緩慢降低，所以Hxt3p蛋白被認(rèn)為是葡萄酒發(fā)酵過程中最穩(wěn)定最重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體［6，8］。在葡萄酒發(fā)酵后期，提高果糖的轉(zhuǎn)運(yùn)效率對預(yù)防發(fā)酵速率降低及發(fā)酵中止發(fā)揮著非常重要的作用。因此，不同釀酒酵母HXT3基因所表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)體是否存在差異，是否具有不同的果糖轉(zhuǎn)運(yùn)效率，有待進(jìn)一步研究。

2.2 乙醇的影響

乙醇也是影響果糖利用的重要因素。乙醇能抑制糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用，因為乙醇具有蛋白變性的特點(diǎn)，會擾亂質(zhì)膜上己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白體的功能。另外，由于細(xì)胞膜通透性的增加，胞內(nèi)酶的結(jié)構(gòu)和活性也會受損［20］。Berthels 等［17］發(fā)現(xiàn)高濃度乙醇能抑制糖的利用，但對果糖的影響高于葡萄糖。這不僅能造成葡萄糖與果糖轉(zhuǎn)運(yùn)的差異，也可能是發(fā)酵過程中果糖難利用的原因之一。在此基礎(chǔ)上，Zinnai等［21］在葡萄酒酒精發(fā)酵的模擬體系中，進(jìn)一步分析了乙醇對葡萄糖和果糖利用的動力學(xué)特征。結(jié)果表明，在低乙醇濃度下，兩者的代謝速率區(qū)別不大，兩者具有相同的限速步驟。當(dāng)乙醇濃度增加時，葡萄糖的代謝速率明顯快于果糖的代謝速率，在此階段，果糖代謝的限速步驟與葡萄糖的不同，這可能是果糖的轉(zhuǎn)運(yùn)體乙醇耐受性或果糖激酶活性大小有關(guān)。因此，在解決發(fā)酵中止問題時，不僅要考慮其接入的菌種乙醇耐受性，而且該菌種要求具有在乙醇脅迫條件下高果糖的轉(zhuǎn)運(yùn)利用能力［22］。

2.3 溫度的影響

酒精發(fā)酵所采用的溫度直接影響著酵母的生長和發(fā)酵持續(xù)的時間。在白葡萄酒和桃紅葡萄酒的生產(chǎn)過程中，通常采用低溫（10-15℃）以降低芳香物質(zhì)的損失；在紅葡萄酒的生產(chǎn)中，采用較高的溫度（18-30℃）以充分提取單寧和色素［23］。但是，溫度對葡萄糖和果糖利用差異的影響還不清楚。試驗結(jié)果表明，無論在低溫還是高溫發(fā)酵條件下，釀酒酵母均表現(xiàn)出了嗜葡萄糖的特性。但在低溫發(fā)酵時，有些菌體在剛開始發(fā)酵時具有嗜果糖特性［24］。

3 展望

綜上所述，釀酒酵母果糖利用特性不僅與酵母本身的基因背景有關(guān)，而且還與發(fā)酵條件相關(guān)。盡管胞內(nèi)己糖激酶活性對果糖利用差異的影響仍存在爭議，但HXT3和FSY1己糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因可能是葡萄酒釀酒酵母果糖利用的關(guān)鍵基因。這些關(guān)鍵基因有助于篩選和構(gòu)建高果糖利用優(yōu)良釀酒酵母。今后仍需進(jìn)一步擴(kuò)大葡萄酒釀酒酵母果糖利用的關(guān)鍵基因的認(rèn)知，同時加強(qiáng)各種發(fā)酵條件對這些關(guān)鍵基因調(diào)控方面的研究，為解決酒精發(fā)酵中止和發(fā)酵不徹底的問題提供理論依據(jù)。

［1］Dumont A, Raynal C, Raginel F, et al. The ability of wine yeast to consume fructose［J］. Australian and New Zealand Grapegrower and Winemaker, 2009, 543：52-57.

［2］Gafner J, Schütz M. Impact of glucose-fructose-ratio on stuck fermentations：practical experiences to restart stuck fermentations［J］. Viticulture and Enology Science, 1996, 51：214-218.

［3］陳瑩, 屈慧鴿, Gafber J. 葡萄糖-果糖比對發(fā)酵停滯的影響及其預(yù)防、重啟策略［J］. 中外葡萄與葡萄酒, 2010, 5：69-71.

［4］Arroyo-Lopez N, Querol A, Barrio E. Application of a substrate inhibition model to estimate the effect of fructose concentration on the growth of diverse Saccharomyces cerevisiae strains［J］. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2009, 36：663-669.

［5］Berthels NJ, Cordero Otero RR, Buer FF, et al. Discrepancy in glucose and fructose utilisation during fermentation by Saccharomyces cerevisiae wine yeast strains［J］. FEMS Yeast Research, 2004, 4：683-689.

［6］Liccioli T, Chambers P, Jiranek V, et al. A novel methodology independent of fermentation rate for assessment of the fructophilic character of wine yeast strains［J］. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2011, 38（7）：833-843.

［7］趙文英, 高莉, 賈萬利. 葡萄酒釀酒酵母嗜果糖特性的評價方法［J］. 微生物學(xué)通報, 2013, 06：1027-1032.

［8］Luyten K, Riou C, Blondin B. The hexose transporters of Saccharomyces cerevisiae play di erent roles during enological fermentation［J］. Yeast, 2002, 19：1-15.

［9］Lin Z, Li WH. Expansion of hexose transporter genes was associated with the evolution of aerobic fermentation in yeasts［J］. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28：131-142.

［10］Perez M, Luyten K. Analysis of Saccharomyces cerevisiae hexose carrier expression during wine fermentation：Both low-and high-affinity Hxt transporters are expressed［J］. FEMS Yeast Research, 2005, 5：351-361.

［11］Karpel JE, Place WR, Bisson LF. Analysis of the major hexose transporter genes in wine strains of Saccharomyces cerevisiae［J］. American Journal of Enology and Viticulture, 2008, 59：265-275.

［12］Guillaume C, Delobel P, Sablayrolles JM, et al. Molecular basis of fructose utilization by the wine yeast Saccharomyces cerevisiae：a mutated HXT3 allele enhances fructose fermentation［J］. Appl Environ Microbiol, 2007, 73：2432-2439.

［13］Galeote V, Novo M, Salema-Oom, et al. FSY1, a horizontally transferred gene in the Saccharomyces cerevisiae EC1118 wine yeast strain, encodes a high-affinity fructose/H+symporter［J］. Microbiology, 2010, 156：3754-3761.

［15］Lin Z, Li WH. Expansion of hexose transporter genes was associated with the evolution of aerobic fermentation in yeasts［J］. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28：131-142.

［16］Bernard EA. Hexokinases from yeast［J］. Methods Enzymology, 1975, 42：6-20.

［17］Berthels NJ, Cordero Otero RR, Bauer FF, et al. Correlation between glucose/fructose discrepancy and hexokinase kinetic properties in different Saccharomyces cerevisiae wine yeast strains［J］. Applied Microbiology & Biotechnology, 2008, 77： 1083-1091.

［18］Díaz-Campillo M, Urtíz N, Soto O, et al. Effect of glucose concentration on the rate of fructose consumption in native strains isolated from the fermentation of Agave duranguensis［J］. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28：3387-3391.

［19］Varela C, Cardenas J, Melo F, Agosin E. Quantitative analysis of wine yeast gene expression profiles under winemaking conditions［J］. Yeast, 2005, 22：369-383.

［20］You KM, Rosenfield CL, Knipple DC. Ethanol tolerance in the yeast Saccharomyces cerevisiae is dependent on cellular oleic acid content［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69：1499-1503.

［21］Zinnai A, Venturi F, Sanmartin C, et al. Kinetics of d-glucose and d-fructose conversion during the alcoholic fermentation promoted by Saccharomyces cerevisiae［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2013, 115：43-49.

［22］Santos J, Sousa MJ, Cardoso H, et al. Ethanol tolerance of sugar transport, and the rectification of stuck wine fermentations［J］. Microbiology, 2008, 154（2）：422-430.

［23］Mateo, JJ, Jiménez M, Pastor A. Yeast starter cultures affecting wine fermentation and volatiles［J］. Food Research International, 2001, 34：307-314.

［24］Tronchoni J, Gamero A, Arroyo-Lopez FN, et al. Differences in the glucose and fructose consumption profiles in diverse Saccharomyces wine species and their hybrids during grape juice fermentation［J］. International Journal of Food Microbiology, 2009, 1：134：237.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Advance Research on Factors of Fructose Utilization in the Wine Yeast Saccharomyces cerevisiae

Zhao Wenying Jia Wanli
（School of Chemical and Environmental Engineering North Central University Shanxi，Taiyuan 030051）

Yeasts with a high fructose consumption capability are very important for winemakers to solve problems associated with sluggish or stuck fermentations. Residual fructose at end of fermentation also can cause undesirable sweetness and risk of microbiological spoilage in wines. The fructose consumption capability is dependent on the yeast’s genetic background and on external conditions. It was reviewed on the level of the transporters cross the cellular membrane, hexose phosphorylation, and the effects of external factors（glucose concentration, ethanol stress, temperature and nitrogen resources availability）. It is of significant importance in winemaking to find out and control the key factors that can have an effect on fructose utilization at end of fermentation.

Wine Saccharomyces cerevisiae Fructose

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.005

2014-05-08

山西省回國留學(xué)人員科研資助項目

趙文英，副教授，研究方向：葡萄酒微生物；E-mail：zzr1zwy2@163.com