三種鱖魚骨骼肌生長及相關調(diào)控基因表達比較

許淼洋趙金良李傳陽錢葉周吳超錢德

（1. 上海海洋大學 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306；2. 池州市秋浦特種水產(chǎn)開發(fā)有限公司，池州 247104）

三種鱖魚骨骼肌生長及相關調(diào)控基因表達比較

許淼洋1趙金良1李傳陽1錢葉周2吳超2錢德2

（1. 上海海洋大學 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306；2. 池州市秋浦特種水產(chǎn)開發(fā)有限公司，池州 247104）

通過制作骨骼肌石蠟切片研究了鱖、斑鱖及斑鱖（♀）×鱖（♂）雜交一代不同發(fā)育時期（孵化后10D、20D、30D、60D、90D）骨骼肌肌纖維的生長特征，同時，利用qPCR技術分析了肌肉中myostatin、MyoD、myogenin三個基因mRNA的表達變化。結果表明，3種鱖魚全長均隨日齡呈增大趨勢，種間生長差異顯著，鱖生長最快，斑鱖最慢，雜交一代介于斑鱖和鱖之間。不同發(fā)育時期，3種鱖魚骨骼肌肌纖維數(shù)目較為接近，增生生長種間無明顯差異，而肌纖維平均直徑大小與其生長快慢間呈正相關，表明不同鱖魚種間生長差異主要由肌肉肥大生長引起的。鱖、斑鱖和雜交一代 myostatin mRNA在D20出現(xiàn)表達高峰，之后表達量呈下降趨勢。MyoD在D10、D20表達水平較高，后期表達水平下降；Myogenin在D20時表達量最低，之后，鱖表達量升高最為明顯，雜交一代次之，斑鱖保持平穩(wěn)。不同種類鱖魚肌肉生長差異與3種基因表達差異間存在一定相關性。

鱖魚 生長 肌纖維 myostatin MyoD myogenin mRNA表達量

鱖（Siniperca chautsi）和斑鱖（S. scherzeri）是我國特有的名貴淡水經(jīng)濟魚類。鱖是目前鱖魚養(yǎng)殖的主要品種，生長速度快，專以活餌為食，但抗病性差［1，2］。斑鱖經(jīng)馴化可食鮮餌，病害少，但生長速度較慢［3］。雜交是水產(chǎn)育種的重要手段［4］，不僅能豐富遺傳結構，結合不同類型親本的優(yōu)良性狀，提高雜種的養(yǎng)殖性能，而且能產(chǎn)生超親優(yōu)良性狀，獲得雜種優(yōu)勢［5］，在魚類品種改良中發(fā)揮明顯作用。

為獲得生長快、可食鮮餌，養(yǎng)殖性能更為優(yōu)良的鱖魚新品種，我們利用種間雜交技術獲得了斑鱖（）×鱖（♂）雜交一代，網(wǎng)箱養(yǎng)殖試驗中，雜交后代養(yǎng)殖成活率高，生長性能較斑鱖明顯提高，且餌料系數(shù)明顯降低［6］，表現(xiàn)出良好的養(yǎng)殖效果和生產(chǎn)潛力。

在大多數(shù)魚類中，個體體重的40%-60%是骨骼?。?］，骨骼肌主要由可供食用的白肌構成［8］。骨骼肌生長主要依靠肌纖維增生（hyperplasia，即數(shù)目增加）和肥大（hypertrophy，即尺寸增大）［9］。對于終生生長的魚類來說，性成熟后肌纖維仍可發(fā)生增生和肥大生長，不同發(fā)育階段肌纖維增生和肥大生長所占的比重也不相同［10］。

肌細胞的分化和生長由正向調(diào)控因子和負向調(diào)控因子進行雙向調(diào)節(jié)。其中，正調(diào)控因子主要有生肌調(diào)節(jié)因子家族（MRFS）、肌細胞增強因子2（MEF2）、胰島素樣生長因子（IGFs）等，負調(diào)控因子有分化抑制因子（Id）、肌肉生長抑制素（myostatin）、原癌基因等［8］。生肌調(diào)節(jié)因子家族在骨骼肌細胞的特化和分化過程中起關鍵作用［11］，該家族包括4個基因：MyoD、Myf5、myogenin（MyoG）、MRF4［12］。MyoD與成肌細胞增殖和肌肉增生有關，能促進多種類型細胞轉(zhuǎn)化為成肌細胞，并促使成肌細胞進一步融合、分化為成熟的肌纖維［13］。Myogenin與成肌細胞的分化和肌肉肥大相關，抑制成肌細胞的增殖，并調(diào)節(jié)單核的成肌細胞分化成多核的肌纖維［14］。Myostatin屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族，是一類重要的肌細胞生長調(diào)控因子，通過抑制生肌調(diào)節(jié)因子家族成員轉(zhuǎn)錄活性負向控制肌細胞的生長發(fā)育［15］。大量研究證明，myostatin是影響動物骨骼肌生長發(fā)育的重要候選基因［16］。

為深入了解不同鱖魚種類間的生長發(fā)育差異，本研究比較了鱖、斑鱖及其雜交一代孵化后90 d內(nèi)的骨骼肌生長特性，以及肌肉生長發(fā)育調(diào)控基因myostatin、MyoD、myogenin相對表達差異，以期為鱖魚雜交育種及魚類肌肉生長機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗在安徽省池州市秋浦特種水產(chǎn)開發(fā)有限公司養(yǎng)殖基地進行。挑選性腺成熟的斑鱖（0.5-1.1 kg）、鱖（2.3-3.8 kg），于2013年4月18日注射催產(chǎn)劑（促排卵素2號LRH-A2和馬來酸地歐酮DOM），采用人工授精方法獲得鱖、斑鱖和斑鱖（♀）×鱖（♂）雜交子一代受精卵。受精卵分別在四大家魚孵化環(huán)道內(nèi)流水孵化，水溫18-25℃，出膜后1周，分別轉(zhuǎn)入水泥池中培育，自開口攝食起，每天定時投喂相同的足量適口活餌料魚。出膜當天記為第0 d（D0），分別在出膜后第10 d（D10）、20 d（D20）、30 d（D30）、60 d（D60），90 d（D90）取樣，每批每種魚隨機取20尾，測量全長。另取10尾，取全魚或背鰭起點下背側肌肉，波恩氏液固定；同時，取相同材料于-80℃低溫冰箱保存。3種鱖魚D10、D20、D30樣本去除頭、尾后保存，D60、D90樣本去除鱗片后分別采集背鰭起點下背側第一肌節(jié)區(qū)域。

1.2 方法

1.2.1 肌肉組織切片觀察 由于骨骼肌在體軸前后、背腹不同區(qū)段間存在差異，統(tǒng)一選取背鰭起點下左背側第一肌節(jié)進行切片制作與觀察。取波恩氏液固定樣品，經(jīng)酒精脫水、二甲苯透明、石蠟透蠟、包埋、修塊，使用徠卡組織薄片切片機（Leica RM 2016）連續(xù)橫切，切片厚度為4-6 μm。37℃干燥后進行H.E染色，中性樹膠封片。在顯微鏡（Nikon Eclipse 80i）下觀察，使用NIS-Elements F軟件進行分析。

1.2.2 三種基因mRNA的相對表達量

（1）RNA提取和cDNA合成 采用TRIZOL法抽提肌肉組織中的總RNA，經(jīng)1%的瓊脂糖/EB凝膠電泳，鑒定RNA質(zhì)量。使用紫外分光光度計（eppendorf BioPhotometer）測定純度和濃度，加入RNase-free ddH2O將濃度調(diào)至500 ng/μL左右。反轉(zhuǎn)錄按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）使用說明進行，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，37℃反轉(zhuǎn)錄15 min，后經(jīng)85℃熱處理滅活，4℃保存。

（2）引物設計 根據(jù)GenBank上已報道鱖（Sini-perca chuatsi）myostatin（Gene ID：JF896453.1）、MyoD（Gene ID：JN561167.1）、myogenin（Gene ID：HQ724299.1）和β-actin（Gene ID：FJ436084.1）的序列，用Primer Premier 6.0 軟件結合BLAST設計特異性引物（表1）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，對上述合成引物和Taq PCR MasterMix進行PCR反應。PCR反應條件為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。反應結束后取擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物序列及退火溫度

（3）熒光定量PCR 取鱖魚肌肉總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA做10倍梯度稀釋，共設6個梯度。以梯度稀釋的cDNA為模板，分別以所設計的引物在實時定量PCR儀（BIO-RAD CFX96TMReal-Time System）上進行熒光定量PCR反應，以各擴增曲線的Ct值為X軸和所應各稀釋梯度的對數(shù)值為Y軸，制作出myostatin、MyoD、myogenin和β-actin的標準曲線。以各樣本反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，分別進行內(nèi)參基因β-actin和目的基因myostatin、MyoD、myogenin的實時熒光定量反應。各時期樣本進行3次生物學重復和3次技術重復，相應的空白以ddH2O為模板。

反應按照TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒使用說明，以25 μL體系，取2 μL cDNA進行擴增檢測。反應條件為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，退火30 s（依據(jù)不同引物Tm值設定退火溫度），40個循環(huán)；95℃ 10 s，在65-95℃做熔解曲線。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 熒光定量數(shù)據(jù)按照2-ΔΔCt方法計算，數(shù)據(jù)分析采用 Excel 2010（Microsoft，USA）與IBM SPSS Statistics 20，顯著性分析采用單因素ANOVA Duncan方法檢驗（P＜0.05）。

2 結果

2.1 三種鱖魚全長生長比較

鱖、斑鱖和斑鱖（♀）×鱖（♂）雜交一代（F1） 90 d內(nèi)全長生長變化情況見圖1。3種鱖魚全長均隨日齡呈增大趨勢。3種鱖魚生長間差異顯著，鱖生長最快，斑鱖最慢，F(xiàn)1代介于斑鱖和鱖之間。

圖1 斑鱖、鱖及其雜交一代不同日齡全長（n=20）

2.2 肌纖維數(shù)目與大小

3種鱖魚背側第一肌節(jié)肌纖維多成橢圓形或多邊形，其周圍包有結締組織（圖2）。

圖2 不同發(fā)育時期鱖魚背肌組織切片（20×）

2.2.1 肌纖維數(shù)目 D10日，斑鱖、鱖及其F1代背側第一肌節(jié)中肌纖維平均數(shù)目分別為110、98、92，至D90日，增生至1 183、1 052、1 141，肌纖維數(shù)目均隨日齡增加而增多（圖3）。不同時期，3種鱖魚肌纖維數(shù)目間差異不顯著。

2.2.2 肌纖維直徑 由于肌纖維橫截面多不規(guī)則，直徑測量方法參考橢圓形長短軸的測量方法求其平均直徑，以橫截面上最長兩點間的距離作為長軸，再過其中點測出垂直于長軸的短軸長度，將長、短軸的幾何平均數(shù)作為每條肌纖維的直徑。3種鱖魚肌纖維平均直徑隨日齡增加而增大（圖4）。其中，鱖肌纖維直徑增長率最快，斑鱖最慢，F(xiàn)1代介于斑

鱖和鱖之間。

圖3 三種鱖魚不同時期背側第一肌節(jié)肌纖維總數(shù)目

圖4 三種鱖魚不同時期肌纖維平均直徑

隨日齡增大，肌纖維直徑頻率分布向較大直徑組分散。D10和D20時，3種鱖魚肌纖維頻率分布相似。D30、D60和D90時，斑鱖最高直徑組均無分布。D60和D90時，F(xiàn)1代在高直徑組中分布頻率小于鱖（圖5）。

圖5 三種鱖魚不同時期肌纖維直徑與頻率分布圖

2.3 Myostatin、MyoD、myogenin基因的表達量

Myostatin、MyoD、myogenin和β-actin標準曲線的擴增效率E值和相關系數(shù)R2數(shù)據(jù)顯示，目的基因和內(nèi)參基因標準曲線的線性關系良好（90%≤E≤110%，R2≥0.98），能夠在所設置的濃度范圍內(nèi)進行準確的定量分析。myostatin基因標準曲線見圖6。

鱖、斑鱖和F1代 myostatin mRNA在D20出現(xiàn)表達高峰，之后表達量呈下降趨勢（圖7-A）。D10，鱖myostatin表達量高于斑鱖和F1；D20之后，表達

量逐減；D30時，表達量高于斑鱖和F1，而D60、D90時降至最低。斑鱖表達量至D90時略有回升，而雜交一代下降趨勢平穩(wěn)。

圖6 Myostatin基因的標準曲線

鱖、斑鱖和F1代MyoD mRNA在D10、D20表達量較高，D30之后表達量減弱（圖7-B）。D10至D60，鱖MyoD表達水平始終高于F1和斑鱖，D90時降至最低。斑鱖表達量下降最慢，在D90時表達量最高。F1代D30前最低，D60、D90介于中間。

D20時，鱖、斑鱖和F1代myogenin mRNA表達量最低，D30之后均呈升高趨勢（圖7-C）。斑鱖表達水平保持平穩(wěn)，雜交一代表達量緩慢升高，而鱖表達量升高最為明顯。

3 討論

本試驗研究了斑鱖、鱖及其雜交一代孵化后90 d內(nèi)全長生長、骨骼肌肌纖維生長特征，以及肌肉中myostatin、MyoD、myogenin三個基因mRNA表達量變化。不同發(fā)育時期的全長測定結果表明，D30前，斑鱖、鱖及其雜交一代全長間無明顯差異，D60、D90日齡時，鱖全長值最大，斑鱖最低，而雜交一代介于雙親之間，種間生產(chǎn)差異顯著。從骨骼肌生長來看，斑鱖、鱖及其雜交一代肌纖維數(shù)目與直徑均隨日齡增加而增大，同時表現(xiàn)出增生生長與肥大生長，肌肉生長與全長生長間變化趨勢一致。不同發(fā)育時期，斑鱖、鱖及其雜交一代肌纖維數(shù)目間較為接近，不同種間無明顯差異，說明鱖魚種間生長差異與其肌纖維數(shù)目間無直接關聯(lián)；而在肌纖維直徑上，3種鱖魚肌纖維平均直徑大小為：鱖＞雜交一代＞斑鱖，這與3種鱖魚全長生長差異間呈正相關關系。在肌纖維直徑分組頻率分布上，D30、D60、D90日齡，與鱖、雜交一代相比，斑鱖缺失最高直徑組；D60、D90日齡，在高直徑組中，雜交一代頻率值均低于鱖。因此推測，3種鱖魚間生長差異主要是由于肌肉肥大生長差異引起，鱖肥大生長最為顯著，斑鱖肥大生長最低，雜交一代表現(xiàn)介于雙親中間，偏向鱖。前期形態(tài)學分析結果顯示，雜交一代體型介于斑鱖與鱖之間，偏向鱖［17］。微衛(wèi)星分析結果表明，雜交一代遺傳雜合性高于斑鱖和鱖，在遺傳特征表現(xiàn)上偏向鱖［18］。

圖7 三種鱖魚不同發(fā)育時期 myostatin、MyoD、myogenin mRNA相對表達水平

研究認為，myostatin可通過抑制生肌調(diào)節(jié)因子轉(zhuǎn)錄活性，對肌肉生長起負調(diào)控作用［19］。本研究中，D20時myostatin mRNA表達水平較高，可能與該階段肌肉發(fā)育生長緩慢有關；D30后，表達水平不斷降低，而肌肉生長發(fā)育加快。D60、D90，鱖myostatin mRNA表達水平最低，斑鱖最高，而雜交一代表達水平居中，不同種類myostatin mRNA表達

水平與其肌肉生長間呈現(xiàn)對應的負相關關系。

MyoD與成肌細胞增殖和肌肉增生相關［20］。D10-D20階段，MyoD表達水平較高，可能與這一時期肌肉增生生長較快有關，后期表達水平下降，暗示肌肉增生生長下降。鱖MyoD表達水平下降最為明顯，斑鱖下降趨勢不明顯，不同種類MyoD表達水平與其各期肌纖維數(shù)目間無直接關聯(lián)。

Myogenin與成肌細胞的分化和肌肉肥大相關［21］。隨發(fā)育日齡增加，其表達量呈升高趨勢。在肌纖維直徑的頻率分布圖中，高直徑組及其頻率隨日齡增長明顯，表明肥大生長加快，而較低直徑組（增生生長）在逐步降低，說明肥大生長在肌纖維生長中比重逐漸增大。斑鱖表達水平保持平穩(wěn)，雜交一代表達量緩慢升高，而鱖表達量升高最為明顯。因此，不同種類myogenin表達水平與其肌肉肥大生長間呈明顯正相關關系。

不同發(fā)育時期，3種鱖魚的骨骼肌肌纖維總數(shù)目較為接近，不同種類間的生長差異主要由肌肉肥大生長引起。myostatin、myogenin mRNA表達水平變化與其肌肉生長間存在更為直接的相關性，它們可作為鱖魚種間生長差異的重要候選分子標志。

4 結論

鱖、斑鱖及斑鱖（♀）×鱖（♂）雜交一代3種鱖魚間生長差異顯著，鱖生長最快，斑鱖最慢，雜交一代介于斑鱖和鱖之間。肌纖維平均直徑隨日齡增加而增大，其中鱖肌纖維直徑增長率最快，斑鱖最慢，雜交一代介于斑鱖和鱖之間。

Myostatin、MyoD、myogenin 3個基因在不同種類鱖魚的不同時期均有不同的表達特征，鱖、斑鱖和雜交一代 myostatin mRNA 在D20出現(xiàn)表達高峰，之后表達量呈下降趨勢。MyoD在D10、D20表達水平較高，后期表達水平下降；Myogenin在D20時表達量最低之后，鱖表達量升高最為明顯，雜交一代次之，斑鱖保持平穩(wěn)。

［1］梁旭方. 國內(nèi)外鱖類研究及養(yǎng)殖概況［J］. 水產(chǎn)科技情報, 1996, 23（1）：13-17.

［2］黃志堅, 何建國. 鱖魚疾病的研究概況［J］. 水產(chǎn)科技情報, 1999, 26（6）：268-271.

［3］許建紅, 勞順健. 斑鱖人工養(yǎng)殖初探［J］. 科學養(yǎng)魚, 2002, 7：26.

［4］樓允東. 魚類育種學［M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 1999.

［5］樓允東, 李小勤. 中國魚類遠緣雜交研究及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應用［J］. 中國水產(chǎn)科學, 2006, 13（1）：151-158.

［6］錢葉周, 吳超, 錢德, 等. 斑鱖×鱖雜交一代與選育一代網(wǎng)箱養(yǎng)殖生長比較［J］. 水產(chǎn)養(yǎng)殖, 2013, 32（7）：1-4.

［7］S?nger AM, Stoiber W. Muscle fiber diversity and plasticity［J］. Fish Physiology, 2001, 18：187-250.

［8］成嘉, 褚武英, 張建社. 魚類肌肉組織發(fā)生和分化相關基因的研究進展［J］. 生命科學研究, 2010, 14（4）：355-362.

［9］萇建菊, 趙金良, 苗田田. 鱖慢肌胚后發(fā)育與生長特征［J］.動物學雜志, 2012, 47（4）：89-95.

［10］Rowlerson A. Veggetti A. Cellular mechanisms of post-embryonic muscle growth in aquaculture species［J］. Fish Physiology, 2001, 18：103-140.

［11］Buckingham M. Molecular biology of muscle development［J］. Cell, 1994, 78（1）：15-21.

［12］劉丑生, 趙興波, 李寧, 等. 動物肌肉生長發(fā)育調(diào)控的功能基因研究進展［J］.中國畜牧雜志, 2003, 39（5）：48-49.

［13］李永平, 梁炳生. MyoD肌形成作用機制研究進展［J］. 國際骨科學雜志, 2007, 28（1）：37-40.

［14］邱華玲, 于建興, 陳宏權. MyoG基因結構與功能研究進展［J］.生物信息學, 2006, 4：190-192.

［15］邵芳, 盧祥云, 顧志良. 魚類MSTN基因的研究進展［J］. 常熟理工學院學報：自然科學版, 2011, 25（8）：76-80.

［16］趙浩斌, 彭扣, 王玉鳳, 等. 魚類肌肉生長抑制素研究進展［J］.水生生物學 報, 2006, 30（2）：227-231.

［17］許淼洋, 郭金濤, 趙金良, 等. 斑鱖（♀）×鱖（♂）雜交子一代、子二代的形態(tài)特征分析［J］. 水產(chǎn)科學, 2013, 32（11）：636-640.

［18］李傳陽, 許淼洋, 等. 斑鱖（♀）×鱖（♂）雜交后代遺傳特征的微衛(wèi)星分析［J］. 水產(chǎn)科學, 2014, 33（2）：97-102.

［19］邵芳, 盧祥云, 顧志良. 魚類MSTN基因的研究進展［J］. 常熟理工學院學報：自然科學, 2011, 25（8）：76-80.

［20］李永平, 梁炳生. MyoD肌形成作用機制研究進展［J］. 國際骨科學雜志, 2007, 28（1）：37-40.

［21］邱華玲, 于建興, 陳宏權. MyoG基因結構與功能研究進展［J］.生物信息學, 2006, 4：190-192.

（責任編輯 李楠）

Comparison on Muscle Growth and Expression of Muscle Growthrelated Genes Among Three Mandarin Fishes

Xu Miaoyang1Zhao Jinliang1Li Chuanyang1Qian Yezhou2Wu Chao2Qian De2
（1. Laboratory of Freshwater Fisheries Germplasm Resources，Ministry of Agriculture，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；2. Chizhou Institute of Special Aquaculture，Chizhou 247104）

Muscle samples of Siniperca chuatsi ♂×S. scherzeri ♀ F1and their parents at five developmental stages in 90 days after hatching. The skeletal muscle growth characteristics were identified by numbers and diameters of muscle fibers through paraffin sections. Meantime were obtained and the mRNA expression of myostatin, MyoD, myogenin in muscle was detected by quantitative PCR. The results showed there were significant differences in growth among three mandarin fish. Siniperca chautsi grew the fastest, F1secondly and S. scherzeri kept the last. At different developmental stages, numbers of muscle fibers in three mandarin fish showed no significant difference, while the average diameters of the muscle fibers showed positive correlation with growth rate. Growth differences among three mandarin were mainly caused by muscle hypertrophy. The myostatin mRNA expression peak appeared in D20, then the expression showed a downward trend. MyoD mRNA expressed highly in D10, D20 and decreased in following days. The myogenin mRNA expression was the lowest in D20, followed by an obviously increase in Siniperca chuatsi, and F1secondly, while S. scherzeri stable. It showed correlations between muscle growth and gene expression in three mandarin at different growth stages.

Siniperca Growth Muscle fiber Myostatin MyoD Myogenin mRNA expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.031

2014-04-15

池州市秋浦特種水產(chǎn)開發(fā)有限公司專項（2012A01）

許淼洋，女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)動物遺傳育種與繁殖；E-mail：ur_mysunshine@live.cn

趙金良，男，教授，博士，研究方向：水產(chǎn)動物遺傳育種與繁殖；E-mail：jlzhao@shou.edu.cn