脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物和殼聚糖作為黏膜免疫載體的研究現(xiàn)狀

王立強(qiáng) 綜述，王洪軍 審校

沈陽軍區(qū)聯(lián)勤部 疾病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110034

預(yù)防控制病毒性傳染病的關(guān)鍵技術(shù)是研制免疫原性強(qiáng)和免疫途徑生物利用率高的有效疫苗。目前，已納入國家計(jì)劃免疫的疫苗，除少數(shù)為口服外，多數(shù)以針劑注射為主，而注射疫苗抗原用量大，針頭為潛在的感染源。相比之下，通過鼻黏膜給藥更符合原位免疫設(shè)計(jì)理念，它可以將病毒控制在感染的起始階段，具有刺激局部黏膜免疫，帶動(dòng)機(jī)體系統(tǒng)免疫的優(yōu)點(diǎn)。氣溶膠疫苗抗原對黏膜淋巴組織的刺激是產(chǎn)生分泌性IgG的必要條件，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生早期、高效和持久的免疫應(yīng)答，形成較長時(shí)間的抗病毒狀態(tài)。因此，鼻黏膜免疫載體和傳遞系統(tǒng)是氣溶膠疫苗鼻腔黏膜免疫策略成功的關(guān)鍵。

1 鼻腔給藥特點(diǎn)

鼻腔作為給藥部位具有以下生物學(xué)特征：①促進(jìn)藥物吸收：鼻腔黏膜上有很多細(xì)微絨毛，上皮細(xì)胞下有豐富的毛細(xì)血管和淋巴管，增加了藥物吸收的有效面積，使藥物容易通過鼻黏膜吸收；②避免肝臟的首過效應(yīng)和胃腸道酶的降解：藥物經(jīng)鼻黏膜吸收后直接進(jìn)入體循環(huán)，提高了藥物的生物利用度；③給藥方便：以滴入或噴入方式給藥，患者可自行完成。但鼻黏膜絨毛的另一個(gè)生理特點(diǎn)是，任何粉末或顆粒在鼻腔的總接觸時(shí)間是20～30 min，鼻黏膜上的黏液被纖毛以5～6 mm/min的速度迅速清除[1]。為了解決鼻黏膜免疫的局限性，現(xiàn)已應(yīng)用近年發(fā)展的可降解生物材料脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物和殼聚糖等緩釋或控釋微顆粒來延長疫苗在鼻腔內(nèi)的滯留時(shí)間及滯留量，達(dá)到提高有效生物利用度的目的。

2 鼻黏膜免疫

傳統(tǒng)的免疫途徑為注射給藥，機(jī)體生理順應(yīng)性差，亦有引起返祖現(xiàn)象。鼻腔黏膜免疫是一種非侵入性疫苗接種途徑。鼻腔中的酶活性相對較低，可以保護(hù)疫苗不受酶的降解。據(jù)報(bào)道，與口服疫苗相比，抗原經(jīng)鼻黏膜免疫的劑量為口服免疫劑量的1/4，但仍可在血清及黏液中誘導(dǎo)強(qiáng)有力的抗原特異性抗體反應(yīng)，鼻黏膜免疫不僅可以誘導(dǎo)產(chǎn)生全身性IgG抗體反應(yīng)，還可以產(chǎn)生黏膜IgA抗體反應(yīng)，最終形成兩道防御體系來共同保護(hù)機(jī)體免受傳染性疾病病原的侵害[2]。鼻腔中含有豐富的樹突狀細(xì)胞，可以介導(dǎo)強(qiáng)大的全身性及黏膜免疫反應(yīng)，可以防御各種抗原及病原體通過呼吸系統(tǒng)對機(jī)體的侵害。鼻黏膜免疫可在唾液腺及生殖道中產(chǎn)生抗原特異性免疫反應(yīng)，表明刺激后的淋巴細(xì)胞遷移到了共同黏膜免疫系統(tǒng)的特異性效應(yīng)因子位點(diǎn)，這符合黏膜特異性淋巴細(xì)胞歸巢的理論[3]。

3 鼻黏膜免疫載體

脂質(zhì)體（liposome）、免疫刺激復(fù)合物（immune stimulating complexes，ISCOM）和殼聚糖（chitosan，CS）是近年發(fā)展的黏膜免疫載體。

3.1 脂質(zhì)體

脂質(zhì)體是由同心脂質(zhì)雙分子層包圍一個(gè)水核形成的球形小囊，可以攜帶脂溶性和水溶性的抗原，主要由磷脂和膽固醇組成[4]。脂質(zhì)體作為一種新型疫苗載體，具有許多生物學(xué)特點(diǎn)：①增強(qiáng)抗原透入細(xì)胞的能力，能將目的抗原特異傳遞到靶細(xì)胞中，無毒無免疫原性，減少了疫苗對鼻黏膜的毒性和刺激性[5]；②穩(wěn)定抗原，防止疫苗抗原被黏膜上的酶類降解而失活，使黏膜免疫部位保持高的疫苗濃度[6]；③包被脂質(zhì)體的抗原可長期在吞噬細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞中存在，持續(xù)釋放被包封疫苗，形成長效緩釋作用[7]；④脂質(zhì)體作為鼻黏膜免疫佐劑具有生物黏附特性，膜表面帶負(fù)電荷比帶正電荷的脂質(zhì)體有更強(qiáng)的誘導(dǎo)抗體形成的能力，膜表面帶有抗原的脂質(zhì)體載體的作用比膜內(nèi)帶有抗原的脂質(zhì)體載體更強(qiáng)；特別是帶正電荷的脂質(zhì)體生物黏附性較強(qiáng)，能減少疫苗被黏膜纖毛的清除，使疫苗較長時(shí)間保持有效血藥濃度，提高生物利用度[8]；⑤可作為鼻黏膜免疫載體，刺激機(jī)體的黏膜和全身免疫應(yīng)答反應(yīng)；⑥具有生物低密度，可生物降解，易于制備，使用方便。脂質(zhì)體發(fā)揮佐劑作用不受其與抗原連接形式的影響，只須將兩者簡單混合即可[9-10]。

多種病毒抗原包入脂質(zhì)體內(nèi)可以用于鼻腔黏膜接種。此外，將變應(yīng)原包入脂質(zhì)體內(nèi)鼻腔給藥，還可抑制特異性IgE抗體反應(yīng)，從而阻止吸入或食入抗原時(shí)引起的變態(tài)反應(yīng)。Childers等[11]首次以人體為對象，研究了鼻內(nèi)接種脂質(zhì)體-蛋白菌苗后引起的免疫反應(yīng)。所用抗原系富含葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的變異鏈球菌粗制抗原制劑（C-GTF）。受試者鼻內(nèi)接種包被C-GTF的脂質(zhì)體后，鼻洗液中特異性抗C-GTF IgA水平有所提高，誘生的唾液特異性IgM和IgA2水平提高程度較低，血清中IgM和IgA水平也有增加。通過進(jìn)一步比較鼻內(nèi)接種包被C-GTF的脂質(zhì)體后誘生的免疫應(yīng)答與單純C-GTF誘生的免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體-抗原組中只有鼻洗液特異性IgA1應(yīng)答顯著強(qiáng)于單純抗原組，提示脂質(zhì)體可影響局部黏膜免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，而不影響全身應(yīng)答反應(yīng)。

脂質(zhì)體作為氣霧疫苗載體，其安全性日益受到關(guān)注。小鼠和人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，脂質(zhì)體鼻腔給藥是安全的。賴氨匹林脂質(zhì)體家兔鼻腔給藥[12]，20 d后處死，顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)鼻黏膜血管無病理改變，纖毛完好，組織無出血或炎細(xì)胞浸潤；而給予水溶液的對照組，鼻黏膜血管有輕度損害，纖毛卷曲，有少許炎細(xì)胞浸潤。脂質(zhì)體作為載體存在的問題是：①脂質(zhì)體的尾部脂肪酸易被氧化，影響其穩(wěn)定性；②小脂質(zhì)體囊相互融合成大脂質(zhì)體，易破壞脂質(zhì)體膜；③批間差異較大。

3.2 免疫刺激復(fù)合物

ISCOM是一類以脂質(zhì)（lipid）、皂素（saponin）為主的復(fù)合型佐劑。在ISCOM基質(zhì)中，皂素分子Quil A結(jié)合于固醇類和磷脂酰膽堿，可形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其直徑為30～40 nm，能夠與抗原疏水部分結(jié)合，從而將其親水面暴露于免疫細(xì)胞[13]。

ISCOM是Morein于1984年發(fā)現(xiàn)的一種新的疫苗輸送系統(tǒng)[14]。其作用機(jī)制是，捕獲大量抗原分子并釋放給抗原提呈細(xì)胞，刺激B細(xì)胞反應(yīng)，增加抗體產(chǎn)生，誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)，刺激產(chǎn)生CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子IL-12，促進(jìn)MHC分子的表達(dá)，促進(jìn)CTL活性和細(xì)胞免疫[15]。ISCOM也可以促進(jìn)病毒蛋白的攝取、加工和呈遞給特異性CD8+T淋巴細(xì)胞，但在鼻腔內(nèi)上皮細(xì)胞不能攝取ISCOM-Matrix投遞的抗原，暗示鼻內(nèi)免疫時(shí)，上皮細(xì)胞不能被特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別并殺死[16]。其優(yōu)點(diǎn)是能夠快速、有效地將抗原提呈給免疫系統(tǒng)，可在免疫后迅速激活機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答效果。其復(fù)合疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比，疫苗抗原的需求量減少至1/10～1/2[17]，能夠增加抗體反應(yīng)水平和持久性，也能產(chǎn)生強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。而且，復(fù)合形成的蛋白抗原性與游離形式的溶液相比穩(wěn)定性增強(qiáng)。IS?COM疫苗的穩(wěn)定性極好，能被冷凍、凍干，并能溶解于多種緩沖液中，有利于疫苗的保存、貯藏。

ISCOM作為疫苗載體能夠發(fā)揮免疫佐劑作用：①能夠引發(fā)MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類CTL反應(yīng)，平衡Th1和Th2反應(yīng)，產(chǎn)生包括所有同型和亞型的抗體反應(yīng)，增強(qiáng)長期的記憶反應(yīng)[18]，具有免疫調(diào)節(jié)作用；②誘導(dǎo)IL-2、IFN-γ、IL-12等多種細(xì)胞因子，細(xì)胞因子之間具有相互激發(fā)誘導(dǎo)連鎖反應(yīng)作用[19]；③可以黏附用藥，滿足黏膜輸送系統(tǒng)的要求；鼻腔接種或口服后能引起多種反應(yīng)，包括遠(yuǎn)端的腸道、生殖道的黏膜反應(yīng)；④能更有效地遞呈抗原，適于各年齡段人員免疫；⑤ISCOM包含的抗原可以是一種病毒的包膜蛋白、細(xì)胞膜蛋白或含疏水區(qū)的任何抗原；非疏水性抗原可以加入疏水的尾部，或通過酸處理暴露隱藏的疏水區(qū)再整合到ISCOM中[20]，因此能在相對長的時(shí)間內(nèi)起作用。

自1984年Morein等公布ISCOM技術(shù)后，這一新的佐劑系統(tǒng)已在多種疫苗中得到應(yīng)用。馬流感病毒和ISCOM整合疫苗已于1989年在瑞典上市，并沒有嚴(yán)重副反應(yīng)。人用疫苗目前僅Flu-ISCOM進(jìn)入臨床試驗(yàn)，其Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)已完成，期待這種新的技術(shù)能給傳統(tǒng)的疫苗帶來變革。將含有ISCOM的疫苗注射接種后，T細(xì)胞應(yīng)答首先在引流淋巴結(jié)中被檢測到，接種50 d后，在骨髓中也有大量抗體產(chǎn)生細(xì)胞[21]，由于抗原提呈細(xì)胞的內(nèi)體小泡和泡質(zhì)溶膠的雙重作用，含ISCOM的疫苗可以通過MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ兩種途徑將抗原提呈給免疫系統(tǒng)，同時(shí)激活CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞[22]。含ISCOM的疫苗的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以經(jīng)口服或鼻腔接種獲得免疫，且能達(dá)到在局部和全身黏膜表面誘導(dǎo)有效和特異的黏膜免疫應(yīng)答。小鼠鼻腔接種流感ISCOM疫苗后，可誘導(dǎo)堅(jiān)強(qiáng)的黏膜抗體和CTL應(yīng)答反應(yīng)，并可抵抗攻擊感染。氣霧ISCOM疫苗除了可以引發(fā)MHC-Ⅰ介導(dǎo)的CTL活性外，還有全身性免疫應(yīng)答，包括特異抗體、分泌型IgA、CD8+T細(xì)胞應(yīng)答等[23]。重復(fù)低劑量氣霧免疫ISCOM疫苗不會(huì)引起免疫耐受[24]。

ISCOM在使用上也存在一些限制性因素。它并非可以和任何抗原都能形成復(fù)合體[25]，只有那些含疏水基團(tuán)很多的抗原或免疫原才能與ISCOM形成復(fù)合體，含親水基團(tuán)多的抗原（免疫原）不適合與IS?COM佐劑混合制備疫苗。

3.3 殼聚糖

殼聚糖是帶陽電荷的線性多糖，是一種生物粘性物質(zhì)，由殼質(zhì)所產(chǎn)生，存在于甲殼類的殼中，通過脫乙酰作用而形成，可有一系列的脫乙酰程度和不同的相對分子質(zhì)量。殼聚糖谷氨酸鹽的平均相對分子質(zhì)量約為250×103，脫乙酰程度為80%以上，水溶性（pH6.5），在單一的殼聚糖溶液組方時(shí)，其生物利用度可增加5～6倍[26]。殼聚糖又是一種天然聚多糖，有良好的生物相容性和生物可降解性，其分子中的葡糖胺基荷正電，與荷負(fù)電的DNA可產(chǎn)生靜電作用，凝聚為多聚復(fù)合物[27]，這種納米粒子可以克服疫苗經(jīng)黏膜吸收的生理學(xué)屏障，通過細(xì)胞內(nèi)吞途徑，抵達(dá)黏膜下淋巴組織，能夠與鼻上皮細(xì)胞及其黏液層起強(qiáng)烈作用，以保證在被黏膜纖毛清除之前使疫苗通過鼻黏膜[28]。殼聚糖還可以通過上皮細(xì)胞之間緊密連接處的暫時(shí)開放而增加極性疫苗細(xì)胞旁路搬運(yùn)的能力。實(shí)驗(yàn)證明，殼聚糖遞送系統(tǒng)可明顯增強(qiáng)流感疫苗在小白鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)。殼聚糖納米粒比溶液制劑更有效地促進(jìn)黏膜對疫苗的吸收，增強(qiáng)機(jī)體對疫苗的免疫反應(yīng)[29]。

殼聚糖是自然界中惟一含游離氨基堿性基團(tuán)的可食性動(dòng)物纖維，殼聚糖作為黏膜疫苗載體，具有良好的生物相溶性、低毒性及促滲作用[30]，在鼻黏膜免疫領(lǐng)域倍受關(guān)注，它能與活體組織相容，被體內(nèi)的溶菌酶、胃蛋白酶降解后，降解產(chǎn)物能完全被人體吸收，無毒、無副作用。殼聚糖還具有良好的凝結(jié)能力和免疫刺激活性。研究證明，與普通的水溶性流感疫苗相比，含有可溶性殼聚糖的流感疫苗能促進(jìn)小鼠體內(nèi)血凝抑制抗體的產(chǎn)生[31]。基于上述生物特性，殼聚糖在黏膜免疫中得到了廣泛應(yīng)用。殼聚糖作為黏膜疫苗載體的作用機(jī)制表現(xiàn)如下：①黏膜吸附特性：殼聚糖分子中的羥基、氨基可與黏膜粘液中帶負(fù)電荷的糖蛋白形成氫鍵而產(chǎn)生黏附作用，延緩抗原的清除，使其有更多的時(shí)間與黏膜接觸，使抗原易穿過黏膜屏障，與黏膜下的淋巴組織發(fā)生作用；殼聚糖的黏膜吸附性能誘導(dǎo)黏膜和系統(tǒng)免疫反應(yīng)，與小腸中下游黏膜之間的黏附性，能夠加強(qiáng)它與腸腔表面的緊密接觸，有利于微球繼續(xù)向集合淋巴結(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而引起全身及黏膜免疫反應(yīng)[32]；②促滲作用：殼聚糖可使黏膜上皮細(xì)胞緊密結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而開放跨膜通道，提高黏膜通透性，促蛋白抗原大分子的跨黏膜吸收；用殼聚糖及其衍生物作用于細(xì)胞單層，可引起跨上皮細(xì)胞電阻降低，促進(jìn)疫苗抗原順利通過細(xì)胞旁路進(jìn)入體內(nèi)，增強(qiáng)疫苗的滲透吸收，提高抗原的生物利用度[33]；③殼聚糖在黏膜免疫中的佐劑效應(yīng)：疫苗經(jīng)鼻黏膜免疫產(chǎn)生的免疫反應(yīng)常不能達(dá)到理想的免疫效果，故須依賴一些有效的黏膜免疫佐劑和載體系統(tǒng)，而殼聚糖能夠提高巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、漿細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及多形核細(xì)胞的活性和積聚能力，阻止病原微生物的侵入和定居，誘導(dǎo)細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-4等的產(chǎn)生，激發(fā)有效的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，中和細(xì)菌毒素，增強(qiáng)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。殼聚糖自身還可引起IL-10釋放及黏膜IL-4的表達(dá)，并激活脾臟的CD4+T細(xì)胞，明顯上調(diào)黏膜Th2免疫反應(yīng)，巨噬細(xì)胞攝取殼聚糖后即可活化[34]。殼聚糖的這種非特異免疫佐劑作用與其脫乙?；潭群蛣┬陀嘘P(guān)，脫乙?；潭雀叩目扇苄詺ぞ厶腔钚暂^弱，而顆粒狀殼聚糖更易誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的吞噬作用[35]。殼聚糖可有效促進(jìn)局部（特別是黏膜局部）的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)抗原傳遞系統(tǒng)功能，具有免疫佐劑和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。

4 結(jié)語

綜上所述，脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物和殼聚糖作為新型鼻黏膜免疫載體或佐劑，為鼻腔黏膜途徑給藥開拓了更為廣闊的應(yīng)用前景。目前脂質(zhì)體尚存在不夠穩(wěn)定等缺點(diǎn)，給長期貯存及用藥帶來不便。應(yīng)結(jié)合鼻腔黏膜的生理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來綜合考慮脂質(zhì)體的粒徑大小、表面電荷和制備方法等因素，以達(dá)到最佳應(yīng)用效果。免疫刺激復(fù)合物佐劑是適合所有疫苗的通用免疫調(diào)解技術(shù)平臺，它能夠刺激機(jī)體對常規(guī)疫苗用量1/10的抗原產(chǎn)生相同或更強(qiáng)的抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且這種反應(yīng)持續(xù)時(shí)間長，未見過敏反應(yīng)或其他嚴(yán)重毒害事件發(fā)生的報(bào)道。以ISCOM為載體的抗宮頸癌疫苗和高效低毒流感疫苗已進(jìn)行Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)，市場潛力巨大。殼聚糖是天然來源的多糖類陽離子高分子材料，來源廣泛，納米微粒、微球制備工藝簡單，不需有機(jī)溶劑，有利于疫苗的穩(wěn)定。目前水溶性殼聚糖品種不多，一般需要溶解于醋酸等弱酸溶液中，由于pH值較低，DNA疫苗容易在制備過程中降解，因而開發(fā)和采用水溶性好的殼聚糖衍生物是十分必要的。隨著研究的深入和新劑型的開發(fā)，殼聚糖納米載體和PEG交聯(lián)殼聚糖季銨鹽水凝膠作為佐劑和載體，將會(huì)在黏膜免疫產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[25]。因此，新型鼻黏膜疫苗的開發(fā)，主要通過鼻黏膜表面抗原呈遞系統(tǒng)的改進(jìn)來實(shí)現(xiàn)。國外科學(xué)家已將痘病毒氣霧疫苗成功地應(yīng)用于猴體試驗(yàn)，安全有效，艾滋病和人乳頭狀瘤病毒氣霧疫苗、麻疹氣霧疫苗已經(jīng)世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)。

[1]Corbanie E A,Matthijs M G R,van Eck J H H,et al.Depo?sition of differently sized airborne microspheres in the respira?tory tract of chickens[J].Avian Parhol,2006,35(6):475-485.

[2]Bivas-Benita M,Zwier R,Junginger H E,et al.Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route[J].Euro J Pharm Biopharm,2005,61:214-218.

[3]Corbett M,Bogers W M,Heeney J L,et al.Aerosol immuni?zation with NYVAC and MVA vectored vaccines is safe,sim?ple,and immunogenic[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(6):2046-2051.

[4]Kawakita A,Shirasaki H,Yasutomi M,et al.Immunotherapy with oligomannose-coated liposomes ameliorates allergic symp?toms in a murine food allergy model[J].Allergy,2012,67(3):371-379.

[5]Romero E L,Morilla M J.Topical and mucosal liposomes for vaccine delivery[J].Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobio?technol,2011,3(4):356-375.

[6]Tiwari B,Agarwal A,Kharya A K,et al.Immunoglobulin im?mobilized liposomalconstructs fortransmucosalvaccination through nasal route[J].J Liposome Res,2011,21(3):181-193.

[7]Heurtault B,Frisch B,Pons F.Liposomes as delivery systems for nasal vaccination:strategies and outcomes[J].Expert Opin Drug Deliv,2010,7(7):829-844.

[8]Christensen D,Foged C,Rosenkrands I,et al.CAF01 lipo?somes as a mucosal vaccine adjuvant:In vitro and in vivo in?vestigations[J].Int J Pharm,2010,390(1):19-24.

[9]Ishii M,Kojima N.Mucosal adjuvant activity of oligomannosecoated liposomes for nasal immunization[J].Glycoconj J,2010,27(1):115-123.

[10]Migliore M M,Vyas T K,Campbell R B,et al.Brain deliv?ery of proteins by the intranasal route of administration:a comparison of cationic liposomes versus aqueous solution for?mulations[J].J Pharm Sci,2010,99(4):1745-1761.

[11]Childers N K,Tong G,Michalek S M.Nasal immunization of humanswith dehydrated Liposomescontaining streptococcas mutansantigen[J].OralMicrobiolImmunol,1997,12(6):329-336.

[12]董澤民.賴氨匹林脂質(zhì)體鼻腔給藥的研究[J].中國醫(yī)藥雜志,1995,26(5):199-202.

[13]Sj?lander S,Drane D,Davis R,et al.Intranasal immunisation with influenza-ISCOM induces strong mucosal as well as sys?temic antibody and cytotoxic T-lymphocyte responses[J].Vac?cine,2001,19(28-29):4072-4980.

[14]Morein B,Villacrés-Eriksson M,L?vgren-Bengtsson K.Iscom,a delivery system for parenteral and mucosal vaccination[J].Dev Biol Stand,1998,92:33-39.

[15]Beacock-Sharp H,Donachie A M,Robson N C,et al.A role for dendritic cells in the priming of antigen-specific CD4+and CD8+T lymphocytes by immune-stimulating complexes in vivo[J].Int Immunol,2003,15(6):711-720.

[16]Moore D P,Echaide I,Verna A E,et al.Immune response to Neospora caninum native antigens formulated with immune stimulating complexes in calves[J].Vet Parasitol,2011,175(3-4):245-251.

[17]Heldens J G,Pouwels H G,Derks C G,et al.Duration of immunity induced by an equine influenza and tetanus combi?nation vaccine formulation adjuvanted with ISCOM-Matrix[J].Vaccine,2010,28(43):6989-6996.

[18]Smith R E,Donachie A M,McLaren F H,et al.Preservation of mucosal and systemic adjuvant properties of ISCOM in the absence of functional interleukin-4 or interferon-gamma[J].Im?munology,1998,93(4):556-562.

[19]Kodama S,Hirano T,Noda K,et al.Nasal immunization with plasmid DNA encoding P6 protein and immunostimulatory complexes elicits nontypeable Haemophilus influenzae-specific long-term mucosal immune responses in the nasopharynx[J].Vaccine,2011,29(10):1881-1890.

[20]Hu K F,L?vgren-Bengtsson K,Morein B.Immunostimulating complexes(ISCOM)for nasal vaccination[J].Adv Drug Deliv Rev,2001,51(1-3):149-159.

[21]Heldens J G,Pouwels H G,Derks C G,et al.The first safe inactivated equine influenza vaccine formulation adjuvanted with ISCOM-Matrix that closes the immunity gap[J].Vaccine,2009,27(40):5530-5537.

[22]Pandey R S,Dixit V K.Evaluation of ISCOM vaccines for mucosal immunization against hepatitis B[J].J Drug Target,2010,18(4):282-291.

[23]Huisman W,Schrauwen E J,Pas S D,et al.Evaluation of IS?COM-adjuvanted subunit vaccines containing recombinant fe?line immunodeficiency virus Rev,OrfA and envelope protein in cats[J].Vaccine,2008,26(21):2553-2561.

[24]Smith R E,Donachie A M,Mowat A M.Immune stimulating complexes as mucosal vaccines[J].Immunol Cell Biol,1998,76(3):263-269.

[25]Furrie E,Smith R E,Turner M W,et al.Induction of local innate immune responses and modulation of antigen uptake as mechanisms underlying the mucosal adjuvant properties of immune stimulating complexes(ISCOM)[J].Vaccine,2002,20(17-18):2254-2262.

[26]Fazil M,Md S,Haque S,et al.Development and evaluation of rivastigmine loaded chitosan nanoparticles for brain targeting[J].Eur J Pharm Sci,2012,47(1):6-15.

[27]Verheul R J,Hagenaars N,van Es T,et al.A step-by-step approach to study the influence of N-acetylation on the adju?vanticity of N,N,N-trimethyl chitosan(TMC)in an intranasal nanoparticulate influenza virus vaccine[J].Eur J Pharm Sci,2012,45(4):467-474.

[28]Hashem F M,Fahmy S A,El-Sayed A M,et al.Develop?mentand evaluation ofchitosan microspheresfortetanus,diphtheria and divalent vaccines:a comparative study of sub?cutaneous and intranasaladministration in mice[J].Pharm Dev Technol,2013,18(5):1175-1185.

[29]Svindland S C,Jul-Larsen ?,Pathirana R,et al.The muco?sal and systemic immune responses elicited by a chitosan-ad?juvanted intranasal influenza H5N1 vaccine[J].Influenza Oth?er Respi Viruses,2012,6(2):90-100.

[30]Patil S B,Sawant K K.Chitosan microspheres as a delivery system for nasal insufflation[J].Colloids Surf B Biointerfaces.2011,84(2):384-389.

[31]Moon H J,Lee J S,Talactac M R,et al.Mucosal immuniza?tion with recombinantinfluenza hemagglutinin protein and poly gamma-glutamate/chitosan nanoparticles induces protec?tion against highly pathogenic influenza A virus[J].Vet Micro?biol,2012,160(3-4):277-289.

[32]Nazar H,Fatouros D G,van der Merwe S M,et al.Thermo?sensitive hydrogelsfornasaldrug delivery:the formulation and characterisation of systems based on N-trimethyl chitosan chloride[J].Eur J Pharm Biopharm,2011,77(2):225-232.

[33]Slütter B,Bal S,Keijzer C,et al.Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles:nanoparti?cle characteristics determine quality and strength of the anti?bodyresponse in mice againstthe encapsulated antigen[J].Vaccine,2010,28(38):6282-6291.

[34]Jintapattanakit A,Peungvicha P,Sailasuta A,et al.Nasal ab?sorption and local tissue reaction of insulin nanocomplexes of trimethyl chitosan derivatives in rats[J].J Pharm Pharmacol,2010,62(5):583-591.

[34]du Plessis L H,Lubbe J,Strauss T,et al.Enhancement of nasal and intestinal calcitonin delivery by the novel pheroid fatty acid based delivery system,and by N-trimethyl chitosan chloride[J].Int J Pharm,2010,385(1-2):181-186.

[35]Wang X,Zheng C,Wu Z,et al.Chitosan-NAC nanoparticles as a vehicle for nasal absorption enhancement of insulin[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2009,88(1):150-161.