外體和病毒感染

張曉陽，董春艷，段銘

吉林大學(xué)人獸共患病研究所/人獸共患病研究教育部重點實驗室，動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062

外體（exosome）是一種直徑為30～100 nm 的源自細(xì)胞內(nèi)體（endosome）的小囊泡，是細(xì)胞分配和區(qū)劃管理其內(nèi)生物大分子的途徑之一。1987 年，Johnstone 及其同事在網(wǎng)織紅細(xì)胞變成成熟紅細(xì)胞的研究中首次發(fā)現(xiàn)了這一特化的“細(xì)胞器”[1]?，F(xiàn)有研究結(jié)果證實，許多哺乳動物的細(xì)胞都能分泌外體，例如腸上皮細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血小板、抗原遞呈細(xì)胞、肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞。被釋放的外體可與受納細(xì)胞表面的受體結(jié)合，通過與細(xì)胞膜融合，將其內(nèi)含有的生物大分子釋放入受納細(xì)胞，從而影響和調(diào)控系列的生物學(xué)進(jìn)程，如血管生成、細(xì)胞增殖、基因表達(dá)和免疫應(yīng)答等。細(xì)胞可通過動態(tài)地改變外體的分泌、釋放和內(nèi)容物的組成來應(yīng)答多樣化的生物學(xué)事件（包括微生物的感染）[2-4]。

病毒是嚴(yán)格寄生于宿主細(xì)胞的一種傳染性因子。病毒感染致病涉及病毒與機體兩個復(fù)雜生物系統(tǒng)及其二者間的相互作用。一方面，宿主表現(xiàn)出對病毒感染的主動限制；另一方面，病毒會主動地使宿主細(xì)胞為其感染和復(fù)制提供必需的細(xì)胞機器。外體作為一種特化的“細(xì)胞器”，必不可少地出現(xiàn)在了病毒和宿主細(xì)胞相互作用的過程中。在此，我們以介紹外體的組成和生物發(fā)生為基礎(chǔ)，綜述近年來其在病毒感染致病中的研究成果，以期為病毒感染致病機理的研究提供新的切入點。

1 外體的組成

外體是一種細(xì)胞內(nèi)源性的具有雙層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，由蛋白質(zhì)、脂類和核酸參與構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)和內(nèi)容物的組分由分泌外體的供體細(xì)胞的類型、功能及細(xì)胞外的生物學(xué)微環(huán)境所決定。研究人員應(yīng)用質(zhì)譜法、蛋白質(zhì)免疫印跡法和薄層色譜法等系列方法，對外體的組分進(jìn)行了分析和鑒定。

外體的蛋白質(zhì)組分分為兩大類，即遍存于各類型細(xì)胞分泌外體的非特異性蛋白和僅存在于某種特定細(xì)胞源性外體的特異性蛋白。其中前者是維持外體生物發(fā)生、結(jié)構(gòu)及功能的必需蛋白質(zhì)[3]，例如參與構(gòu)成細(xì)胞骨架的蛋白（肌動蛋白、肌球蛋白重鏈及微管蛋白等）、黏附分子（CD11、CD13、CD18 等）、膜融合相關(guān)蛋白（膜聯(lián)蛋白和網(wǎng)格蛋白重鏈等）、代謝酶（轉(zhuǎn)酮醇酶、醛還原酶、ATP 檸檬酸裂解酶等）、分子伴侶（熱激蛋白70、84、90 等）、多囊泡體（multi-vesicular body，MVB）形成蛋白（Alix和Tsg101 等）、T細(xì)胞刺激分子（CD86、MHCⅠ和Ⅱ等）等，部分蛋白質(zhì)組分的功能尚待進(jìn)一步研究[4]。而后者主要是源自釋放外體的供體細(xì)胞中的特異性蛋白，并執(zhí)行特定的生物學(xué)功能，例如來自受感染細(xì)胞的包含有病原抗原的外體能夠激活樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）和巨噬細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞[3]。

人們對于外體中脂質(zhì)組分的研究結(jié)果有限，目前僅對網(wǎng)狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、DC和B 淋巴細(xì)胞所分泌外體的脂質(zhì)組分做了些許研究。結(jié)果表明，外體膜上的脂質(zhì)主要有鞘磷脂、溶血卵磷脂、飽和脂肪酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇和膽固醇等。由于外體的來源不同，其脂質(zhì)組分的含量和功能也各不相同，例如溶血磷脂酸是一種對MVB的結(jié)構(gòu)及外體的生物發(fā)生都非常重要的脂質(zhì)[4]。

此外，大量新近研究結(jié)果證實，外體還可將mRNA和microRNA（miRNA）從供體細(xì)胞運輸至受納細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)控受納細(xì)胞的基因表達(dá)和生物學(xué)功能[5]。例如，神經(jīng)元特異高表達(dá)的miR-124可借由外體進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞，上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)GLT1蛋白的表達(dá)量，促進(jìn)其對谷氨酸的攝取[6]；嗎啡和人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的Tat 蛋白刺激星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)miR-29 的表達(dá)，過多的miR-29 通過外體傳遞至神經(jīng)元后會造成神經(jīng)元的損傷[7]。

2 外體的生物發(fā)生

細(xì)胞內(nèi)體是動物細(xì)胞內(nèi)由膜包圍的具有囊泡結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，是細(xì)胞囊泡運輸?shù)臉屑~環(huán)節(jié)和分選中心。外體的生物發(fā)生依托于內(nèi)體，其過程可分為兩個步驟：首先，在內(nèi)體膜上完成生物大分子的分選；其次，內(nèi)體通過向腔內(nèi)反向內(nèi)陷出芽的方式產(chǎn)生小囊泡，小囊泡逐漸增多聚集后的內(nèi)體又被稱為MVB，MVB 與細(xì)胞膜融合后即可將其內(nèi)小囊泡即外體釋放進(jìn)入細(xì)胞外間隙[4]。

MVB 的生物發(fā)生分為主動和被動兩種方式。主動方式需要許多特定蛋白和脂類分子的參與，例如泛素化是將蛋白分子分選進(jìn)入MVB 的機制之一。內(nèi)體分選復(fù)合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）系統(tǒng)是真核細(xì)胞中完成膜蛋白分揀的重要分子機器，包括ESCRT-0、-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ和Vps4-Vta1 共5 個蛋白-蛋白復(fù)合物，能識別泛素標(biāo)記。泛素標(biāo)記的“待轉(zhuǎn)運”蛋白分子被轉(zhuǎn)運到內(nèi)體膜上，通過ESCRT 系統(tǒng)將含有這些蛋白分子的膜組分分選并內(nèi)陷出芽形成小囊泡，釋放入內(nèi)體腔中。MVB形成后，ESCRT系統(tǒng)會從MVB膜上分離，再去參與轉(zhuǎn)運新的蛋白分子[8-9]。

被動方式是一種不依賴于泛素化的蛋白分子分選機制。蛋白質(zhì)分子首先聚集，聚集后的蛋白分子會表現(xiàn)出新的物理特性和微結(jié)構(gòu)域，而ESCRT 系統(tǒng)可與微結(jié)構(gòu)域依次發(fā)生相互作用，從而將待分選分子轉(zhuǎn)運進(jìn)入MVB[10-11]。此外，脂筏中富含的四跨膜蛋白或膽固醇可參與自身的被動分選[10]。

3 外體與病毒感染

受病毒感染的宿主細(xì)胞分泌的特異性外體中所包含的功能蛋白、mRNA/miRNA、病原組分等，因病毒類型、病毒的生命周期，以及受感染細(xì)胞類型的差異而有所不同。在病毒感染和致病的進(jìn)程中，外體作為細(xì)胞間“通訊”交互的工具可為病毒和宿主同時利用，作為感染致病和抗病毒效應(yīng)的媒介。

3.1 參與病毒的免疫逃避

哺乳動物雖具有完整的、高度進(jìn)化的免疫保護(hù)系統(tǒng)，有些病毒仍能在其中長期存在。這主要是由于病毒在長期的宿主免疫選擇壓力下產(chǎn)生了多種對抗宿主免疫系統(tǒng)的機制。HIV 的Nef 蛋白不具酶活性，具有銜接蛋白的作用，可下調(diào)CD4、主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ和Ⅱ等分子，在對抗宿主免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)Nef 可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)MVB數(shù)量的增加和外體的分泌，同時借助外體促進(jìn)Nef從受感染細(xì)胞運出[12-13]，從而遠(yuǎn)程發(fā)揮Nef 的功能，例如誘導(dǎo)CD4+T 細(xì)胞凋亡[14]。免疫活性細(xì)胞上的人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）具有向抗原特異性T 細(xì)胞傳遞抗原多肽的生物學(xué)特性。1 型單純皰疹病毒（herpes simplex virus-1，HSV-1）編碼的糖蛋白B 可以和HLA-DR 分子形成復(fù)合體，改變HLA-DR在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運途徑，使其不能正常轉(zhuǎn)運至細(xì)胞膜，而是通過外體的方式釋放至細(xì)胞外，最終抑制了抗原遞呈[15]。Klibi[16]等發(fā)現(xiàn)，EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染的鼻咽癌細(xì)胞釋放的外體中包含有半乳凝素-9。半乳凝素-9 及其受體Tim-3 信號通路的活化可抑制CD4+和CD8+T 細(xì)胞，產(chǎn)生抑制信號，導(dǎo)致Th1 淋巴細(xì)胞凋亡和抑制Th1型免疫。EBV通過外體將半乳凝素-9遞送至受納細(xì)胞后，可以誘導(dǎo)EBV特異的CD4+T細(xì)胞凋亡和抑制Th1型免疫。

3.2 參與病毒的感染和致病

HIV 實現(xiàn)有效感染宿主細(xì)胞需要其特異受體CD4 分子和輔助受體CXCR4 或CCR5 的存在，這些受體分子的分布決定了HIV的細(xì)胞親嗜性。有研究表明，外體可以將CXCR4 或CCR5 遞送至該受體陰性的受納細(xì)胞，從而局部增加了HIV 易感細(xì)胞的類型，擴(kuò)大了HIV的感染范圍，為病毒提供了新的存在場所[17-18]。Kadiu 等[19]通過對HIV-1感染單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞分泌外體的組分鑒定，證實其包含有病毒粒子、病毒的組分、細(xì)胞因子（IL-3、IL-4、IL-8和TNF-α 等）、抗原遞呈效應(yīng)分子（HLA-DRA1和HLA-DRB1 等）和黏附分子（fibronectin 等）等，同時功能學(xué)研究結(jié)果表明外體作為參與者協(xié)助了HIV-1的感染及其在機體內(nèi)的散播。EBV編碼的潛伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）是一個具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的癌蛋白。EBV感染的宿主細(xì)胞可通過分泌包含LMP1 的外體來激活受納細(xì)胞內(nèi)的ERK和AKT 信號通路，進(jìn)而影響受納細(xì)胞的生長、介導(dǎo)免疫抑制、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境[20-21]。Meckes等[20]在EBV感染的B 細(xì)胞和未感染的單核細(xì)胞來源的DC（monocyte-derived DC，MDDC）共培養(yǎng)的實驗中發(fā)現(xiàn)，EBV 編碼的miRNA 出現(xiàn)在MDDC 中，而miRNA遞送是通過外體的途徑來完成的，功能上表現(xiàn)出抑制受納細(xì)胞內(nèi)靶基因的表達(dá)（如CXCL11），進(jìn)而有助于病毒持續(xù)性感染的建立。HSV感染細(xì)胞分泌的外體可以將病毒的被膜蛋白和糖蛋白等轉(zhuǎn)運至未感染的受納細(xì)胞，其生物學(xué)效應(yīng)包括促進(jìn)潛伏期病毒的再激活、協(xié)助病毒感染半受納型細(xì)胞和增加病毒感染成功的幾率等[22]。在丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）的研究中，Ramakrishnaiah 等[23]證實HCV 感染細(xì)胞釋放的外體可將病毒的RNA和蛋白遞送至臨近的細(xì)胞，并建立增殖性感染。

3.3 參與宿主的抗病毒應(yīng)答

宿主的抗病毒免疫由非特異性和特異性免疫兩部分組成。前者包括組織屏障、非特異性免疫細(xì)胞和非特異性免疫分子；后者由特異性體液免疫和細(xì)胞免疫組成。呼吸道分泌的黏液是呼吸道局部非特異性免疫的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，人的氣管、支氣管上皮細(xì)胞所分泌外體的蛋白組成包括了帶有α-2，6 唾液酸修飾的黏蛋白，初步的功能學(xué)研究表明該外體可以有效地中和流感病毒，具備非特異性黏膜免疫的生物學(xué)功能[24]。滋養(yǎng)層細(xì)胞是胎盤屏障的重要組成部分，是胎兒避免宮內(nèi)感染的重要原因。定位于染色體19q13.41 的miRNA 簇為胎盤專有表達(dá)，滋養(yǎng)層細(xì)胞可通過外體將該miRNA 簇遞送至受納細(xì)胞，通過誘導(dǎo)自噬來弱化病毒在受納細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[25]。人胞嘧啶核苷脫氨酶家族的APOBEC3G（A3G）蛋白可誘導(dǎo)HIV的DNA上的胞嘧啶替換為尿嘧啶，導(dǎo)致完整的前病毒數(shù)量減少，阻止HIV復(fù)制。Khatua 等[26]的研究結(jié)果表明，宿主細(xì)胞分泌的外體可將A3G 蛋白遞送給受納細(xì)胞，并抑制受納細(xì)胞內(nèi)HIV 的復(fù)制。此外，在EBV 的研究中發(fā)現(xiàn)，源自EBV 轉(zhuǎn)化B 細(xì)胞系的外體包含有EBV 的糖蛋白gp350，由后者和B細(xì)胞表面CD21發(fā)生相互作用，進(jìn)而使得外體可特異性地靶向B 細(xì)胞，該相互作用可以抑制EBV 對原代B 細(xì)胞的感染，具有調(diào)控EBV感染的作用[27]。Admyre 等[28]將MDDC 與23 個來自EBV、人巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）和流感病毒的免疫原性多肽共同孵育，后使用培養(yǎng)上清中提取的外體處理自體同源的CD8+T 細(xì)胞，結(jié)果表明該外體以抗原特異的方式激活了CD8+T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答。Walker 等[29]發(fā)現(xiàn)，CMV 感染的內(nèi)皮細(xì)胞可以通過外體將病毒抗原遞呈至抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC），激活CMV 特異的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，說明這種源自受感染細(xì)胞、具有免疫原性的外體在機體內(nèi)起到了免疫監(jiān)視的作用。在流感病毒的研究中同樣發(fā)現(xiàn)外體參與了病毒抗原的遞呈過程[30]。

綜上所述，外體在病毒和宿主相互作用的過程中扮演了重要的角色。一方面，病毒可主動借助外體作為載體，利用其分泌途徑，實現(xiàn)免疫逃避、感染的擴(kuò)散、宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖，以及建立持續(xù)性感染等；另一方面，宿主細(xì)胞也可利用外體來抵抗和限制病毒的感染。因此，理解病毒和宿主外體間的相互影響，不僅能使我們深入洞悉病毒感染致病的分子機制，同時將會為研發(fā)新的抗病毒干預(yù)措施和疫苗提供新的思路。

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