利用生物傳感技術(shù)監(jiān)測分析農(nóng)藥污染的研究

何靜林

（杭州市蕭山區(qū)環(huán)境監(jiān)測站，浙江 杭州，311200）

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，同時也是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國，農(nóng)藥在保障農(nóng)作物產(chǎn)量方面具有不可忽視的作用，但長期大量使用農(nóng)藥將造成微量或痕量的農(nóng)藥殘留在糧食、蔬菜中，極易對人類、動物、環(huán)境等產(chǎn)生急慢性毒害，嚴(yán)重威脅到人類的生存環(huán)境和身體健康，因此對農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速、及時、準(zhǔn)確、靈敏的實(shí)時監(jiān)控和檢測，成為迫切解決的農(nóng)藥污染問題。對于農(nóng)藥的定性和定量檢測主要有色譜法、質(zhì)譜法和光譜分析法等，但這些技術(shù)由于耗時長、費(fèi)用昂貴，并且只能由專業(yè)人員操作，體積較大，攜帶不太方便，不適合現(xiàn)場或野外使用。由于農(nóng)藥的大量使用，涉及面較廣，急需建立和發(fā)展一些便捷、快速檢測方法。生物傳感技術(shù)因選擇性高、靈敏度高、穩(wěn)定性好、成本低以及能在復(fù)雜體系中實(shí)現(xiàn)連續(xù)快速監(jiān)測而受到眾多研究者的關(guān)注。

1 生物傳感技術(shù)的原理及分類

生物傳感器是將生物識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件緊密結(jié)合，從而檢測目標(biāo)物的分析裝置，利用固定化的生物活性物質(zhì)，如酶、抗原、微生物、抗體、細(xì)胞、組織、核酸等作為傳感器的識別元件，與樣品中的待測物質(zhì)發(fā)生特異性反應(yīng)，通過適當(dāng)?shù)膿Q能器（如氧電極、光敏管、場效應(yīng)管、壓電晶體等）及信號放大裝置將這些反應(yīng)（形成復(fù)合物、發(fā)色、發(fā)光等）轉(zhuǎn)換成可以輸出檢測的信號（電壓、頻率等），通過分析信號對待測物進(jìn)行定性和定量檢測。

按照生物傳感器中分子識別元件即敏感元件可分為五類：酶生物傳感器，微生物傳感器，細(xì)胞傳感器，組織傳感器和免疫傳感器。顯而易見，所應(yīng)用的敏感材料依次為酶、微生物個體、細(xì)胞器、動植物組織、抗原和抗體。

按照生物傳感器的換能器即信號轉(zhuǎn)換器分類有：生物電極傳感器，半導(dǎo)體生物傳感器，光生物傳感器，熱生物傳感器，壓電晶體生物傳感器等，換能器依次為電化學(xué)電極、半導(dǎo)體、光電轉(zhuǎn)換器、熱敏電阻、壓電晶體等。

以被測目標(biāo)與分子識別元件的相互作用方式進(jìn)行分類有生物親和型生物傳感器、代謝型或催化型生物傳感器。三種分類方法之間實(shí)際互相交叉使用［1］。

2 生物傳感技術(shù)在農(nóng)藥污染監(jiān)測中的應(yīng)用

2.1 酶生物傳感器

酶生物傳感器是通過測定固定在電極表面的酶的活性被農(nóng)藥抑制的程度，來推算分析樣品中的農(nóng)藥殘留量。酶生物傳感器自發(fā)現(xiàn)以來，因選擇性高、結(jié)構(gòu)簡單、自動、價廉而受到廣泛應(yīng)用。特別是微電子技術(shù)、納米材料制備技術(shù)、生物技術(shù)的發(fā)展為擴(kuò)展生物傳感器的應(yīng)用范圍、批量生產(chǎn)、集成化、微型化打下了堅實(shí)的基礎(chǔ)，極大地促進(jìn)了酶生物傳感器的研究與應(yīng)用。酶生物傳感器的最關(guān)鍵的部分就是酶的固定化。Albareda－Sirvent等［2］用戊二醛交聯(lián)法將乙酰膽堿酯酶固定在銅絲碳糊電極表面，所構(gòu)成的傳感器可檢測10mol／L的對氧磷和10－11 mol／L的克百威，檢測加標(biāo)的自來水和果汁，回收率接近100%，可用于直接測定這兩類樣品中兩種農(nóng)藥的殘留。丁家旺等［3］基于酶的生物傳感器已經(jīng)廣泛用于農(nóng)藥的檢測，尤其是以乙酰膽堿酯酶（AChE）的催化活性為基礎(chǔ)的抑制型酶電極已大量應(yīng)用于氨基甲酸酯和有機(jī)磷類農(nóng)藥的檢測?；陔姵练e構(gòu)建了三種生物界面，殼聚糖，金納米－殼聚糖復(fù)合膜，金納米－自組裝膜。在這些生物兼容膜上固定乙酰膽堿酯酶，用于農(nóng)藥的檢測，檢出限可達(dá)ng／mL級。另一方面，利用乙酰膽堿酯酶催化底物氯化乙酰硫代膽堿，產(chǎn)生的硫代膽堿的特性進(jìn)行農(nóng)藥檢測。李宏坤等［4］利用納米粒子的特殊性質(zhì)，建立了AChE納米生物傳感器法檢測蔬菜中的OPs，方法快速、簡便、靈敏，該傳感器對久效磷進(jìn)行檢測的線性響應(yīng)范圍為0.5～12.0μg／mL，檢出限為0.02μg／mL。傳感器具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，為OPs的檢測提供了一種簡便易行的方法。高慧麗等［5］采用溶膠－凝膠法將乙酰膽堿酯酶固定在醋酸纖維膜上，再將酶膜固定在聚四氨基鈷酞菁（p－CoTAPc）修飾的玻碳電極（GCE）上，制備了可應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥測定的生物傳感器，采用計時安培法對有機(jī)磷農(nóng)藥（對硫磷、辛硫磷、氧化樂果）進(jìn)行檢測。閔紅等［6］研究了Au－Fe3O4納米粒子酶傳感器的制備及其在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測方面的應(yīng)用合成了金摻雜的四氧化三鐵納米粒子（Au－Fe3O4），以殼聚糖為交聯(lián)劑，制備了電流型乙酰膽堿酯酶（AChE）生物傳感器，并將其應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥（OPs）的檢測。實(shí)驗表明，Au－Fe3O4納米粒子具有良好的生物兼容性，能夠有效地促進(jìn)電極表面電化學(xué)反應(yīng)的電子傳遞，Au－Fe3O4納米粒子修飾的酶傳感器，具有響應(yīng)速度快、檢測靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)；固定在傳感器上的乙酰膽堿酯酶有良好的酶動力學(xué)響應(yīng)。劉萍等［7］首次以甲基纖維素為載體，制備了一種基于抑制乙酰膽堿酯酶的電位型生物傳感器。以甲胺磷、甲拌磷、對硫磷、毒死蜱和樂果等5種有機(jī)磷農(nóng)藥為檢測對象，獲得了上述5種有機(jī)磷農(nóng)藥的抑制時間，其結(jié)果分別為5、9、7、3和7min。楊麗娟等［8］自行設(shè)計加工一次性絲網(wǎng)印刷電極，并通過超聲清洗、電化學(xué)氧化等處理，使普通油墨批量生產(chǎn)的電極取得了良好電化學(xué)響應(yīng)特性，為后續(xù)試驗提供基礎(chǔ)；同時以玻碳電極為信號轉(zhuǎn)換器，將乙酰膽堿酯酶通過多壁碳納米管－戊二醛交聯(lián)固定在電極表面，構(gòu)建了用于農(nóng)藥殘留檢測的電流型生物傳感器。

從這些研究同時可以看出目前大部分工作限于以膽堿酯酶作生物活性材料，許多有機(jī)磷農(nóng)藥對酶有同樣的抑制作用，僅只能測出一類農(nóng)藥的總量。劉濤［9］等以石墨烯－納米鉑復(fù)合物修飾玻碳電極，并在納米鉑表面自組裝一層巰基乙胺，通過靜電作用固定酪氨酸酶，制備了一種新型酪氨酸酶生物傳感器，基于酶抑制原理，采用計時電流技術(shù)對毒死蜱、丙溴磷和馬拉硫磷等有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行了電化學(xué)檢測。

酶生物傳感器主要存在酶活性不穩(wěn)定和酶失活的問題，由于農(nóng)藥（有機(jī)磷）對酶的抑制是不可逆的，酶電極難以重復(fù)使用，且成本高。對于酶的抑制和可再生機(jī)制的研究一直是生物化學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的一個重要方面，特別是在固定化酶的應(yīng)用上，酶的可再生機(jī)制顯得尤為重要。

2.2 免疫傳感器

免疫傳感器是利用抗體和抗原之間的免疫化學(xué)反應(yīng)來制作的生物傳感器，免疫傳感器分為競爭法和夾心法兩類，按照所使用的信號轉(zhuǎn)換器，有電化學(xué)免疫傳感器、光學(xué)免疫傳感器、壓電免疫傳感器及表面等離子體共振（SPR）型傳感器，能夠高靈敏度、高選擇性、方便、快速地檢測待測樣品中的農(nóng)藥殘留量。Anis等研制開發(fā)的光纖免疫生物傳感器用于測定樣品中的對硫磷與色譜法相比，該法簡便快速，分析周期縮短4／5［10］。蔣雪松等［11］探索了電化學(xué)阻抗譜用于農(nóng)藥殘留檢測的可行性，在電極修飾、抗體固定及對農(nóng)藥抗原的識別過程中，電化學(xué)阻抗譜能很好地與等效電路模型相吻合。研究了壓電免疫傳感器結(jié)合流動注射系統(tǒng)用于對硫磷農(nóng)藥殘留的檢測。結(jié)果顯示，農(nóng)藥濃度在0.1－50μg／mL范圍內(nèi)，直接法壓電免疫傳感器的頻率變化與濃度之間成良好的相關(guān)關(guān)系。建立了一種基于毛細(xì)管的光學(xué)免疫傳感器，將抗原－抗體反應(yīng)與生物素親和素體系相結(jié)合用于三唑磷農(nóng)藥的檢測。將間接免疫競爭法用于光學(xué)免疫傳感器中，辣根過氧化物酶（HRP）酶標(biāo)物催化四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物，在655nm下測得產(chǎn)物吸光度，待測農(nóng)藥的濃度與吸光度成反比。Zhao等用多克隆抗體PCB抗體（Abs）制作敏感膜光纖免疫傳感器對其測定，下限為10mg／L，時間僅幾十秒到幾分鐘。黃君冉等［12］研究了基于自組裝膜的直接型壓電免疫傳感器用于三唑磷農(nóng)藥殘留的檢測，采用1－乙基－3－（3－二甲基氨丙基）－碳化二亞胺（EDC）和N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）對2－巰基苯甲酸（MBA）單分子層修飾的石英晶體電極表面進(jìn)行活化，將三唑磷單克隆抗體共價結(jié)合到電極表面，建立了一種用于快速檢測三唑磷農(nóng)藥的壓電免疫生物傳感器。杜淑媛等［13］運(yùn)用自組裝、溶膠－凝膠、電沉積、共價鍵合等技術(shù)構(gòu)建了檢測克百威農(nóng)藥殘留的電化學(xué)免疫傳感器，并引入納米金、多壁碳、殼聚糖、蛋白A等新型納米材料和電介質(zhì)材料以提高免疫傳感器的檢測性能。

2.3 微生物傳感器

酶對底物有高度專一性，但價格昂貴、穩(wěn)定性差，因而許多生物傳感器中用全活細(xì)胞，如細(xì)菌、酵母和真菌等，用其制成的傳感器稱為微生物傳感器，一類是利用微生物在同化底物時消耗氧的呼吸作用；另一類是利用不同微生物含有不同的酶，把它作為酶源。例如：細(xì)胞表面表達(dá)OPH的E.coli或?qū)ο趸樱≒NP）降解微生物傳感器以及基于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的微生物傳感器。細(xì)胞表面表達(dá)OPH的E.coli細(xì)胞與電勢傳感器（PH電極）相結(jié)合組成的微生物傳感器，利用低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋E.coli，然后將其固定于處理過的尼龍膜上制成生物傳感器，能快速檢測低至2μmol／L的對氧磷、甲基對硫磷和二嗪農(nóng)，相對胞內(nèi)表達(dá)OPH的電勢測定的微生物傳感器，這類傳感器提高了穩(wěn)定性［14］。

Mulchan－dani等［15］將攜帶有機(jī)磷水解酶（OPH）基因片斷的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入一種摩拉氏菌的菌體內(nèi)，篩選得到可在胞外表達(dá)OPH的改良菌，將適量的菌體與3：1的石墨粉和礦物油混合在一起制成工作電極的敏感元件。此傳感器對甲基對硫磷和對氧磷的檢測限可低達(dá)l×10－6mol／L和2×10－7mol／L。嚴(yán)珍等［16］在蔬菜殘留農(nóng)藥傳感器研制中，通過優(yōu)化傳感膜配方確定了以瓊脂－牛奶作為主要原料的制備傳感膜的工藝流程，成功地將發(fā)光菌包埋在濾紙膜中。在探頭研制過程中，取消了光纖的使用，以微型光電倍增管直接連接在發(fā)光腔體上，提高了靈敏度，又實(shí)現(xiàn)了整體儀器的微型化的目的。所制備的兩種發(fā)光菌配套儀器，都可成功的應(yīng)用于實(shí)際監(jiān)測。

2.4 仿生生物傳感器

仿生生物傳感器就是研究能代替生物視覺、嗅覺、味覺、聽覺和觸覺等感覺器官的生物傳感器，也稱為以生物系統(tǒng)為模型的生物傳感器。近年來，仿生生物傳感器利用分子印跡聚合物（MIP）和雙層脂膜（BLM）進(jìn)行制作，后者是結(jié)構(gòu)與生物膜相似的人工膜，具有良好的生物相容性，是構(gòu)建生物傳感器的理想敏感膜。Nikolelis等的研究顯示，BLM傳感器在分別接觸久效磷3min、克百威5min后出現(xiàn)電流信號，信號強(qiáng)度隨農(nóng)藥濃度的增加而增大，檢測限分別為45nmol／L 和480nmol／L。MIP和BLM生物傳感器是新型生物傳感器的發(fā)展方向，目前這方面的研究還處于起步階段，還有待進(jìn)一步研究［17］。

3 結(jié)語及展望

農(nóng)藥的大量使用造成糧食、蔬菜等農(nóng)藥殘留量超標(biāo)，嚴(yán)重影響到人類的身體健康，傳統(tǒng)的質(zhì)譜色譜等儀器分析法，費(fèi)用昂貴、耗時長、不易操作及難以攜帶等問題難以滿足農(nóng)藥實(shí)時快速監(jiān)測的需要。相比之下，生物傳感器具有檢測樣品不需要預(yù)處理、固定化的敏感物質(zhì)可重復(fù)使用、分析操作簡單、響應(yīng)快、成本低以及可自動化測量等特點(diǎn)，能夠解決農(nóng)藥檢測技術(shù)面臨的難題，但仍存在著穩(wěn)定性、選擇性、精確度和壽命等問題，酶的篩選、酶的固定化以及酶的可再生機(jī)制研究是一個難點(diǎn)，為縮短響應(yīng)時間和延長壽命將基膜做得盡可能薄是另一個難點(diǎn)。依托細(xì)胞化學(xué)、發(fā)酵化學(xué)、免疫化學(xué)和多肽排列結(jié)構(gòu)等多方面學(xué)科知識，與現(xiàn)代生物技術(shù)（包括生物酶抑制技術(shù)、ELISA、HPLC、PCR、芯片技術(shù)等）相聯(lián)合，向便攜式、小型化、低成本、高靈敏度和高選擇性的生物傳感器發(fā)展是未來的趨勢。

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［7］劉萍.有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測技術(shù)及其應(yīng)用研究［D］.重慶：西南大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006（08）.

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［12］黃君冉.用于農(nóng)藥殘留檢測的壓電免疫生物傳感器的研究［D］.浙江：浙江大學(xué)博士學(xué)位論文，2010（10）.

［13］杜淑媛.克百威農(nóng)藥殘留檢測用無標(biāo)記電流型免疫傳感器的制備方法研究［D］.山東：山東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文，2012（10）.

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［16］嚴(yán)珍.發(fā)光菌生物傳感器在海洋水質(zhì)監(jiān)測及蔬菜殘留農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用［D］.福建：廈門大學(xué)碩士學(xué)位論文，2002（02）.

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