SNP的檢測方法及其在農(nóng)作物遺傳育種中的應(yīng)用

麻艷超，郭振清，周麗艷，陳 普，陸 鳴，東方陽*，王建設(shè)

(1 河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院，河北 秦皇島，066004；2 國家蔬菜工程技術(shù)研究中心)

Single Nucleotide Polymorphism(SNP，單核苷酸多態(tài)性)是指由于單個(gè)核苷酸的變異而引起基因組水平上的DNA序列多態(tài)性。在大部分有機(jī)體基因組中，SNP是存在最普遍和穩(wěn)定的遺傳多樣性類型[1]。人類的基因組中，任何2個(gè)同源染色體間，估計(jì)每1 000個(gè)堿基對中存在1個(gè)SNP多態(tài)位點(diǎn)[2]；在玉米基因3’非編碼區(qū)，平均每48個(gè)堿基對中存在1個(gè)SNP多態(tài)位點(diǎn)，而在3’編碼區(qū)平均每130個(gè)堿基對中存在1個(gè)SNP多態(tài)位點(diǎn)[3,4]。在同一物種的不同品種中，同樣存在大量SNP，如擬南芥Columbia和Landsberg兩種生態(tài)型中，每3 300 bp中存在1個(gè)SNP；線蟲CB4586和N2基因組中，每1 000 bp中就有1個(gè)SNP位點(diǎn)[5～7]。因此，相較于傳統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù)，如RFLP(Restriction fragment length polymorphism, 限制性長度多態(tài)性)，AFLP(Amplified restriction fragment polymorphism, 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)和SSR(Simple sequence repeat, 簡單重復(fù)序列)等，SNP自1996年作為新的術(shù)語出現(xiàn)后，很快發(fā)展成為第3代分子標(biāo)記技術(shù)[8～11]。

目前，有關(guān)SNP檢測方法研究比較多，本研究側(cè)重綜述常用的單堿基多態(tài)性檢測技術(shù)及其在農(nóng)作物遺傳育種中的應(yīng)用。

1 SNP的分類

SNP是指在基因組水平上由于單個(gè)核苷酸發(fā)生插入、缺失、轉(zhuǎn)換和顛換變異所引起的DNA序列的多樣性[12]，其多態(tài)性頻率大于1%，但在實(shí)際研究中，也常把位于cDNA、頻率低于1%的單核苷酸變異稱為SNP[13]。

在生物體基因組內(nèi)，基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)均分布著大量的SNP，因此，將SNP分為2種類型：一種是基因編碼區(qū)內(nèi)(coding region)的SNP[14]，稱為cSNP；另一種是基因組非編碼區(qū)的SNP。cSNP又分為2類，一類是同義cSNP(Synonymous cSNP)，其引起的基因編碼序列的改變不會影響蛋白質(zhì)氨基酸序列的改變，突變堿基產(chǎn)生同義突變；另一類是非同義cSNP (nonsynonymous cSNP )，其引起的基因編碼序列的改變會導(dǎo)致蛋白質(zhì)氨基酸序列的改變，通常會引起表達(dá)蛋白的多態(tài)性變異，從而影響蛋白功能[15，16]。位于非編碼區(qū)的SNP又分為基因周邊SNP(peripheral SNP,pSNP)和基因間SNP(intronic SNP, iSNP)。

2 SNP常用檢測方法

2.1 直接測序法

直接測序法是最直接、最容易實(shí)施的檢測SNP的方法[17，18]。首先，PCR擴(kuò)增出目的產(chǎn)物，通過測序獲得目的基因片段序列，再利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列比對，就可直接檢測出是否存在SNP，其檢出率達(dá)到100%。同時(shí)還可以獲得SNP類型和突變基因座位點(diǎn)。隨著DNA測序自動(dòng)化和成本的降低，直接測序法在SNP檢測和分型中的使用越來越廣泛。

2.2 基于限制性酶切位點(diǎn)檢測方法

2.2.1酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列 酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列簡稱CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence analysis)，又稱為PCR-RFLP，是廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù)。該方法在RFLP[19]基礎(chǔ)上，利用PCR擴(kuò)增目的區(qū)間產(chǎn)物。若擴(kuò)增區(qū)間存在因單堿基差異而造成酶切位點(diǎn)有無的差異，用相應(yīng)的酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，再用電泳檢測，根據(jù)電泳分離結(jié)果，即可檢測SNP位點(diǎn)的差異[20]。但是，該方法無法檢測不涉及到酶切位點(diǎn)改變的SNP。

2.2.2衍生的酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列 dCAPS 衍生的酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列簡稱dCAPS(Derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis)。是以CAPS為基礎(chǔ)，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，通過在引物中引入1個(gè)或少量錯(cuò)配堿基創(chuàng)造酶切位點(diǎn)，之后再進(jìn)行相應(yīng)酶切反應(yīng)，根據(jù)電泳產(chǎn)物分離結(jié)果，檢測SNP的有無[21]。由于這2種方法對實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求不高，且操作簡單，在遺傳學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。

2.3 基于PCR的檢測方法

2.3.1擴(kuò)增阻遏突變系統(tǒng) 擴(kuò)增阻遏突變系統(tǒng)簡稱ARMS(Amplification Refractory Mutation System)，又稱為等位基因特異性PCR[22，23](Allele-Specific PCR，AS-PCR)，其原理是，根據(jù)等位基因分別設(shè)計(jì)2個(gè)上游引物，將等位基因的特異堿基位于引物3′-末端，分別與同一個(gè)下游引物構(gòu)成PCR體系。由于TaqDNA聚合酶缺乏3′-5′外切校正活性，只有當(dāng)引物3′末端與模板嚴(yán)格互補(bǔ)的上游引物才能得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，反之，則無PCR產(chǎn)物。因此根據(jù)電泳檢測產(chǎn)物的有無，即可鑒定單堿基的多態(tài)性。這種方法適用于已知多態(tài)位點(diǎn)等位基因的檢測。

在AS-PCR基礎(chǔ)上，科研工作者又對此方法進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)，Cha等在設(shè)計(jì)等位基因特異性引物時(shí)，有靠近SNP位點(diǎn)的3個(gè)堿基中增加了1個(gè)錯(cuò)配堿基[24，25]；Drenkard等[26]通過優(yōu)化2次PCR的循環(huán)數(shù)提高檢測結(jié)果，并開發(fā)SNAPER程序軟件為每個(gè)SNP等位位點(diǎn)設(shè)計(jì)16種類型特異性引物，這種改進(jìn)顯著提高了SNP等位位點(diǎn)的檢測效率。

2.3.2單堿基引物延伸法(Single nucleotide primer extension) 單堿基延伸技術(shù)又稱為微測序(Minisequencing)[27]或模板介導(dǎo)染料終止劑摻入( Template-directed dye-terminator incorporation，TDI)分析[28]，其原理是在位于待測SNP位點(diǎn)上游的1個(gè)堿基處設(shè)計(jì)1條引物，加入不同熒光標(biāo)記的ddNTPs進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)加入的ddNTP與SNP等位基因互補(bǔ)時(shí)，延伸才可以繼續(xù)，之后可以通過檢測延伸堿基發(fā)出的熒光判斷SNP的類型。

2.4 單鏈構(gòu)象多態(tài)性 SSCP

單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)簡稱SSCP(Single strand conformation polymorphism)[29]，是基于DNA構(gòu)象差別檢測突變的方法，由于長度相同的單鏈DNA片段，若堿基序列不同，在堿基相互間作用力下形成不同的構(gòu)象，利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳即可檢測。該方法靈敏、快捷，但對電泳條件要求較高[30]。

2.5 高分辨溶解曲線分析

高分辨溶解曲線分析簡稱HRM(High Resolution Melting),是根據(jù)PCR產(chǎn)物的熔解曲線分析核苷酸差異的[31]。其原理在PCR中加入熒光染料，飽和熒光染料(如LC Green)與PCR產(chǎn)物結(jié)合，在DNA解鏈過程中，熒光染料會釋放信號，根據(jù)信號繪制熔解曲線，若序列中一個(gè)堿基發(fā)生突變，熔解曲線發(fā)生變化，即可檢測出SNP多態(tài)性[32,33]。該方法應(yīng)用較廣，對控溫的均一性要求較高。

2.6 基因芯片技術(shù)(gene chips)

基因芯片(gene chips)又稱DNA芯片(DNA chips), 或生物芯片(biological chips)，其原理是用制備帶熒光標(biāo)記的待測樣品與固定在芯片上的陣列探針雜交，或者用制備無熒光標(biāo)記的待測樣品與固定在芯片上的微陣列探針雜交，之后進(jìn)行染色，根據(jù)雜交信號強(qiáng)弱的差異進(jìn)行檢測[34]。為加快雜交反應(yīng)速度，美國Nanogene公司研制了Nanochip電子微陣列[35, 36]，通過在雜交位點(diǎn)引入電場而使雜交和沖洗過程的速度大大增加?；蛐酒抢煤怂犭s交原理建立的一種高度集成化、微型化和自動(dòng)化的檢測技術(shù)，已在基因多態(tài)性分析方面廣泛應(yīng)用。

3 SNP在作物遺傳育種中的應(yīng)用

3.1 農(nóng)藝性狀基因關(guān)聯(lián)分析

基因組多數(shù)SNP的變異與植物基因功能密切相關(guān)，通過關(guān)聯(lián)分析可以挖掘出功能型位點(diǎn)變異，并對作物遺傳育種有重要的指導(dǎo)意義[37, 38]。吳德志[39]通過對188株西藏野生大麥材料的關(guān)聯(lián)分析表明，與bPb-489標(biāo)記緊密連鎖的HvCBF4基因可能與大麥的耐鹽性相關(guān)。Konishi等[40]發(fā)現(xiàn)水稻的qSH1基因5′調(diào)節(jié)區(qū)1個(gè)SNP的變異落粒性相關(guān)。王仲平[41]首次利用改進(jìn)了的Ecotilling酶切檢測技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的水稻光周期敏感的重要基因Hd6等位基因。玉米基因組中含有豐富的SNP，通過SNP與耐旱性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，可以找到與玉米耐旱相關(guān)的代謝和農(nóng)藝性狀候選基因及其變異位點(diǎn)，蘇志平[42]通過關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下，dbf1基因中的多態(tài)性位點(diǎn)366與ASI和單穗粒質(zhì)量顯著關(guān)聯(lián)，位點(diǎn)452與單穗粒質(zhì)量和結(jié)實(shí)株數(shù)百分率存在顯著關(guān)聯(lián)。劉昌林[43]利用來源于美國雜交種P78599的5份高抗粗縮病自交系(R18，P138，X178，金黃59和齊318)和全基因組41 101個(gè)SNP，篩選到9個(gè)包含與抗病性顯著相關(guān)的SNP衍生片段。

3.2 遺傳圖譜的構(gòu)建

SNP具有多態(tài)性豐富、在作物基因組中分布密度大等優(yōu)點(diǎn)，在重要作物遺傳圖譜構(gòu)建上已顯示出其特有的優(yōu)勢和廣泛應(yīng)用前景。Bhattramkki 等以高分辨率的B73×Mo17為作圖群體材料，繪制了玉米EST遺傳圖譜，整個(gè)基因組中分布了超高密度的SNPs，促進(jìn)了基于連鎖不平衡的關(guān)聯(lián)圖譜的構(gòu)建[44]。韓志國等[45]根據(jù)SNP將FIF1基因定位于四倍體棉花遺傳圖譜上。李博等[46]利用41 101個(gè)SNP標(biāo)記對159份我國玉米自交系進(jìn)行全基因組分析，檢測到7個(gè)與穗位高顯著相關(guān)SNP，并將收集的137個(gè)穗位高QTL整合至IBM2 2008 Neighbors玉米遺傳圖譜上。Wim等[47]篩選出甜瓜EST-SNP標(biāo)記，建立了葫蘆科作物中第1個(gè)包含SNP標(biāo)記的遺傳圖譜。

3.3 基因克隆及定位

由于SNP分布廣的特點(diǎn)，在與農(nóng)作物基因克隆中，以SNP為基礎(chǔ)的AS-PCR，CAPS，dCAPS等分子標(biāo)記已成為一種非常重要的研究手段。潘存紅等[48]通過BLAST比對秈稻品種93-11與粳稻日本晴，利用SNP多態(tài)性位點(diǎn)克隆出水稻卷葉基因。衛(wèi)波等[49]完成了小麥抗旱相關(guān)基因的SNP標(biāo)記和定位。韓志國等[45]克隆了陸地棉TM-1和海島棉7124中的FIF1基因。Yang等[50]利用3個(gè)番茄品種，將46個(gè)SNP定位在染色體的特定區(qū)域，并證明2個(gè)SNP與果實(shí)顏色基因座緊密連鎖。李博等[46]結(jié)合分析的7個(gè)與穗位高顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)信息，獲得了2個(gè)候選基因。

3.4 種質(zhì)鑒定及親緣關(guān)系分析

SNP在分子育種品質(zhì)鑒定和資源分類中有非常重要的利用價(jià)值。Brunner等[51]利用SNP開發(fā)了基于PCR的大麥家系葉銹病抗病性狀標(biāo)記，用于鑒定優(yōu)良種質(zhì)。趙婷婷[52]利用SNP分子標(biāo)記技術(shù)篩選抗病基因Cf-9的單堿基突變位點(diǎn)，獲得含有番茄抗葉霉病基因Cf-9的番茄材料，為培育新抗病品種提供物質(zhì)基礎(chǔ)。宋偉等[53]根據(jù)多態(tài)性水平、染色體位置等信息從公共數(shù)據(jù)庫上篩選了48個(gè)玉米核心SNP位點(diǎn)，并通過基因分型分析，找到了42個(gè)可以用來區(qū)分105份自交系材料的SNP位點(diǎn)。蘭青闊建立了基于CLA6位點(diǎn)的黃瓜雜交種純度鑒定方法，并用該方法檢測出黃瓜雜交種優(yōu)一種子的純度[54]。

SNP標(biāo)記還可用于種間親緣關(guān)系分析，Germano等[55]利用直接測序法對云杉種間SNP進(jìn)行分析，鑒定出3個(gè)近緣種間的多態(tài)性。孫清明等[56]利用自主開發(fā)的SNP和EST-SSR等2種分子標(biāo)記技術(shù)，鑒定出御金球?yàn)?份全新荔枝種質(zhì)，并且首次完成了對荔枝新種質(zhì)御金球的親本來源鑒定。Kota等[57]分析了大麥7個(gè)基因型180個(gè)EST位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了72個(gè)可應(yīng)用于親緣關(guān)系中研究的SNP。

4 結(jié) 論

基因組SNP具有數(shù)量多、分布廣的特點(diǎn)，使之成為第3代分子標(biāo)記技術(shù)。在農(nóng)作物及其他物種研究中，具有強(qiáng)大的開發(fā)與利用潛能。目前，SNP已在作物農(nóng)藝性狀基因關(guān)聯(lián)分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、作物基因克隆與定位、種質(zhì)資源鑒定以及親緣關(guān)系分析中發(fā)揮著重要的作用。今后對于SNP進(jìn)一步的開發(fā)研究，必將在生命科學(xué)領(lǐng)域和農(nóng)作物遺傳育種中發(fā)揮更大的作用。

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