淺談蛋白質(zhì)含量的定量檢測(cè)方法

周躍男，王湛，趙小川，張西明，高悝，程立娜，劉利萍

（1.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，北京100124；2.天津市武清區(qū)新聞中心，天津301700）

蛋白質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞不可缺少的成分，它是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)代謝、酶等密切相關(guān)，它的定量測(cè)定是食品和質(zhì)量檢驗(yàn)、醫(yī)藥分離提純中最重要的工作之一[1]。蛋白質(zhì)的測(cè)定方法也在不斷的發(fā)展中，有凱氏定氮法、紫外吸收法、雙縮脲比色法、Folin-酚法、考馬斯亮藍(lán)法、BCA法、磺基水楊酸沉淀法、滴定法及電泳法等方法，本文就常見的這幾種方法進(jìn)行討論。

1 凱氏定氮法

1.1 原理[2-3]

凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的過程主要分為以下四步：

1）消化。在催化劑和濃H2SO4的作用下，蛋白質(zhì)加熱消化分解為氨態(tài)氮，氨態(tài)氮再與濃H2SO4結(jié)合生成（NH4）2SO4。

2）蒸餾。消化完全后，加入強(qiáng)堿進(jìn)行蒸餾，使銨離子轉(zhuǎn)化為NH3釋放出來。

3）吸收。用標(biāo)準(zhǔn)的H2BO3溶液吸收NH3。

4）滴定。用標(biāo)準(zhǔn)的鹽酸滴定，并用甲基紅為指示劑。測(cè)出銨離子的量，最后換算出粗蛋白質(zhì)的含量。

1.2 特點(diǎn)

凱氏定氮法是目前世界上測(cè)定蛋白質(zhì)樣品中總有機(jī)氮的最準(zhǔn)確和最簡(jiǎn)單的方法之一，廣泛應(yīng)用于各類蛋白質(zhì)的測(cè)定，可分為常量和微量凱氏定氮法兩種。但存在靈敏度低、操作復(fù)雜、耗時(shí)過長(zhǎng)、試劑消耗量過大等缺點(diǎn)[4]。

1.3 案例

以下兩種方法主要是在消化方式和儀器上進(jìn)行改進(jìn)，效果較為滿意。

劉玉蘭等[5]對(duì)凱氏定氮法的消化方式進(jìn)行了改進(jìn)，用H2O2和濃H2SO4的混合液對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行消化，消化完全后再以甲醛法來測(cè)定粗蛋白質(zhì)的含量。該方法的改進(jìn)效果是：消化時(shí)間較經(jīng)典凱氏定氮法縮短了11/12，同時(shí)測(cè)定結(jié)果與經(jīng)典凱氏定氮法的測(cè)定結(jié)果基本一致。說明該方法極大的改善了經(jīng)典凱氏定氮法的缺點(diǎn)，可用于食品中蛋白質(zhì)的大批量的測(cè)定。

蔣江虹等[6]用2300型全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定食品中蛋白質(zhì)，測(cè)定原理與經(jīng)典凱氏定氮法相同。該方法的改進(jìn)效果是：該方法因采用機(jī)電一體化控制而減少了經(jīng)典凱氏定氮法過程中人為操作的誤差，具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。

2 分光光度法

分光光度法分為紫外吸收法、Folin-酚法（Lowry法）、雙縮脲比色法（NH2-CO-NH-CO-NH2法）、考馬斯亮藍(lán)法、BCA法（二喹啉甲酸法）等。

2.1 紫外吸收法

2.1.1 原理

因蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸等殘基中含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的特性，最大吸收峰在280 nm處。因蛋白質(zhì)在最大吸收峰處的吸光度與其濃度成正比，可根據(jù)蛋白質(zhì)溶液的吸光度，定量測(cè)定測(cè)得樣品中蛋白質(zhì)的含量。

2.1.2 特點(diǎn)

紫外吸收法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，且測(cè)定結(jié)果不受低濃度的鹽類的干擾[7]。但缺點(diǎn)是：實(shí)際應(yīng)用中的蛋白質(zhì)，其酪氨酸和色氨酸的含量會(huì)和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中的差異較大，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果存在一定的誤差。因而，適應(yīng)范圍存在局限，僅適用于與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量差異較小的蛋白質(zhì)的測(cè)定。

2.2 雙縮脲比色法（NH2-CO-NH-CO-NH2法）

2.2.1 原理

因蛋白質(zhì)含有兩個(gè)或者兩個(gè)以上肽鍵，它會(huì)在堿性條件下與CuSO4溶液發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，反應(yīng)過程中肽鍵中的氮原子和Cu2+結(jié)合形成紫紅色的絡(luò)合產(chǎn)物[8]。在一定范圍內(nèi)，絡(luò)合產(chǎn)物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的含量符合朗伯—比爾定律。

2.2.2 特點(diǎn)

雙縮脲比色法是2008年公布的中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定乳與乳制品中蛋白質(zhì)的方法[9]。作為傳統(tǒng)的分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的方法之一，雙縮脲法操作簡(jiǎn)便、迅速，但缺點(diǎn)是準(zhǔn)確度和靈敏度較低，測(cè)定范圍也為僅為1 mg～20 mg蛋白質(zhì)[7]。同時(shí)，該測(cè)定方法受C4H11NO3、EDTA和一些氨基酸等干擾[10]。

2.3 Folin-酚法（Lowry法）

2.3.1 原理

Folin-酚法與雙縮脲比色法的原理很類似。蛋白質(zhì)中的肽鍵和Cu2+發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成蛋白質(zhì)—銅絡(luò)合物。同時(shí)，酚試劑被蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物上的芳香族氨基酸殘基還原，生成深藍(lán)色的化合物。在一定的條件下，化合物顏色的深淺取決于蛋白質(zhì)的濃度。因而，可根據(jù)蛋白質(zhì)溶液的吸光度，定量測(cè)定測(cè)得樣品中蛋白質(zhì)的含量。

2.3.2 特點(diǎn)

Folin-酚法廣泛應(yīng)用于測(cè)定水溶性蛋白質(zhì)的含量，較雙縮脲法更靈敏。適用于20 μg～250 μg微量蛋白質(zhì)的測(cè)定，最低可達(dá)5 μg[7]。但缺點(diǎn)是：Folin-酚試劑配制繁瑣耗，且會(huì)受到檸檬酸、甘氨酸、Tris緩沖液、甘油[7]、還原劑（二硫代蘇糖醇、巰基乙醇）[11]、EDTA 和脲素[12]物質(zhì)的干擾。

2.4 考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）

2.4.1 原理

考馬斯亮藍(lán)法是Bradford于1976年提出的快速、靈敏的定量測(cè)定微量蛋白質(zhì)的方法。

考馬斯亮藍(lán)G-250染料是一種有機(jī)染料，它在游離狀態(tài)下為紅色，最大吸收峰在465 nm處。但當(dāng)它與稀酸中的蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸和堿性氨基酸殘基通過范德華力結(jié)合后，會(huì)由紅色變成藍(lán)色，最大吸收峰變?yōu)?95 nm。在一定條件下，蛋白質(zhì)-G-250絡(luò)合物在595 nm處的吸光度與蛋白質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系，故可用于測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。

2.4.2 特點(diǎn)

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好、干擾物質(zhì)較少。但缺點(diǎn)是：該方法的線性關(guān)系會(huì)隨著在蛋白質(zhì)含量的增加而越來越偏差，同時(shí)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的芳香族氨基酸和堿性氨基酸殘基含量不同時(shí)，它與考馬斯亮藍(lán)G-250的結(jié)合狀況也會(huì)不同，因而在不同蛋白質(zhì)含量的測(cè)定中有偏差。同時(shí)，此外，該反應(yīng)會(huì)受強(qiáng)堿性緩沖液、十二烷基硫酸鈉（SDS）、去污劑、TritonX-100 等物質(zhì)的干擾[7]。

2.4.3 案例

以下方法主要是在標(biāo)準(zhǔn)曲線和顯色液組分方面進(jìn)行改進(jìn)，效果較為滿意。

郭敏亮[13]等通過研究發(fā)現(xiàn)，顯色液組分中的H+是影響線性關(guān)系的最主要的因素，摒棄傳統(tǒng)的H3PO4緩沖溶液，用一個(gè)全新的顯色液配方來改善了考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的線性關(guān)系。

余冰賓[7]在基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)一書中，提到采用γ-球蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可減少因蛋白質(zhì)來源的差異造成的測(cè)定偏差。

2.5 BCA法（二喹啉甲酸法）

2.5.1 原理

BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的過程主要分為以下兩步[14]：

1）還原。在堿性條件下，蛋白質(zhì)將Cu2+還原成Cu+。

2）絡(luò)合。Cu+與BAC試劑發(fā)生反應(yīng)，在最大吸收峰（562 nm）下處形成紫紅色的絡(luò)合物。一定條件下，絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，因而可用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

2.5.2 特點(diǎn)

相比Lowry法，BCA法更優(yōu)越。它是已知的最靈敏的總蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法之一，檢測(cè)下限到0.5μg[15]。具有快速、穩(wěn)定、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

2.6 磺基水楊酸沉淀法[16]

2.6.1 原理

以磺基水楊酸和無水硫酸鈉為試劑，采用磺基水楊酸沉淀法來測(cè)定生物制品中的蛋白質(zhì)的含量。

2.6.2 特點(diǎn)

磺基水楊酸沉淀法測(cè)定快速、簡(jiǎn)便、操作誤差小，雖然與凱氏定氮法與Folin-酚法相比準(zhǔn)確性偏低，但磺基水楊酸沉淀法有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）克服了凱氏定氮法對(duì)蛋白質(zhì)的濃度過低而致使測(cè)定誤差大的缺點(diǎn)；（2）彌補(bǔ)了Folin-酚法中由于蛋白質(zhì)樣品中硫柳汞等存在而干擾檢測(cè)結(jié)果的劣勢(shì)。因而，磺基水楊酸沉淀法不失為一種微量蛋白質(zhì)的行之有效的方法。

3 滴定法

3.1 原理

滴定法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的過程主要分為以下兩步：1）消化。該步與凱氏定氮法一致。

2）滴定。用甲醛滴定法或pH滴定法進(jìn)行滴定。

由于凱氏定氮法存在操作復(fù)雜、耗時(shí)過長(zhǎng)、試劑消耗量過大等缺點(diǎn)，一些研究人員在樣品消化后，省去傳統(tǒng)凱氏定氮法中蒸餾和吸收兩步，直接采用滴定法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

3.2 特點(diǎn)

該法省去凱氏定氮法中蒸餾和吸收兩步，克服了凱氏定氮法中的一些缺點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便、快速，不失為一種行之有效的方法。

3.3 案例

馮正滔[17]改善了傳統(tǒng)凱氏定氮法，用甲醛法代替蒸餾、吸收、滴定三步。改進(jìn)后的方法平均回收率和精密度都有了明顯提高，同時(shí)也克服了傳統(tǒng)凱氏定氮法的缺點(diǎn)，為一種可行的測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法。

張大倫等[18]以滴定極弱酸的原理為根據(jù)，同樣改善了傳統(tǒng)凱氏定氮法，用pH滴定法代替蒸餾、吸收、滴定三步，分別測(cè)定了大豆及花生蛋白質(zhì)的含量。結(jié)果表明，pH滴定法的測(cè)定不僅與傳統(tǒng)凱氏定氮法測(cè)定結(jié)果基本一致，而且經(jīng)濟(jì)效益明顯，應(yīng)用前景廣泛。

4 電泳法

4.1 原理

在電場(chǎng)作用下，惰性支持介質(zhì)中帶電荷的樣品（如蛋白質(zhì)）向著與其電荷相反的電極方向移動(dòng)，由于各組分移動(dòng)速度的差異，使其在電泳區(qū)帶圖譜上形成狹窄的區(qū)帶，根據(jù)譜圖可計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的百分含量。

4.2 特點(diǎn)

電泳法具有操作簡(jiǎn)便、快速、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。但缺點(diǎn)是：在檢測(cè)過程中會(huì)受脂類、核酸、多糖等的干擾分子。目前，測(cè)定蛋白質(zhì)含量的電泳法可分為毛細(xì)管電泳法、雙向凝膠電泳法、火箭免疫電泳法等。

4.3 案例

唐萍等[19]通過毛細(xì)管電泳法測(cè)定雀巢、美贊臣、雅培等知名品牌嬰幼兒奶粉中多種蛋白質(zhì)的含量。研究表明，該法準(zhǔn)測(cè)定快、精密度和準(zhǔn)確度高、綠色無污染，同時(shí)它對(duì)改善幼兒奶粉配方和監(jiān)控牛奶的質(zhì)量提供了一個(gè)較好的檢測(cè)方法。

5 結(jié)論

定量檢測(cè)蛋白質(zhì)含量的方法有很多，包括：凱氏定氮法、紫外吸收法、雙縮脲比色法、Folin-酚法、考馬斯亮藍(lán)法、BCA法、磺基水楊酸沉淀法、滴定法及電泳法等。每種檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，我們應(yīng)充分了解這些測(cè)定方法的原理和特點(diǎn)，并在科研檢測(cè)工作中根據(jù)具體的情況選用適宜的、常用的分析方法，這樣才能獲得更好的檢測(cè)結(jié)果。

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