高效酒精酵母菌的選育及鑒定

李忠英，陳杰山，羅躍中，吳永堯

（1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南株洲 412004；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

隨著全球石油能源的日趨枯竭及環(huán)境污染的加劇，開發(fā)新的綠色能源勢(shì)在必行。燃料酒精替代汽油能源將逐漸成為發(fā)展趨勢(shì)[1-2]。目前，采用燃料酒精生產(chǎn)多采用微生物發(fā)酵方式。生產(chǎn)酒精的菌種主要以酵母菌為主，酒精酵母的優(yōu)劣不僅直接影響發(fā)酵率的高低，而且會(huì)影響酒精的產(chǎn)量和品質(zhì)。在酒精發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)生的高濃度酒精和相對(duì)較高的發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酒率影響較大，高濃度酒精會(huì)限制酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，對(duì)酒精發(fā)酵產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用；而耐高溫酵母能減少生產(chǎn)中由于降溫所帶來(lái)的麻煩和費(fèi)用。因此，高產(chǎn)酒精酵母的選育和發(fā)酵工藝的改進(jìn)是實(shí)現(xiàn)酒精濃醪發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵[3]。我國(guó)也一直將選育優(yōu)良的酒精酵母菌種和酒精發(fā)酵新工藝研究列為重點(diǎn)研究課題。

本項(xiàng)研究從自然界中篩選分離出具有較強(qiáng)溫度和酒精耐受性的酵母菌TJ-18并對(duì)其進(jìn)行初步鑒定，旨在篩選培育適用于酒精工業(yè)發(fā)酵的新菌種。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌樣來(lái)源

各種腐敗水果、葡萄園里土壤、湘天橋菜市場(chǎng)甜酒醪、湘鄉(xiāng)燕京啤酒廠酒醪、學(xué)生食堂下污水及實(shí)驗(yàn)室教學(xué)用酵母菌等。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

1.1.2.1 富集培養(yǎng)基（L）

含10%酒精麥芽汁（8°Brix）、含14%的酒精麥芽汁（10°Brix）。

1.1.2.2 分離馴化培養(yǎng)基（L）

麥芽汁（8°Brix）及酵母蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）：配方：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉。

1.1.2.3 初篩培養(yǎng)基

TTC上層培養(yǎng)基為TTC0.05g，葡萄糖0.5g，水1L；TTC下層培養(yǎng)基為YPD瓊脂。

1.1.2.4 復(fù)篩培養(yǎng)基

加杜氏小管的YPD培養(yǎng)基。

1.1.2.5 酵母菌鑒定培養(yǎng)基

培養(yǎng)基配方及其配制，參考《The Yeast》[4]和《常見與常用真菌》[5]。

1.1.2.6 酵母菌保藏用培養(yǎng)基

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，分離出的菌種保存在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基試管斜面上，每隔兩個(gè)月轉(zhuǎn)接一次。

本研究中培養(yǎng)基除特別注明外均采用121℃蒸汽滅菌30 min。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

1.1.3.1 原麥芽汁

取自湘鄉(xiāng)市燕京（國(guó)人）啤酒有限公司（原麥芽汁13°Brix）。

1.1.3.2 酶制劑

a-淀粉酶：酶活力3 000 IU/g，糖化酶：酶活力17 400 IU/g。

1.1.3.3 其他化學(xué)試劑

放線酮、乙胺、尸胺、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、次甲基藍(lán)、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、乙酸鋅、氫氧化鈉、鹽酸、甲基紅、醋酸鉛、硫酸鈉、乙醚等均為分析純。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-2550紫外分光光度計(jì)：日本島津制作所；電子天平：梅特勒電子儀器有限公司；超凈工作臺(tái)：江蘇凈化設(shè)備廠；立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安；HPS-250生化培養(yǎng)箱：哈爾濱市東明；LDZX-50FAS恒溫水浴箱：上海瑞仰凈化裝備有限公司；QYC-21全溫空氣搖床：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；顯微鏡：江南光電等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

從各個(gè)基質(zhì)中采用隨機(jī)取樣原則收集樣品，裝入200 mL錐形瓶裝100 mL無(wú)菌水，加入玻璃珠以及所采集的樣品放置在調(diào)速多用振蕩器（HY4）振蕩1 h，打碎菌膠團(tuán)，釋放游離菌。

1.2.2 富集培養(yǎng)

在震蕩后的菌懸液中取5 mL樣品分別加入到已滅菌的含10%（體積分?jǐn)?shù)）酒精的培養(yǎng)基中，40℃培養(yǎng)24 h，再轉(zhuǎn)入酒精濃度為14%（體積分?jǐn)?shù)）的培養(yǎng)基中，40℃培養(yǎng)72 h，鏡檢。若有則取1 mL接入YPD固體平皿中，40℃培養(yǎng)2 d～3 d，待長(zhǎng)出菌落后，選擇具有典型酵母菌菌落特征的單菌落進(jìn)一步劃線分離2次～3次，經(jīng)鏡檢為純種后分別轉(zhuǎn)入YPD固體斜面，冰箱保存。

1.2.3 酵母菌的篩選

1.2.3.1 酵母菌一級(jí)篩

TTC法[6]：在一定培養(yǎng)基上培養(yǎng)的酵母菌落上覆蓋一層TTC顯色劑后會(huì)顯不同顏色，產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母菌落成深紅色，次之為粉紅色。將分離得到的各菌株依次接入TTC下層培養(yǎng)基的平皿中，培養(yǎng)24 h，長(zhǎng)出菌落然后倒入TTC上層培養(yǎng)基，40℃下保溫（陰暗處）2 h～3 h。比較各菌株之間的產(chǎn)酒精能力。初篩出性狀優(yōu)良的酵母菌株。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.2 酵母菌二級(jí)篩

酵母菌的二級(jí)篩：將酵母菌分別接入帶有杜氏小管的不同的YPD液體試管中，添加不同濃度酒精下40℃培養(yǎng)，分別在12、24 h和48 h觀察杜氏小管中產(chǎn)氣情況。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.3 酵母菌三級(jí)篩

麥芽汁發(fā)酵法：二級(jí)篩選出的菌株活化后接入麥芽汁培養(yǎng)基中增菌使活菌濃度達(dá)到107個(gè)/mL，然后取6 mL裝入300 mL帶濾芯的發(fā)酵瓶中，加入200 mL麥芽汁40℃下培養(yǎng)72 h，每日稱重，記錄每日失重情況，待發(fā)酵結(jié)束時(shí)計(jì)算總失重，并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析（可溶性固形物，酒精度，還原糖）。試驗(yàn)重復(fù)3次，復(fù)篩得到性狀最為優(yōu)良的菌株。

1.2.4 酵母菌的鑒定

酵母鑒定方法參考《The Yeast：a taxonomic study》（第三版），對(duì)其進(jìn)行形成及培養(yǎng)特征觀察，同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵糖類、同化碳源、同化氮源及無(wú)維生素生長(zhǎng)試驗(yàn)。

1.2.5 酒精度的測(cè)定

取100 mL成熟發(fā)酵醪，加入100 mL蒸餾水，蒸餾出100 mL液體，搖勻后用酒精計(jì)和溫度計(jì)分別測(cè)定其酒度和溫度，然后查表校正為20℃酒精濃度。

2 結(jié)果分析

2.1 初篩結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)將采集的樣品置于含10%乙醇培養(yǎng)基中，使在含酒精培養(yǎng)基的不生長(zhǎng)的菌株被淘汰掉，而能適應(yīng)的菌株被保留下來(lái)，富集及馴化培養(yǎng)的主要目的是使目標(biāo)菌株能夠適應(yīng)其生長(zhǎng)環(huán)境并旺盛生長(zhǎng)。從不同地區(qū)不同地點(diǎn)共采集樣品12份，從中共分離得到酵母菌144株，其中來(lái)自各種腐敗水果的酵母32株；來(lái)自葡萄園里土壤的酵母20株；來(lái)自菜市場(chǎng)甜酒糟的酵母34株；來(lái)自啤酒廠酒醪的酵母21株；來(lái)自學(xué)生食堂下污水的酵母12株；來(lái)自教學(xué)用酵母菌25株。分離酵母結(jié)果見表1。

表1 酵母菌的分離初篩結(jié)果Table 1 Segregation of yeast screening results

從表1可看出，菜市場(chǎng)甜酒糟和各種腐敗水果中酵母菌數(shù)量較多，分離到的能耐14%（體積分?jǐn)?shù)）酒精的菌株也多；葡萄園里土壤和污水由于菌項(xiàng)復(fù)雜，含有的微生物種類較多，但分離到的能耐14%（體積分?jǐn)?shù)）酒精的菌株較少。

2.2 酵母菌的篩選

2.2.1 酵母菌的一級(jí)篩

將144株酵母菌采用無(wú)菌操作制備成菌懸液，用接種針分別接種于YPD固體培養(yǎng)基中，每個(gè)平板接15株～20株，于恒溫培養(yǎng)箱中40℃培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，倒入配好的TTC溶液，覆蓋菌落，40℃再繼續(xù)培養(yǎng)，注意及時(shí)觀察菌落的顏色變化，比較各菌株間的顏色深淺。TTC（2，3，5-氯化苯基四氮哇）是一種顯色劑，它對(duì)酵母的代謝產(chǎn)物發(fā)生呈色反應(yīng)，通過它可以判斷酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母產(chǎn)酒精能力的高低[6]。顏色深的菌株呼吸酶活力強(qiáng)，有較強(qiáng)的產(chǎn)酒精能力，從每一平板中記下顏色較深的1株～2株菌，作為二級(jí)篩的出發(fā)菌株，共得到12株酵母菌。

2.2.2 酵母菌的二級(jí)篩

一級(jí)篩得到12株性狀較好的菌株，在培養(yǎng)基中添加不同含量的酒精，在40℃下進(jìn)行二級(jí)篩實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，其產(chǎn)氣結(jié)果見表2。

2.2.3 酵母菌的三級(jí)篩

由三級(jí)篩結(jié)果可看出TJ-18號(hào)酵母的酒精產(chǎn)率比較高，達(dá)到5.9%（體積分?jǐn)?shù)）；殘還原糖約為1.00%，糖利用率較高，且發(fā)酵力突出，72 h CO2失重為10.4 g。故后續(xù)研究將TJ-18菌為最終發(fā)酵用菌株。

2.3 酵母菌的初步鑒定

2.3.1 TJ-18菌株的形態(tài)和培養(yǎng)特征

TJ-18菌株在YPD液體培養(yǎng)基中（38℃）培養(yǎng)24 h細(xì)胞呈橢圓形或卵圓形，細(xì)胞大?。?.5～5.5）μm×（5.25～8.75）μm。繁殖方式為一端出芽。再生孢子培養(yǎng)基38℃培養(yǎng)9 d后有子囊孢子形成，每個(gè)子囊含1枚～2枚子囊孢子，無(wú)明顯顏色。在YPD瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落為乳白色、平滑、有光澤、邊緣整齊。在加蓋片的玉米淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)38℃培養(yǎng)8 d后形成假菌。

表2 二級(jí)篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Level two screening test results

表3 三級(jí)篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Level three screening test results

2.3.2 生理生化試驗(yàn)

2.3.2.1 發(fā)酵糖類試驗(yàn)

采用麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖及半乳糖做發(fā)酵糖試驗(yàn)，其結(jié)果見表4。

表4 TJ-18發(fā)酵糖類實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 TJ-18 fermentation of sugars in experimental results

2.3.2.2 同化碳源試驗(yàn)

TJ-18同化碳源實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 TJ-18同化碳源實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 TJ-18 carbon source assimilation experiments

2.3.2.3 同化氮源試驗(yàn)

TJ-18同化氮源實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

2.3.2.4 輔助生理生化試驗(yàn)

TJ-18輔助生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。

根據(jù)生理生化試驗(yàn)結(jié)果，并對(duì)照《TheYeasts：ataxonomicstudy》（第三版）對(duì)酵母的描述，TJ-18為酵母屬的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。故將其命名為Saccharomyces cerevisiae TJ-18。

表6 TJ-18同化氮源試驗(yàn)結(jié)果Table 6 TJ-18 assimilation of nitrogen source test results

表7 TJ-18輔助生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 TJ-18 auxiliary results of physiological and biochemical

3 結(jié)論

本研究從自然界中分離得到的一株優(yōu)良的酒精生產(chǎn)菌株TJ-18，酒精產(chǎn)率比較高，達(dá)到5.9%（體積分?jǐn)?shù)）；殘還原糖約為1.00%，糖利用率較高，且發(fā)酵力突出，40℃培養(yǎng)72 h，CO2失重為10.4 g，表現(xiàn)出很好的發(fā)酵產(chǎn)酒精能力。同時(shí)也對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株的傳代穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，將得到的優(yōu)勢(shì)菌株分別接種到斜面培養(yǎng)基上傳代5次，均表現(xiàn)出較好的傳代穩(wěn)定性。

微生物菌種質(zhì)量的好壞對(duì)發(fā)酵工業(yè)有著及其重要的影響，這一研究的技術(shù)關(guān)鍵在于獲得高滲透壓且酒精發(fā)酵速率快、耐酒精和耐高溫的酵母菌種，這也是人們的研究熱點(diǎn)。TJ-18在實(shí)驗(yàn)過程中表現(xiàn)出較好的耐高溫和耐酒精特性，但是對(duì)具體適合該菌株的培養(yǎng)條件其它特性還不是很清楚，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步研究。

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