響應(yīng)面分析優(yōu)化加壓溶劑法提取甜菊糖苷工藝

俞堅

（杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，杭州市綠色精細化工研究與技術(shù)轉(zhuǎn)化重點實驗室，浙江杭州310018）

甜菊糖苷是甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni leaves）中提取的天然甜味劑[1]，2012年國家衛(wèi)生部批準其作為冷凍飲品、果凍等食品的添加劑。與蔗糖相比，甜菊糖苷是非發(fā)酵性物質(zhì)，對高溫、酸、堿相對穩(wěn)定[2]。它在食品加工過程中，不會像蔗糖那樣發(fā)生褐變現(xiàn)象，應(yīng)用成本比蔗糖低50%，熱值僅為蔗糖的1/300，甜度是蔗糖的250倍～300倍[3]。目前，國內(nèi)外提取甜菊糖苷的工藝主要采用熱水蒸煮法，該法簡單易行，提取成本較低，因此一直以來都被廣泛使用，此外，還有水提法[4]、酶法[5]等，但是由于這些傳統(tǒng)提取法存在提取時間長、溶劑用量大、原料利用率低等缺點，因此，不少學(xué)者對甜菊糖苷的提取進行了多方面的探索，越來越多新的工藝技術(shù)被引進，如超聲波提取技術(shù)[6]、超臨界提取技術(shù)[7]、微波提取技術(shù)[8]、超高壓提取技術(shù)[9]等。

加壓溶劑提取技術(shù)自1995年Richter等學(xué)者[10]提出方法以來，其應(yīng)用涉及食品、藥物分析、環(huán)境等諸多領(lǐng)域。與傳統(tǒng)熱水蒸煮法相比，加壓溶劑提取技術(shù)具有提取時間短、提取效率高、操作簡便、省時經(jīng)濟等優(yōu)點[11]。目前，已在植物有效成分的提取中得到了一定的應(yīng)用，但將其應(yīng)用于提取甜菊糖苷未見報道。本文嘗試采用加壓溶劑提取甜菊糖苷，并結(jié)合Box-Benhnken中心組合試驗和響應(yīng)面分析法對提取工藝進行優(yōu)化，以期為甜菊糖苷的快速高效提取提供一種新工藝技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

甜葉菊：購自于杭州藝福堂茗茶旗艦店，陰干后粉碎過80目標準篩。

氫氧化鉀、硫酸、酚酞等化學(xué)試劑均為分析純，實驗用水為雙蒸餾水。

Dionex-ASE200加壓溶劑提取儀：美國Dionex公司；AE240S分析天平：梅特勒-托利多上海有限公司；堿性滴定管：華東醫(yī)藥有限公司；布氏漏斗、小型粉碎機和超聲波清洗器等。

1.2 方法

1.2.1 甜菊糖苷提取得率的測定[12]

取甜葉菊2.000 g，加入30.0 mL水，經(jīng)加壓溶劑提取后，上清液減壓濃縮，移置250 mL錐形瓶中，加入稀硫酸25.0 mL與水25.0 mL，振搖溶解后，加熱至微沸，水解30 min，冷卻，過濾，濾渣用水洗至中性后，加中性乙醇50.0 mL，溶解后，再加酚酞指示劑2滴，用0.05 mol/L氫氧化鉀滴定至溶液顯紅色，10 s內(nèi)不褪色。每1.0毫升乙醇制氫氧化鉀滴定液相當于40.24 mg的C38H60O18。按下式求出甜菊糖苷得率：

式中：Y為甜菊糖苷得率，（mg/g）；V為消耗的氫氧化鉀體積，mL；M為甜葉菊質(zhì)量，g。

1.2.2 單因素試驗設(shè)計

依據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果，取甜葉菊2.000 g，加入30 mL水，設(shè)定加壓溶劑提取儀提取壓力8 MPa、提取時間10 min、提取溫度100℃中的3個因素，改變其中一個因素，進行單因素試驗，各因素梯度設(shè)計為：提取壓力 4、6、8、10、12 MPa；提取時間 1、5、10、15、20 min；提取溫度 60、80、100、120、140 ℃。

1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計方案做響應(yīng)曲面研究[13]。3個自變量提取壓力、提取時間和提取溫度分別以A，B和C代表，以+1，0，-1分別代表各自的不同水平，編碼因素及水平、試驗設(shè)計方案見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件繪圖并作方差和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 提取壓力對甜菊糖苷提取得率的影響

不同提取壓力對甜菊糖苷提取得率的影響，見圖1。

圖1 不同提取壓力對甜菊糖苷提取得率的影響Fig.1 Effect of treatment pressure on stevioside extraction rate

料液比為1∶15 g/mL，提取時間10 min，提取溫度100℃，考察提取壓力分別為4 MPa～12 MPa時對甜菊糖苷提取得率的影響。從圖1可知，加壓溶劑法提取甜菊糖苷，隨著提取壓力從4 MPa提高到12 MPa，甜菊糖苷提取得率不斷提高。當提取壓力達到10 MPa后，甜菊糖苷提取得率變化趨緩。初步推斷，提取高壓一方面保證了提取溶劑在100℃高溫下始終處于液體狀態(tài)；另一方面高壓可能會使提取樣品甜葉菊表面孔隙變多、變大，與提取溶劑接觸的比表面積增大。但是，過高的壓力會增加設(shè)備的維護費用。因此，選擇8 MPa～12 MPa區(qū)間作為響應(yīng)面優(yōu)化考察范圍。

2.1.2 提取時間對甜菊糖苷提取得率的影響

不同提取時間對甜菊糖苷提取得率的影響，見圖2。

圖2 不同提取時間對甜菊糖苷提取得率的影響Fig.2 Effect of treatment time on stevioside extraction rate

料液比為1∶15 g/mL，提取壓力8 MPa，提取溫度100℃，考察提取時間分別為1 min～20 min時對甜菊糖苷提取得率的影響。從圖2可知，加壓溶劑法提取甜菊糖苷，隨著提取時間從1 min延長到10 min，甜菊糖苷提取得率提高明顯；而10 min到20 min，甜菊糖苷提取得率幾乎沒有增加，反而略有下降。初步表明，在提取壓力8 MPa和提取溫度100℃下，提取10 min甜菊糖苷提取基本達到平衡。因此，選擇5 min～15 min區(qū)間作為響應(yīng)面優(yōu)化考察范圍。

2.1.3 提取溫度對甜菊糖苷提取得率的影響

不同提取溫度對甜菊糖苷提取得率的影響，見圖3。

圖3 不同提取溫度對甜菊糖苷提取得率的影響Fig.3 Effect of treatment temperature on stevioside extraction rate

料液比為1∶15 g/mL，提取壓力8 MPa，提取時間10 min，考察提取溫度分別為60℃～140℃時對甜菊糖苷提取得率的影響。從圖3可知，加壓溶劑法提取甜菊糖苷，隨著提取溫度從60℃上升到140℃，甜菊糖苷提取得率逐步提高。初步推測，溫度越高，提取溶劑擴散速度越快，且對樣品甜葉菊的破壞作用越大，有利于甜菊糖苷溶出。但是，溫度過高會使水溶性雜質(zhì)的溶出量增加，給后續(xù)甜菊糖苷的分離純化帶來困難。因此，選擇80℃～120℃區(qū)間作為響應(yīng)面優(yōu)化考察范圍。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

以提取壓力（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）為自變量，甜菊糖苷提取得率（R）為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果Table 2 Program and results of Response Surface Analysis

應(yīng)用Design Expert 8.0軟件進行多元回歸擬合分析，各試驗因子對響應(yīng)值的影響可用如下多元二次回歸方程表示：R=88.17+5.49 A+3.54 B+4.53 C-0.25 AB+0.47 AC+0.12 BC-7.43 A2-5.03 B2-2.71 C2

圖4～圖6直觀地反映了提取壓力、提取時間和提取溫度等3個因素兩兩交互對甜菊糖苷提取得率的影響。

圖4 提取壓力和提取時間對甜菊糖苷提取得率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plot showing the interactive effect of treatment pressure and time on stevioside extraction rate

圖5 提取壓力和提取溫度對甜菊糖苷提取得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot showing the interactive effect of treatment pressure and temperature on stevioside extraction rate

圖6 提取時間和提取溫度對甜菊糖苷提取得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot showing the interactive effect of treatment time and temperature on stevioside extraction rate

從圖4可以看出，提取壓力與提取時間交互作用中，沿提取壓力軸變化密集，而沿提取時間軸變化稀疏，故提取壓力對響應(yīng)值峰面積的影響較提取時間的影響大。從圖5可以看出，提取壓力與提取溫度交互作用中，沿提取壓力軸變化密集，而沿提取溫度軸變化稀疏，故提取壓力對響應(yīng)值峰面積的影響較提取溫度的影響大。從圖6可以看出，提取時間與提取溫度交互作用中，沿提取時間軸變化密集，而沿提取溫度軸變化稀疏，故提取時間對響應(yīng)值峰面積的影響較提取溫度的影響大。

對表2中的試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，得到的方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance for response surface regression equation

由表3可知，提取壓力、提取時間和提取溫度的一次項均達到極顯著水平（P＜0.000 1），整體模型的“Prob＞F”值小于0.000 1，表明該二次方程模型達到極顯著水平，并且失擬項不顯著，說明該方程對加壓溶劑法提取甜菊糖苷試驗擬合較好。

2.3 較優(yōu)工藝與驗證實驗

對回歸方程求導(dǎo)，并令R值等于零，可以得到曲面的最大點，即3個主要因素的最佳水平值，轉(zhuǎn)換后得到加壓溶劑法提取甜菊糖苷的最佳條件為：提取壓力10.8 MPa、提取時間11.8 min和提取溫度117.6℃，此時甜菊糖苷提取得率達91.9 mg/g。對預(yù)測值進行驗證，選擇的條件取整后提取壓力11 MPa、提取時間12 min和提取溫度118℃，甜菊糖苷的得率實際分別為91.7、91.6、91.7、91.9、91.8 mg/g，平均為 91.7 mg/g（標準偏差為0.11）。試驗測量值穩(wěn)定，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性良好，標準偏差較小，說明每次測定的甜菊糖苷得率穩(wěn)定，結(jié)果合理可靠。

3 結(jié)論與討論

加壓溶劑法提取甜菊糖苷經(jīng)單因素試驗和響應(yīng)面分析尋優(yōu)試驗，優(yōu)化了提取工藝參數(shù)（提取壓力、提取時間、提取溫度）最終獲得較優(yōu)的提取方案為：提取壓力11 MPa、提取時間12 min和提取溫度118℃，在此條件下甜菊糖苷提取得率達91.7 mg/g。加壓溶劑法提取甜菊糖苷具有效率高、設(shè)備操作簡單和污染小等優(yōu)點，符合當前甜葉菊提取物現(xiàn)代生產(chǎn)工藝技術(shù)的發(fā)展方向。

加壓溶劑提取功能性成分是近幾年來發(fā)展起來的較為高效的提取技術(shù)。Selim等學(xué)者[14]成功地用加壓溶劑法從安納托利亞蜂膠中獲得了具有抗氧化活性的酚類化合物。Diego等學(xué)者[15]證明了采用加壓溶劑技術(shù)從嘉寶果表皮提取酚類化合物具有良好的經(jīng)濟可行性和工業(yè)化前景。范曉良等學(xué)者[16]采用高壓溶劑萃取法提取香菇多糖，證明了該技術(shù)具有提取率高、省時、耗能少，操作方便等優(yōu)點。

本研究采用的加壓溶劑法提取甜菊糖苷的工藝方案是在實驗條件下獲得，工藝除了對提取壓力和提取時間的選擇外，提取溫度的選擇也至關(guān)重要，都直接關(guān)系到了甜菊糖苷提取得率的高低，若是提取壓力過高，保壓時間過長，會顯著增加設(shè)備的制造和維護成本；若是提取溫度過高，會使甜葉菊水溶性雜質(zhì)的溶出量增加，給甜菊糖苷后續(xù)的分離純化帶來困難。因此，對于加壓溶劑法提取甜菊糖苷的現(xiàn)代化工業(yè)實際應(yīng)用還須有一些需要改進的地方。

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