萘普生對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育及運(yùn)動(dòng)行為的影響

徐　超，陳楚楚，章超男，王　義，金晶晶

(浙江工業(yè)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，浙江 杭州 310014)

萘普生對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育及運(yùn)動(dòng)行為的影響

徐超，陳楚楚，章超男，王義，金晶晶

(浙江工業(yè)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，浙江 杭州 310014)

摘要：非甾體抗炎藥(NSAIDs)萘普生有著廣泛的使用，導(dǎo)致其在水環(huán)境和水生生物中被廣泛檢出.為考察萘普生水生環(huán)境安全，以斑馬魚胚胎為模型，將其暴露于不同質(zhì)量濃度的萘普生溶液中，觀察各時(shí)間點(diǎn)的死亡率、畸形率和孵化率等，并進(jìn)一步研究了萘普生對(duì)幼魚運(yùn)動(dòng)行為的影響.結(jié)果表明：萘普生對(duì)斑馬魚胚胎具有致死致畸效應(yīng)，呈明顯的時(shí)間—質(zhì)量濃度效應(yīng)關(guān)系.低質(zhì)量濃度組的萘普生對(duì)斑馬魚早期發(fā)育沒有顯著影響，而在高質(zhì)量濃度下，死亡率增加顯著，48 h的心包囊腫率高達(dá)85%.與發(fā)育毒性不同，低質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)組在光照和黑暗條件下均能顯著刺激了斑馬魚運(yùn)動(dòng)，而高質(zhì)量濃度2 mg/L實(shí)驗(yàn)組卻沒有明顯改變其運(yùn)動(dòng)活力.

關(guān)鍵詞：斑馬魚；萘普生；運(yùn)動(dòng)行為；毒性

非甾體抗炎藥(NSAIDs)是一類不含有甾體結(jié)構(gòu)的抗炎藥，廣泛用于骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等各種疼痛的緩解，是目前全球使用最多的藥物之一[1]萘普生(Naproxen，NPX)作為一種廣泛使用的的非甾體抗炎藥(NSAIDs)，具有抗炎、退熱和止疼等作用，經(jīng)常在廢水和生物樣品中被檢測(cè)到[2].已有研究表明其在市政污水廠排放口質(zhì)量濃度高達(dá)5.22 μg/L，在地表水中質(zhì)量濃度高達(dá)2.6 μg/L[3-4].通過目前已開展的水生毒性研究表明：長期低質(zhì)量濃度的萘普生暴露對(duì)網(wǎng)紋水蚤的繁殖有一定的抑制作用[5].同時(shí)還能對(duì)魚類產(chǎn)生潛在的甲狀腺干擾效應(yīng)[6].最近有研究表明：萘普生對(duì)斑馬魚關(guān)于抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)有一定的影響，其在腸道內(nèi)表達(dá)最為敏感[7].由此可見：萘普生對(duì)水生生物可能存在一定的毒性作用，對(duì)生態(tài)環(huán)境存在潛在威脅，所以合理評(píng)價(jià)它的危害是一項(xiàng)非常重要的工作.

近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者通過使用魚類作為模式生物來研究藥物的水生生物毒性，用以評(píng)價(jià)水生環(huán)境安全[8-9].斑馬魚(Danio rerio)是最常見的模型之一，這是由于其具有飼養(yǎng)簡單，魚卵透明易收集，遺傳學(xué)背景清晰，對(duì)毒化合物敏感等優(yōu)勢(shì)[10].與此同時(shí)，由于其對(duì)環(huán)境的變化非常靈敏，斑馬魚行為可以作為一個(gè)評(píng)價(jià)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的指標(biāo).例如，通過檢測(cè)斑馬魚幼魚的行為變化來比較BDE17和4'-OH-BDE17的毒性大小[11].筆者以斑馬魚為模式生物，主要研究萘普生對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)，以獲得更多關(guān)于萘普生釋放進(jìn)入環(huán)境中的風(fēng)險(xiǎn)信息，為萘普生的水生環(huán)境安全性評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù).

1材料和方法

1.1儀器與試劑

主要儀器：ZebraLab行為測(cè)試系統(tǒng)(ViewPoint Life Science，法國)，熒光倒置顯微鏡，其他儀器均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器.

主要試劑：萘普生(98%)購自Sigma-Aldrich公司(美國密蘇里州圣路易斯).標(biāo)準(zhǔn)品首先溶解在100% DMSO中制備成儲(chǔ)備液.臨用時(shí)將儲(chǔ)備液通過10% Hank’s 溶液(0.137 mol/L NaCl, 5.4 mmol/L KCl, 0.25 mmol/L Na2HPO4, 0.44 mmol/L KH2PO4, 1.3 mmol/L CaCl2, 1.0 mmol/L MgSO4, 4.2 mmol/L NaHCO3)逐級(jí)稀釋制備成暴露液，且溶劑DMSO的體積分?jǐn)?shù)為0.1%.本研究中使用的其他試劑均為色譜純，均購于Sigma-Aldrich公司(美國密蘇里州圣路易斯).萘普生的結(jié)構(gòu)式為

1.2實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)生物斑馬魚(Danio rerio)購于上海斑馬魚養(yǎng)殖基地，并在我們實(shí)驗(yàn)室條件下養(yǎng)殖和繁殖.斑馬魚飼養(yǎng)在一個(gè)恒定溫度(28±1) ℃，晝夜光照周期比為14︰10的水循環(huán)系統(tǒng)中.養(yǎng)殖用水需要通過活性炭過濾(pH為7.2～7.6，硬度為44～61 mg/L CaCO3).每天喂食兩次豐年蟲(Artemia nauplii)并及時(shí)清理缸中糞便和殘余餌料，定期換水.產(chǎn)卵時(shí)，挑選形態(tài)正常、個(gè)體較大和健康無病的的成年健康斑馬魚親魚按雌雄比1︰2配對(duì)飼養(yǎng)于玻璃魚缸中，用加熱棒調(diào)節(jié)水溫至(28±1) ℃.同時(shí)，用一層紗布將親魚限制在魚缸的上半部活動(dòng)，與缸底產(chǎn)出來的卵隔開，防止成魚吞食魚卵.第二天清晨天亮，安裝的定時(shí)燈同時(shí)打開時(shí)，加強(qiáng)光照刺激，產(chǎn)卵開始.胚胎收集后用經(jīng)活性炭過濾并曝氣的潔凈水洗去雜質(zhì)，再加入適宜質(zhì)量濃度的亞甲基藍(lán)溶液以殺菌.將收集到的受精卵放置在(27±1) ℃恒溫箱下待用.

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1胚胎發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)

將收集到的斑馬魚胚胎暴露于0，0.08，0.4，2 mg/L質(zhì)量濃度的萘普生溶液中，暴露至96 h.實(shí)驗(yàn)組均使用溶劑對(duì)照，即0.1% DMSO.質(zhì)量濃度范圍是根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)中短期暴露引起斑馬魚顯著表觀效應(yīng)而確定的.

暴露實(shí)驗(yàn)以500 mL燒杯作為實(shí)驗(yàn)容器，每個(gè)燒杯加入400 mL 試液，隨機(jī)分配100枚正常發(fā)育的胚胎.每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行.將燒杯置于溫度為(28±1) ℃，光照與黑暗比為14∶10條件下培養(yǎng).采用靜態(tài)置換法，每24 h更換一半暴露溶液，以保證溶液濃度及溶解氧等的穩(wěn)定.本毒性測(cè)試的終點(diǎn)包括心率、孵化率、死亡率和畸形率等.每24 h用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察并記錄，及時(shí)清除死的卵或幼魚.

1.3.2斑馬魚幼魚運(yùn)動(dòng)行為實(shí)驗(yàn)

斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)行為實(shí)驗(yàn)包括暴露實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)兩部分.當(dāng)暴毒至120 h時(shí)，挑取之前暴露后體態(tài)正常的幼魚用Hank’s培養(yǎng)液沖洗3次后轉(zhuǎn)移到檢測(cè)用的96孔板中，每個(gè)孔中加入100 μL Hank’s培養(yǎng)液，一條幼魚.每塊96孔板上包含兩個(gè)質(zhì)量濃度組，每個(gè)質(zhì)量濃度3組平行，共2塊板.幼魚運(yùn)動(dòng)行為的記錄通過使用ZebraLab行為記錄系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)，所使用的軟件是VideoTrack for zebrafish software version.行為實(shí)驗(yàn)方法參考先前的研究[12].通過設(shè)置和運(yùn)行Zebrabox，評(píng)價(jià)斑馬魚幼魚在光照和黑暗切換條件下的行為變化.在本實(shí)驗(yàn)中，幼魚轉(zhuǎn)移進(jìn)入Zebrabox后先在光照條件下適應(yīng)10 min之后，再開始行為記錄.光周期刺激始于光照(10 min)，接下來是交替進(jìn)行3個(gè)周期的黑暗(10 min) 和光照(10 min).總的測(cè)試時(shí)間為70 min.

1.3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Origin8.0和SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，并進(jìn)行t檢驗(yàn)和差異顯著性分析，概率值P<0.05為顯著，用*表示.

2結(jié)果與討論

2.1萘普生對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

2.1.1萘普生對(duì)斑馬魚胚胎死亡率的影響

在斑馬魚胚胎暴露于萘普生96 h過程中，觀察并記錄胚胎的死亡率(死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)是心跳衰竭、體節(jié)未成形或沒有尾巴)[13-14].將斑馬魚胚胎暴露于不同質(zhì)量濃度萘普生在4個(gè)觀察點(diǎn)(24，48，72，96 h)的死亡率統(tǒng)計(jì)于圖1.圖1中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值

±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示.*代表P<0.05，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異顯著.圖1結(jié)果顯示，隨著萘普生給藥質(zhì)量濃度的升高，在不同時(shí)間點(diǎn)胚胎死亡率都逐漸增加.并且高質(zhì)量濃度組的死亡率顯著高于對(duì)照組，2 mg/L實(shí)驗(yàn)組在4個(gè)觀察點(diǎn)的死亡率分別為24%，27.5%，27.5%，31%.

圖1　萘普生對(duì)斑馬魚胚胎24,48,72,96 h死亡率的影響Fig.1　Mortality of zebrafish embryos exposed to various concentrations of naproxen for different periods(24,48,72,96 h)

2.1.2萘普生對(duì)斑馬魚胚胎畸形率的影響

斑馬魚胚胎暴露于萘普生溶液中出現(xiàn)了各種不同的畸形現(xiàn)象，如圖2所示.為了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)畸形出現(xiàn)的頻率和強(qiáng)度，選取心包囊腫率及孵化率作為毒理學(xué)終點(diǎn)指標(biāo).

CB—身體彎曲；YSE—卵黃囊水腫；PE—心包囊水腫圖2　斑馬魚胚胎及幼魚的萘普生染毒情況Fig.2　Toxicity symptoms of naproxen zebrafish embryo and juvenile

斑馬魚胚胎暴露48 h后，心包囊腫率和孵化率如圖3所示.其中斑馬魚心包囊腫率隨著萘普生質(zhì)量濃度的增加而增加.與正常對(duì)照組相比，萘普生0.08，0.4 mg/L組心包囊腫率無顯著差異；而2 mg/L實(shí)驗(yàn)組的心包囊率顯著上升，高達(dá)85%，如圖3(a)所示.萘普生對(duì)胚胎孵化的抑制作用與質(zhì)量濃度存在依賴關(guān)系，即隨著萘普生質(zhì)量濃度的提高，胚胎的孵化率有明顯降低趨勢(shì)，從對(duì)照組的100%孵化降至2 mg/L實(shí)驗(yàn)組的72.5% 孵化，如圖3(b)所示.

斑馬魚胚胎的發(fā)育被Charles等[15]定義為7個(gè)階段:合子(0 h)、卵裂(0.75 h)、囊胚(2.25 h)、原腸(5.25 h)、分節(jié)(10 h)、咽囊(24 h)及孵化期(48 h).分析各毒理學(xué)終點(diǎn)可知：實(shí)驗(yàn)組在染毒12 h后，部分胚胎出現(xiàn)卵凝結(jié)現(xiàn)象，這可能是由于在萘普生的影響下，胚胎由于卵膜發(fā)育得并不完善，而出現(xiàn)的一定量的死亡.體外和臨床研究表明：NSAIDs可以富集在許多生物體內(nèi)[16-17].在48 h時(shí)，由于胚胎內(nèi)部有大量萘普生富集，從而影響細(xì)胞色素P450 1A酶對(duì)PAHs的調(diào)控作用[18]，從而暫緩了胚胎的發(fā)育，形成發(fā)育阻滯現(xiàn)象.與此同時(shí)，大量萘普生的富集還能導(dǎo)致胚胎及初生仔魚的發(fā)育畸形，如心包囊腫等.其中心包囊腫為萘普生對(duì)斑馬魚胚胎最敏感的指標(biāo)之一.涂文清將斑馬魚暴露于2，4，8，12 mg/L等一系列濃度的萘普生的96 h急性毒性實(shí)驗(yàn)中也有相似的現(xiàn)象[19].

圖3　萘普生對(duì)斑馬魚胚胎48 h心包囊腫率及孵化率的影響Fig.3　Pericardial edema rates and hatching rates of zebrafish embryos exposed to various concentrations of naproxen after 48 h exposuring

2.2萘普生對(duì)斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為的影響

斑馬魚幼魚經(jīng)不同質(zhì)量濃度萘普生染毒后，在光/暗周期刺激下產(chǎn)生了不同周期性運(yùn)動(dòng)變化，如圖4所示.圖4中底部的白色和黑色杠分別表示光照和黑暗.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示.*代表P<0.05，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，差異顯著.

圖4　萘普生對(duì)斑馬魚幼魚行為活力的影響Fig.4　The effect of naproxen on zebrafish larvae behavior

由圖4(a)可知：在不同質(zhì)量濃度萘普生處理下，發(fā)現(xiàn)幼魚的運(yùn)動(dòng)速度隨著質(zhì)量濃度的升高呈“倒U型”.其中，0.08，0.4 mg/L實(shí)驗(yàn)組時(shí)幼魚平均游速分別為(2.67±0.16)，(2.52±0.08) mm/s，顯著高于對(duì)照組(0.91±0.27) mm/s；而高質(zhì)量濃度2 mg/L的泳速(1.01±0.05) mm/s則與對(duì)照組并無顯著性差異.這可能是由于萘普生在低濃度促進(jìn)斑馬魚運(yùn)動(dòng)，而在高濃度下抑制斑馬魚運(yùn)動(dòng).這在斑馬魚胚胎暴露于氟蟲腈實(shí)驗(yàn)中也有相類似的現(xiàn)象[20].

由圖4(b)可知：不同質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)組斑馬魚幼魚在光照—黑暗交替條件的運(yùn)動(dòng)軌跡表現(xiàn)出一致的模式.與對(duì)照組相比，0.08，0.4 mg/L實(shí)驗(yàn)組每分鐘斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)速度在光照和黑暗條件下均出現(xiàn)了不同程度的增加.與對(duì)照組相比，0.08和0.4 mg/L實(shí)驗(yàn)組在光照及黑暗條件均顯著增加了3倍左右.而高質(zhì)量濃度2 mg/L實(shí)驗(yàn)組斑馬魚幼魚每分鐘的游速則與其基本一致.

圖4(c)顯示幼魚10 min 平均游動(dòng)速度也呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì).即相比對(duì)照組，0.08，0.4 mg/L暴露組幼魚在光照及黑暗條件均顯著增加了2倍左右.而2 mg/L 暴露組與對(duì)照組相比卻無顯著性變化.

ZebraLab斑馬魚行為軌跡記錄分析系統(tǒng)是一套可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)跟蹤和分析斑馬魚的運(yùn)動(dòng)，活動(dòng)和行為的高級(jí)視頻追蹤系統(tǒng)，給研究者提供了一個(gè)可控的斑馬魚實(shí)驗(yàn)環(huán)境用以獲取準(zhǔn)確可靠的斑馬魚行為軌跡追蹤數(shù)據(jù)[21].通過斑馬魚行為學(xué)數(shù)據(jù)可知：萘普生對(duì)斑馬魚的活動(dòng)有一定的影響.相比對(duì)照組，在低質(zhì)量濃度時(shí)，斑馬魚的平均游動(dòng)速度有顯著性的增加，活躍度明顯升高；而高質(zhì)量濃度組斑馬魚的平均游動(dòng)速度并沒有明顯改變.這可能是由于萘普生能夠進(jìn)入斑馬魚的腦組織，促使腦神經(jīng)及脊柱運(yùn)動(dòng)神經(jīng)產(chǎn)生了神經(jīng)毒性，從而影響運(yùn)動(dòng)功能.

結(jié)果表明：萘普生質(zhì)量濃度在mg/L數(shù)量級(jí)上會(huì)影響斑馬魚胚胎發(fā)育及其運(yùn)動(dòng)功能.另一方面，萘普生持續(xù)的排入水生環(huán)境中，因而被認(rèn)為是一種持久性化合物，導(dǎo)致非靶標(biāo)水生生物持續(xù)暴露于萘普生中.因此，我們要對(duì)萘普生進(jìn)行更全面的了解，同時(shí)還應(yīng)加強(qiáng)人們正確使用藥物的觀念及降低廢棄藥物的不正確排放，以保障不會(huì)有更多的萘普生進(jìn)入環(huán)境.

3結(jié)論

萘普生對(duì)斑馬魚胚胎具有致死及致畸效應(yīng).相比對(duì)照組，0.08，0.4 mg/L 實(shí)驗(yàn)組對(duì)斑馬魚胚胎的死亡率和畸形率都無顯著性影響，而2 mg/L實(shí)驗(yàn)組魚死亡率和畸形率都顯著提高，其中最敏感的指標(biāo)為心包囊腫.此外，萘普生對(duì)斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)行為也存在一定的影響.斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)速度隨著萘普生質(zhì)量濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，即“倒 U 型”，0.08，0.4 mg/L 實(shí)驗(yàn)組幼魚的平均速度顯著高于對(duì)照組，而2 mg/L實(shí)驗(yàn)組的泳速則與對(duì)照組無顯著性差異.且與對(duì)照組相比，幼魚對(duì)低質(zhì)量濃度萘普生的反應(yīng)非常劇烈，主要體現(xiàn)在對(duì)光暗變化時(shí)，游速瞬間增大，反應(yīng)更加劇烈.但是，高質(zhì)量濃度萘普生的運(yùn)動(dòng)規(guī)律未受明顯影響.

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(責(zé)任編輯：陳石平)

Influence of naproxen on zebrafish embryonic developmental toxicity and locomotor behavior

XU Chao, CHEN Chuchu, ZHANG Chaonan, WANG Yi, JIN Jingjing

(College of Environmental, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract:As one of the commonly used non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), naproxen was often detected in the sewage and aquatic organisms. In order to investigate the aquatic safety of naproxen, zebrafish embryos were used as a model, after exposing them to different concentrations of naproxen solution, the values of mortality, deformity rate and hatching rate for different toxicological end points were calculated. Furthermore the behaviors of zebrafish larvae exposed to naproxen were recorded. The results showed that naproxen had lethal effect and teratogenic effect on zebrafish embryos which showed concentration-dependent responses. Lower concentrations of naproxen had no significant influence on the early zebrafish development, but in higher concentration of 2 mg/L, the mortality of zebrafish was increased significantly, the rate of pericardial cyst at 48 h was also increased to 85% significantly. Furthermore the lower groups’ exposure caused hyper activity both in dark and light conditions, while the 2 mg/L group’s exposure did not cause alteration in locomotor behavior in zebrafish larvae.

Keywords:zebrafish; naproxen; behavior studies; toxicity

收稿日期：2015-12-25

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21277126)；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(Y15B070026)

作者簡介：徐超(1979—)，男，浙江杭州人，副教授，主要從事環(huán)境化學(xué)及毒理學(xué)究,E-mail:chaoxu@zjut.edu.cn.

中圖分類號(hào)：X506

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-4303(2016)04-0417-05