糖尿病腎病的細(xì)胞治療

黃湘華　綜述　王慶文　審校

糖尿病(DM)是全球性公共衛(wèi)生問題，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，2008年全球約有3.47億DM患者(約占成年人的9.5%)[1]。隨著DM發(fā)病率的快速升高，預(yù)計(jì)到2030年DM患者數(shù)量將倍增[2]。糖尿病腎病(DN)是DM的常見并發(fā)癥，也是DM患者的主要死亡原因之一。DM控制與并發(fā)癥隊(duì)列研究(DCCT)表明，1型DM(T1DM)中DN的發(fā)生率約17%[3]，T2DM中DN發(fā)生率人種間差異較大，亞洲人群發(fā)生率高于高加索人[4]，中國T2DM中DN的發(fā)生率高達(dá)34.7%[5]。DN以蛋白尿及進(jìn)行性的腎功能減退為主要特點(diǎn)，其進(jìn)展速度遠(yuǎn)快于非DN患者。目前DN仍缺乏有效的治療方法，大部分DN患者快速進(jìn)展至慢性腎功能不全，甚至終末期腎病(ESRD)。在尿蛋白定量>0.5 g/d或肌酐>132.6 μmol/L的T1DM患者中，其腎小球?yàn)V過率(GFR)每年下降速度約23%±25%[6]。因此，研發(fā)DN的新型療法顯得尤為迫切。細(xì)胞治療是近年來研究的熱點(diǎn)，且在心臟疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面展示了其治療潛能，目前也有一些研究顯示其在DN中的治療前景，本文將綜述細(xì)胞治療在DN中的研究進(jìn)展。

內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)

內(nèi)皮細(xì)胞損傷在DN中的發(fā)病機(jī)制維持腎臟毛細(xì)血管網(wǎng)的完整性至關(guān)重要，其不但是腎小球超濾的基礎(chǔ)，也向腎小管提供氧和營養(yǎng)物質(zhì)。與其他腎臟疾病類似，進(jìn)展性DN患者在腎小球及腎小管間質(zhì)都存在明顯的毛細(xì)血管數(shù)量減少，并伴腎間質(zhì)纖維化和腎小球足細(xì)胞病變。事實(shí)上，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是毛細(xì)血管數(shù)量減少的關(guān)鍵因素[7]。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡通過直接作用(旁分泌)和間接作用(缺氧)共同促進(jìn)腎臟纖維化的發(fā)展，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可釋放促纖維化的細(xì)胞因子(如結(jié)締組織生長因子等)，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)合成和肌成纖維細(xì)胞分化，同時(shí)，管周毛細(xì)血管數(shù)量減少可導(dǎo)致腎小管細(xì)胞氧供減少，加劇腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化[8]。而在DN體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，高糖及其下游的效應(yīng)分子可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加[9]。另一方面，DN足細(xì)胞病變也不是孤立存在的，足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用在其中起重要作用，足細(xì)胞病變可分泌一系列細(xì)胞因子(如血管內(nèi)皮生長因子)，可作用于鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞，而內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血栓調(diào)節(jié)蛋白減少可加劇足細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致蛋白尿增多[10]。

EPCs在DN中的應(yīng)用成人血管生成和修復(fù)主要依靠局部?jī)?nèi)皮細(xì)胞的增生和遷移，以形成新的血管芽。骨髓來源的EPCs在成人微血管修復(fù)和新生血管發(fā)生中起重要作用。目前，仍無特異性的細(xì)胞表面標(biāo)志物確定骨髓來源的血管生成活性細(xì)胞類型，一般使用多種細(xì)胞表面標(biāo)志綜合判斷。如CD34和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(VEGFR-2)常被用來作為EPCs的表面標(biāo)志物[11]。EPCs不僅可直接生成內(nèi)皮細(xì)胞，也可通過旁分泌作用生成多種細(xì)胞因子發(fā)揮作用。此外，也有學(xué)者認(rèn)為部分EPCs輸注體內(nèi)后可能通過系統(tǒng)性或內(nèi)分泌的作用模式起作用[12]。EPCs的上述特點(diǎn)使其在內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)和缺血后的血管生成中起重要作用，目前已有研究使用EPCs治療一些缺血性疾病，包括腎臟疾病[13]。

Yuen等[14]利用慢性腎臟病鼠模型觀察EPCs是否能改善腎功能，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予來源于4周齡F344大鼠骨髓的106個(gè)EPCs，結(jié)果GFR明顯提高，作用與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑治療類似。與阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)不同，這種細(xì)胞治療并未降低血壓。此外，EPCs治療也能減少尿蛋白，提高腎小球與間質(zhì)的毛細(xì)血管密度，減輕腎小球硬化和小管間質(zhì)的纖維化。上述研究中EPCs來源于健康供者，而DM供者的EPCs是否能取得同樣的效果？研究者利用DM小鼠來源的EPCs重復(fù)了上述研究，得到相似結(jié)論，說明DM患者來源的EPCs同樣具有治療價(jià)值[13]。在上述研究之后，有學(xué)者探討了EPCs在db/db小鼠的DN模型中的作用，盡管這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并沒有GFR的下降。研究表明，不管是給予來源于非DM(db/m)還是DM(db/db)小鼠的EPCs，輸注至db/db小鼠體內(nèi)后，均可減輕白蛋白尿的進(jìn)展和系膜基質(zhì)增生的程度[15]。這些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了利用DM患者的自體EPCs治療DN的潛在價(jià)值。雖然目前EPCs治療DN的療效尚未在臨床試驗(yàn)中得到驗(yàn)證，但其對(duì)于微血管系統(tǒng)的修復(fù)能力已廣為所知。EPCs的特性與上述細(xì)胞有相似之處，有望成為治療DN的新方法。

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)

MSCs是一類具有多向分化潛能和自我更新能力的干細(xì)胞，存在于體內(nèi)多種組織器官[16]。MSCs具有免疫調(diào)節(jié)能力，也可分化為中胚層的多種組織(如肌肉、血管、皮膚、骨組織等)，MSCs的這些特點(diǎn)使得其可應(yīng)用于治療多種疾病，包括DM各種并發(fā)癥[17]。通過分泌可溶性細(xì)胞因子，MSCs可以改變樹突狀細(xì)胞的分泌譜，導(dǎo)致抗炎的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素11(IL-11)分泌增加，同時(shí)減少γ干擾素(IFN-γ)和IL-12的分泌。通過增強(qiáng)抑制分子程序死亡因子1與其配體的連接，MSCs也能抑制T細(xì)胞的增生。此外，MSCs能通過增加CD4+、CD25+和FoxP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞數(shù)量來抑制免疫反應(yīng)[18]。研究表明DM的發(fā)生發(fā)展與T調(diào)節(jié)細(xì)胞和Th17細(xì)胞擴(kuò)增都有一定關(guān)系[19]，所以MSCs的治療作用首先應(yīng)歸功于其分泌的免疫調(diào)節(jié)因子。此外MSCs的分化能力和自我更新能力也是其治療DN的重要基礎(chǔ)。

目前已有多個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSCs可改善DN的腎臟病變。在鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)T1DM C57BL/6小鼠模型中，予小鼠骨髓來源的MSCs后，小鼠血糖水平可恢復(fù)正常，白蛋白尿較前減輕，腎臟組織病理改變也得到改善。另一項(xiàng)研究中，研究者使用STZ誘導(dǎo)的NOD/SCID(非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷)DN小鼠模型，靜脈予人源性的MSCs后得到了相似的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腎臟病變明顯改善[20]。這兩項(xiàng)研究均表明靜脈注射的MSCs可定植在受損的腎臟，分化為腎臟內(nèi)的細(xì)胞，并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，從而使腎臟病變得到修復(fù)。部分人源性MSCs輸注后可表達(dá)CD31分子，提示其可分化為內(nèi)皮細(xì)胞。雖然MSCs可以重建DN中節(jié)段壞死的腎小球結(jié)構(gòu)，但其植入后是否具有增生能力仍不明確。輸注MSCs 1月后，腎臟內(nèi)幾乎檢測(cè)不到MSCs，提示MSCs并不能在腎臟內(nèi)增生，MSCs改善腎臟功能可能通過清除具細(xì)胞毒性的分子及促進(jìn)新生血管生成起作用[21,22]。此外，MSCs能夠分化為具有胰島素分泌功能的β細(xì)胞，通過降低血糖和糖尿來達(dá)到治療DN的效果。進(jìn)一步的研究表明，MSCs減輕STZ誘導(dǎo)的DN動(dòng)物模型腎臟病變的機(jī)制之一是通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MARK)信號(hào)通路，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和前炎癥因子受抑制[23]。這些實(shí)驗(yàn)研究都表明MSCs移植可使DN實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腎臟病變減輕，但其能否成功應(yīng)用于臨床仍有待進(jìn)一步的研究。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

由于器官特異性干細(xì)胞的增生分化潛能有限，而胚胎干細(xì)胞(ES)研究又涉及諸多的倫理學(xué)問題，近年來，研究的熱點(diǎn)開始轉(zhuǎn)向同樣具有無限增生能力和分化潛能的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)[24-26]。iPS細(xì)胞的體外培養(yǎng)和分化特點(diǎn)也可用于疾病模型的建立、藥物的篩選、毒性試驗(yàn)、特異性細(xì)胞和組織類型的發(fā)育研究[27]。目前iPS細(xì)胞已被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、造血細(xì)胞和肝細(xì)胞等，但是誘導(dǎo)分化為腎臟細(xì)胞系的方法仍未建立[28]。Takahashi和Yamanaka[24]最早通過對(duì)體細(xì)胞基因的重編程，導(dǎo)入Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc四個(gè)基因后，產(chǎn)生具有胚胎干細(xì)胞特征的新型細(xì)胞(即iPS細(xì)胞)。此后，Yu等[26]還確定了另一組可以重編程為iPS細(xì)胞的基因組合(OCT4、SOX2、NANOG和LIN28)。這些研究開啟了iPS細(xì)胞研究的大門，iPS細(xì)胞研究技術(shù)進(jìn)入快速發(fā)展的階段。

目前有關(guān)從iPS細(xì)胞生成腎臟細(xì)胞系的研究屈指可數(shù)。一項(xiàng)研究表明，iPS細(xì)胞在給予激活素A和骨形成蛋白7(BMP7)或膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)處理后，分化產(chǎn)生的細(xì)胞可表達(dá)腎臟細(xì)胞系的表面標(biāo)志物[29]。因?yàn)閕PS細(xì)胞與ES細(xì)胞具有幾乎相同的表型，而ES具有生成中胚層細(xì)胞和腎臟細(xì)胞系的能力，所以只要找到合適的方法，iPS細(xì)胞也應(yīng)該具有分化為腎臟細(xì)胞的能力。ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞都是多能干細(xì)胞，不同來源決定其具有分化為特定細(xì)胞譜系的傾向[30]。最近有研究把人腎小球系膜細(xì)胞[31]和來源于尿液的腎小管細(xì)胞[32]重編程為iPS細(xì)胞。這些iPS細(xì)胞系可能更適合于生成腎臟細(xì)胞系。

DN最終會(huì)導(dǎo)致蛋白尿、腎間質(zhì)纖維化和ESRD，理論上也能接受iPS細(xì)胞治療。但使用iPS細(xì)胞生成的腎小球足細(xì)胞或腎小管細(xì)胞治療仍面臨幾個(gè)問題：(1)細(xì)胞治療方式的選擇，靜脈注射、直接移植到腎實(shí)質(zhì)或腎外部位都是可選的方法，從MSCs的研究結(jié)果看，直接靜脈注射可行性更大；(2)血糖對(duì)植入細(xì)胞的影響，高糖可能降低細(xì)胞植入的效率，損傷移植細(xì)胞并導(dǎo)致DN復(fù)發(fā)。正如再生醫(yī)學(xué)治療其他疾病一樣，iPS細(xì)胞治療DN仍面臨諸多挑戰(zhàn)。但iPS細(xì)胞仍具有廣闊的應(yīng)用前景，到2011年12月，已報(bào)道了近60種疾病特異性的iPS細(xì)胞，其中包括T1DM[33]。這些細(xì)胞系既可用于了解疾病的發(fā)病機(jī)制也可提供細(xì)胞治療的細(xì)胞來源。

胰島干細(xì)胞

高血糖是導(dǎo)致DN持續(xù)進(jìn)展的重要因素。與標(biāo)準(zhǔn)胰島素治療的DM患者相比，強(qiáng)化胰島素治療可減少微量白蛋白尿的發(fā)生[34]。胰腺移植或胰島細(xì)胞治療是目前能使DM患者維持血糖長期正常的唯一治療方法，且無低血糖的風(fēng)險(xiǎn)[35]。目前胰腺移植或胰腎聯(lián)合移植已成為T1DM治療的重要手段，全球已有超過23 000例的胰腺移植病例[36]。雖然胰腺移植使血糖得到了有效的控制，但術(shù)后免疫抑制劑的使用則會(huì)造成腎毒性，從長期結(jié)果來看，與DM相關(guān)的腎臟形態(tài)學(xué)改變可得到有效改善，但是移植與非移植患者的GFR下降并無明顯差別。對(duì)于GFR< 80 ml/(min·1.73m2)的患者，胰腺移植是GFR下降的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，故移植前應(yīng)考慮腎臟并發(fā)癥情況，選擇合適的受者[37]。

胰島干細(xì)胞是DM治療研究熱點(diǎn)之一。研究表明，胰管是β細(xì)胞的前體細(xì)胞存在的主要部位。胰管祖細(xì)胞的分化保持了胰島細(xì)胞的穩(wěn)定及更新。研究者已經(jīng)從成人胰島及胰島來源的細(xì)胞中得到多能前體細(xì)胞，可分化為具有β細(xì)胞功能的細(xì)胞[38]。Ngn-3是人類胰腺內(nèi)分泌功能發(fā)育過程的關(guān)鍵因子，而胰管細(xì)胞可以表達(dá)這種因子，并轉(zhuǎn)化為具有胰島素分泌能力的細(xì)胞。此外，以胰管和腺泡細(xì)胞混合，輔以上皮生長因子和胃泌素，可獲得新生的胰島β細(xì)胞并增加有功能的β細(xì)胞數(shù)量?；谏鲜龅难芯砍晒?，胰島干細(xì)胞可能成為胰島生成的一種細(xì)胞來源，為DM及其并發(fā)癥(如DN)的治療提供新的途徑[39]。

小結(jié)：DN是導(dǎo)致ESRD的重要原因之一，目前缺乏有效的治療手段，亟待研究新型的治療方法。細(xì)胞治療是繼藥物、手術(shù)之后的第三種治療手段，已經(jīng)在血液疾病、自身免疫病等多種疾病中展示出良好的治療效果。目前的研究表明EPCs、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、MSCs及胰島細(xì)胞移植在DN中均有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但是有關(guān)干細(xì)胞治療的研究均處于臨床前的階段，真正應(yīng)用于臨床仍有很多問題尚待解決。

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