糖尿病腎病的生物標(biāo)志物

安　玉　綜述　蔣　松　審校

糖尿病腎病(DN)是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥，是引起終末期腎病(ESRD)的主要病因之一，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，造成巨大的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而，僅30%～40%的1型糖尿病患者和15%～20%的2型糖尿病患者會進(jìn)展至DN[1]。因此，尋找早期診斷DN、判斷病情嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物顯得尤為重要。由于DN的發(fā)病機(jī)制涉及多種基因、蛋白質(zhì)、代謝和環(huán)境因素，其生物標(biāo)志物也多種多樣。本文就目前DN生物標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀作一綜述。

傳統(tǒng)的DN生物標(biāo)志物

上世紀(jì)80年代以來，蛋白尿和微量白蛋白尿一直被認(rèn)為是診斷DN的金標(biāo)準(zhǔn)，并由此決定DN的分期[2]。然而，越來越多的研究表明，蛋白尿尤其是微量白蛋白尿在DN的診斷上缺乏敏感性和特異性，且尿蛋白在判斷腎功能預(yù)后方面受到很大限制[3-5]。相當(dāng)一部分1型糖尿病患者在尿白蛋白正常時(shí)即出現(xiàn)腎功能減退，或尿微量白蛋白穩(wěn)定時(shí)仍出現(xiàn)腎功能持續(xù)減退。因此，人們對于影響尿蛋白進(jìn)展因素的關(guān)注越來越多的轉(zhuǎn)移到影響早期腎功能減退的相關(guān)機(jī)制上。

血清肌酐(SCr)、胱抑素C等反映腎小球?yàn)V過功能的指標(biāo)是目前臨床應(yīng)用的另一大類判斷DN進(jìn)展的生物標(biāo)志物。然而，此類生物標(biāo)志物同樣存在敏感性和特異性不高的問題，尤其是在腎臟代償功能良好時(shí)不能準(zhǔn)確反映腎臟受損情況[6]。SCr還受年齡、體重、蛋白攝入量等多種因素影響。胱抑素C作為一種內(nèi)源性蛋白酶抑制劑，可經(jīng)腎小球自由濾過，不受上述因素影響，在反應(yīng)早期腎小球?yàn)V過功能的敏感性方面優(yōu)于SCr。但由于其檢測價(jià)格較昂貴，且在炎癥、激素治療、甲狀腺功能亢進(jìn)等情況下反映的腎小球?yàn)V過率(GFR)較實(shí)際偏低，因此在臨床應(yīng)用上尚不能取代SCr。

基于腎小球?yàn)V過膜損傷的生物標(biāo)志物

基于足細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志物足細(xì)胞即腎小球臟層上皮細(xì)胞，是一種高度終末分化的突狀細(xì)胞。正常情況下足細(xì)胞及其足突與腎小球基膜(GBM)、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞一起，構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障。以往認(rèn)為，腎小球系膜基質(zhì)增多是DN的主要病理改變，然而，新的研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞損傷在DN的發(fā)展中同樣起關(guān)鍵作用[7]。

有證據(jù)表明在DN發(fā)展早期即出現(xiàn)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，主要表現(xiàn)足細(xì)胞凋亡或從GBM脫落所導(dǎo)致的足細(xì)胞數(shù)目減少，足突融合、消失，逐步出現(xiàn)腎小球纖維化[7，8]。有趣的是，許多尿液中的足細(xì)胞實(shí)際是存活的，且足細(xì)胞尿在反映活動(dòng)性腎小球損傷的敏感性方面優(yōu)于蛋白尿[8]。因此，尿中足細(xì)胞及其特異性蛋白產(chǎn)物有可能作為DN腎小球損傷的生物標(biāo)志物[8]。然而，由于足細(xì)胞尿的檢測十分耗時(shí)，且高度依賴于檢測者的水平，目前在臨床上推廣足細(xì)胞尿的檢測還存在很大的技術(shù)難度。

對足細(xì)胞特異性蛋白產(chǎn)物的研究主要集中在足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白(nephrin、podocin)和細(xì)胞骨架蛋白(synaptopodin)上。上述三種蛋白質(zhì)在DN患者腎組織中的表達(dá)均下調(diào)，近來其作為尿液標(biāo)志物的研究也有了新的進(jìn)展[9]。Wang等[10]通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測尿mRNA的方法發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，DN患者尿中nephrin、podocin和synaptopodin的表達(dá)均上調(diào)，其中，nephrin和synaptopodin的表達(dá)與蛋白尿和腎功能相關(guān)。Jim等[11]對2型糖尿病患者的研究表明，所有出現(xiàn)微量白蛋白尿和蛋白尿的DN患者與54%白蛋白尿正常的DN患者，均出現(xiàn)尿nephrin水平的升高。尿nephrin水平與蛋白尿和收縮壓水平顯著相關(guān)，而與血白蛋白水平和eGFR無關(guān)，提示尿nephrin可能作為一種臨床前期DN的生物標(biāo)志物[11]。

基于內(nèi)皮細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志物糖尿病患者微血管并發(fā)癥(如腎臟、視網(wǎng)膜病變)均與內(nèi)皮細(xì)胞功能密切相關(guān)。晚期DN患者在病理上常表現(xiàn)出典型內(nèi)皮細(xì)胞受損改變，如腎小球微血管瘤、系膜溶解、K-W結(jié)節(jié)等[12]。內(nèi)皮細(xì)胞損傷可直接影響腎小球?yàn)V過膜通透性的改變，因而一些反映內(nèi)皮細(xì)胞功能的指標(biāo)可能具有判斷DN損傷程度的潛能。

早在1989年，Jensen等[13]首次發(fā)現(xiàn)1型糖尿病患者血漿血管性血友病因子(vWF)水平升高，證實(shí)糖尿病患者存在內(nèi)皮細(xì)胞損傷。隨后的研究表明，無論是1型還是2型糖尿病患者，血漿vWF水平均與腎小球損傷程度呈正相關(guān)，vWF水平正常者腎臟形態(tài)學(xué)變化多不明顯[12]。此外，許多內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子在DN患者也有不同程度的改變[14]。

細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)是一種介導(dǎo)T細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的黏附分子。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，DN患者血漿ICAM-1水平升高，并與腎臟損傷程度直接相關(guān)。在基線ICAM-1水平較高的1型糖尿病患者，進(jìn)展至持續(xù)微量白蛋白尿的風(fēng)險(xiǎn)倍增，同時(shí)尿蛋白排泄率增加的速度也加快[15]。血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)是表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞表面的另一種黏附分子。DN患者血漿VCAM-1水平亦升高，并與尿蛋白直接相關(guān)。在一項(xiàng)針對2型DM患者的前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，血漿VCAM-1水平升高，患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加[14,16]。

基于GBM損傷的生物標(biāo)志物細(xì)胞外基質(zhì)和GBM增厚是DN的主要病理特點(diǎn)之一。糖尿病患者在正常白蛋白尿時(shí)即出現(xiàn)GBM增厚[17]。Ⅳ型膠原是一種分子量為540 kD的大分子蛋白，是GBM及細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分。由于正常情況下血漿Ⅳ型膠原不能通過腎小球?yàn)V過屏障，因此在一定程度上，尿液Ⅳ型膠原可反映GBM損傷情況。

橫斷面研究表明，DN患者尿液Ⅳ型膠原濃度在微量白蛋白尿出現(xiàn)前已升高，并隨著蛋白尿和SCr的增加逐步升高[18]。近來通過對1型糖尿病和2型糖尿病患者的長期隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，尿液Ⅳ膠原濃度與eGFR的下降顯著相關(guān)[19，20]，提示尿液Ⅳ型膠原可能作為DN早期診斷和判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物。然而，由于關(guān)于Ⅳ型膠原的研究多集中在日本人群中，且受到樣本量的限制，其作用有待更進(jìn)一步的研究證實(shí)。

基于腎小管損傷的生物標(biāo)志物

腎小管間質(zhì)同樣在DN的發(fā)展中起著重要作用，其病變嚴(yán)重程度與DN遠(yuǎn)期預(yù)后密切相關(guān)。敏感的腎小管標(biāo)志物在損傷早期、腎臟形態(tài)學(xué)改變輕微時(shí)即出現(xiàn)異常，在評價(jià)DN的預(yù)后與監(jiān)控治療效果方面具有巨大的潛能[21]，因而成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

腎小管標(biāo)記物主要有嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)、腎損傷分子1(KIM-1)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白(LFABP)及心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(HFABP)等[22]。其中，NGAL、KIM-1、NAG、LFABP主要與近端腎小管損傷有關(guān)，而HFABP主要與遠(yuǎn)端腎小管損傷有關(guān)。已知上述標(biāo)志物在早期診斷急性腎損傷方面作用確切，近來其在慢性腎臟病中的作用也備受關(guān)注。

據(jù)Nielsen等[23，24]報(bào)道，1型糖尿病患者尿NGAL、LFABP水平在出現(xiàn)蛋白尿和微量白蛋白尿之前即已升高。然而，一項(xiàng)對基線尿蛋白水平為1 141 mg/24h的1型糖尿病患者隨訪3年的研究表明，尿LFABP與GFR的下降并無相關(guān)性，提示LFABP可能在疾病早期診斷比較有效，而在DN晚期作用不明顯[25]。該項(xiàng)研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，尿NAGL、KIM-I水平的升高與GFR的下降相關(guān)，經(jīng)尿蛋白、收縮壓等校正后，這種相關(guān)性不復(fù)存在，似乎說明這兩種腎小管標(biāo)志物與已知的影響慢性腎臟病進(jìn)展的因素相比并無優(yōu)勢。經(jīng)過氯沙坦(100 mg/d)治療1年可使1型DN患者尿KIM-1水平下降43%。與此同時(shí)，Nauta等[26]在另一項(xiàng)橫斷面研究中發(fā)現(xiàn)，與非糖尿患者相比，1型糖尿病患者尿NAG、NGAL、HFABP水平在正常白蛋白尿時(shí)即明顯升高，并隨著蛋白尿的增多進(jìn)一步升高，其水平與蛋白尿和eGFR顯著相關(guān)，而與年齡、性別、相應(yīng)標(biāo)志物的血漿濃度無關(guān)。然而，經(jīng)蛋白尿校正后，僅尿HPABP與eGFR仍呈顯著相關(guān)性，提示HPABP有望成為評價(jià)DN遠(yuǎn)期預(yù)后的新型生物標(biāo)志物。

基于系統(tǒng)性炎癥的生物標(biāo)志物

慢性微炎癥狀態(tài)是DN的另一特點(diǎn)。在DN發(fā)展的每一階段，始終伴隨著炎癥細(xì)胞的浸潤，細(xì)胞外基質(zhì)成分的增多，表現(xiàn)為腎小球系膜基質(zhì)增生，腎小管基膜增厚，最終出現(xiàn)球性廢棄和間質(zhì)纖維化。多種炎性細(xì)胞因子、趨化因子及其受體、黏附分子及轉(zhuǎn)錄因子等構(gòu)成復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)，參與DN的病理生理過程，不僅為DN的治療靶點(diǎn)提供了新的思路，某些關(guān)鍵的炎癥分子也可能成為DN診斷與判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物[14]。

研究表明，多種細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素6(IL-6)、IL-18、成纖維細(xì)胞生長因子23(FGF-23)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、單核細(xì)胞趨化蛋白1、結(jié)締組織生長因子等都可能是潛在的DN生物標(biāo)志物[14，27，28]。例如，前瞻性研究表明，DN患者血清及尿液IL-18水平不僅與蛋白尿直接相關(guān)，同時(shí)血清IL-18水平的升高還可預(yù)測2型糖尿病患者早期腎功能的下降[14]。FGF-23同樣被認(rèn)為是可以判斷DN患者腎臟預(yù)后的獨(dú)立因素，當(dāng)血清FGF-23濃度>70 pg/ml時(shí)，發(fā)生死亡、SCr倍增、透析等風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[28]。

引人注目的是，近期有兩項(xiàng)分別對628例1型糖尿病患者和410例2型糖尿病患者隨訪12年的大型前瞻性研究表明，腫瘤壞死因子α受體(TNFR)在判斷DN預(yù)后方面具有令人振奮的潛能[29，30]。據(jù)報(bào)道，無論是1型糖尿病還是2型糖尿病，血清TNFR水平的升高均與腎功能的下降顯著相關(guān)，且這種相關(guān)性不受尿蛋白及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑治療的影響。TNFR1水平對判斷2型糖尿病患者預(yù)后更有意義，而TNFR2在1型糖尿病患者更有意義。由于DN的進(jìn)展受到多種因素影響，單一的生物標(biāo)志物僅僅反映了一系列生物過程的協(xié)同作用，其有效性與穩(wěn)定性都有待更多的臨床實(shí)踐進(jìn)一步證實(shí)[31]。

系統(tǒng)生物學(xué)方法在尋找DN標(biāo)記物中的應(yīng)用

隨著人類基因組計(jì)劃工作的完成、現(xiàn)代分子基因技術(shù)的不斷更新和計(jì)算機(jī)技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，系統(tǒng)生物學(xué)研究給腎臟病學(xué)的發(fā)展帶來了新的動(dòng)力。高通量的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等從整體角度出發(fā)，研究復(fù)雜疾病所涉及的多種基因、蛋白質(zhì)及代謝產(chǎn)物，對于加深疾病認(rèn)識、尋找新的治療手段意義重大，同時(shí)也為發(fā)現(xiàn)有效的生物標(biāo)志物提供了新的視野。

基因組學(xué)與以往遺傳學(xué)研究僅集中于少數(shù)候選基因不同，基因組學(xué)是對整個(gè)人類基因組序列進(jìn)行研究。全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(GWAS)無需募集遺傳家系，直接通過高通量測序技術(shù)，檢測整個(gè)基因組中數(shù)以萬計(jì)的遺傳標(biāo)記與疾病之間的關(guān)聯(lián)。目前針對1型和2型DN開展的GWAS研究，均已發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與DN的易感性相關(guān)的基因位點(diǎn)[32，33]，而對其表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的研究必將有助于新的DN生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。

蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)是一種利用質(zhì)譜方法進(jìn)行高通量蛋白質(zhì)成分檢測，并通過生物信息學(xué)工具進(jìn)行分析和處理的新技術(shù)[34]。尿液蛋白質(zhì)組學(xué)由于其無創(chuàng)性受到更多的重視。迄今為止，通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，已發(fā)現(xiàn)34種不同的蛋白質(zhì)在DN患者的尿液中表達(dá)上調(diào)，另有34種蛋白質(zhì)表達(dá)下降[35]。已知的443種尿液蛋白肽段中，約50%含有Ⅰ型膠原α1和Ⅲ型膠原α1片段，后續(xù)的臨床試驗(yàn)證實(shí)，尿液Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原片段可能是比蛋白尿更早期、特異性更高的生物標(biāo)志物[36]。

代謝組學(xué)代謝組學(xué)作為基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的延伸，是對生物樣本(血液、尿液、組織等)進(jìn)行氣相或液相色譜分離后，通過代謝譜差異分析，了解體內(nèi)或體外代謝過程的研究方法[37]。由于DN是一種受多種因素影響的代謝紊亂性疾病，而代謝組學(xué)恰恰讓我們了解在遺傳背景、環(huán)境因素、生活方式等多種因素相互作用下機(jī)體不同的代謝反應(yīng)，因而特別適用于尋找DN生物標(biāo)志物。目前已有多種糖代謝、脂代謝及氨基酸代謝產(chǎn)物經(jīng)過代謝組學(xué)的方法被證實(shí)具有作為DN新的生物標(biāo)志物的潛能[38]。

雖然系統(tǒng)生物學(xué)在DN研究中的應(yīng)用，使得我們在增加對DN分子機(jī)制了解的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了一系列具有早期診斷和預(yù)后判斷潛能的分子標(biāo)志物。然而，由于缺乏統(tǒng)一的研究設(shè)計(jì)、標(biāo)本處理標(biāo)準(zhǔn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，如何從系統(tǒng)生物學(xué)的海量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中獲得有意義的信息并進(jìn)行大樣本的臨床驗(yàn)證，是目前亟需解決的難題。因此，有學(xué)者提出，在未來系統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域的研究，可能需要整合基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等多維數(shù)據(jù)，以獲取更加確切的信息，并進(jìn)行大樣本的臨床驗(yàn)證試驗(yàn)[22]。

綜上所述，目前在DN發(fā)病各個(gè)環(huán)節(jié)尋找有效的生物標(biāo)志物均已有了很大進(jìn)展。然而，遺憾的是，盡管蛋白尿和微量白蛋白尿作為DN生物標(biāo)志物有著顯著的缺陷，臨床上至今尚無有效的生物標(biāo)志物能夠取代其在DN診斷與判斷療效方面的地位?，F(xiàn)有的對DN各種生物標(biāo)志物的研究多屬橫斷面研究，大多數(shù)研究所納入的病例并非經(jīng)腎活檢明確診斷的DN，部分研究在評估腎小球?yàn)V過功能方面采用胱抑素C、SCr、eGFR等代替實(shí)際GFR，可能會給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來一定誤差。同時(shí)，現(xiàn)有研究多局限于某一特定種族，而遺傳背景在DN發(fā)病機(jī)制中無疑扮演著重要角色。更多基于系統(tǒng)生物學(xué)研究結(jié)果的前瞻性、多中心、大樣本的臨床驗(yàn)證試驗(yàn)有待進(jìn)一步實(shí)施。

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