美國白蛾核型多角體病毒的研究進(jìn)展

吳立華，靳 亮，王金昌，王洪秀

(1.天津市薊縣林業(yè)局，天津301900;2.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌330029; 3.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，江西 南昌330200)

0 引言

美國白蛾(Hyphantria cunea(Drury))屬鱗翅目(Lepidoptera)燈蛾科(Arctiidae)，是一種重要的國際性檢疫害蟲。原產(chǎn)于北美，分布范圍在19°～55°N。隨著人類活動、現(xiàn)代化交通運(yùn)輸工具的發(fā)展，逐漸向世界各地傳播。自1979年在我國遼寧省的丹東首次發(fā)現(xiàn)以來，美國白蛾強(qiáng)大的繁殖力和適生性，在全國呈蔓延態(tài)勢;已有50多種林木、果樹及農(nóng)作物受害，嚴(yán)重時有的樹木葉子全被吃光，全株枯死，大片林木被毀，給疫區(qū)的經(jīng)濟(jì)、環(huán)境造成了巨大損失和壓力［1］。

國內(nèi)外的許多專家學(xué)者，結(jié)合美國白蛾疫區(qū)的實踐經(jīng)驗提出了防治美國白蛾的方法。目前除采用人工采蛹、人工捕蛾、人工網(wǎng)捕及誘殺等人工物理方法以及使用仿生制劑等化學(xué)方法降低蟲口密度外，較為注重和推崇的是生物防治方法。生物防治方法主要有天敵防治［2］、細(xì)菌和病毒防治(蘇云金芽孢桿菌(Bt)制劑和美國白蛾核型多角體病毒)［3］以及性信息激素防治［4］。其中楊忠岐［5］等從原產(chǎn)地引進(jìn)天敵的模式，在國內(nèi)篩選出寄生率高達(dá)83.2%的天敵周氏嚙小蜂(Chouioia cunea Yang)，在疫區(qū)對美國白蛾的自然控制起了關(guān)鍵性的作用，對美國白蛾天敵的研究取得了突破性的進(jìn)展。同時已開展利用其進(jìn)行美國白蛾生物防治，現(xiàn)在室內(nèi)繁殖的技術(shù)已很成功，并且取得了較好的防治效果［6～11］。

隨著美國白蛾生物防治技術(shù)的建立，作為生物殺蟲劑的美國白蛾核型多角體病毒蟲體繁殖技術(shù)也臻于成熟，其作為有效的生物防治手段在各地取得了良好的防治效果［12］，但是對于HcNPV的生物學(xué)特性及對寄主的致病性及機(jī)理等的基礎(chǔ)應(yīng)用研究，報道的尚少，還有待于進(jìn)一步研究。本文從侵染特點、致病性、流行病學(xué)、基因組特點及應(yīng)用前景等方面綜述了美國白蛾核型多角體病毒的研究進(jìn)展。

1 美國白蛾核型多角體病毒的侵染特點

1.1 感染HcNPV的美國白蛾幼蟲的外部癥狀

美國白蛾幼蟲感染美國白蛾核型多角體病毒后，其表現(xiàn)的癥狀與一般鱗翅目幼蟲感染核型多角體病毒的癥狀相似［1］。初期不表現(xiàn)明顯的外部特征。以1.6×106PIB/mL濃度的HcNPV病毒液接毒4齡美國白蛾幼蟲，感病3－4 d后出現(xiàn)病癥，此時幼蟲食欲減退，生長緩慢，發(fā)病后幼蟲體色逐漸變成淺粉色，行動異常，取食量減少，后期蟲體腫脹，體表具光澤，反應(yīng)呆滯，死亡后，表皮極薄稍觸即破，最后蟲體液化，呈淺褐色膿液。

1.2 感染HcNPV的美國白蛾幼蟲的組織病變過程

取食病毒的幼蟲，6－72 h中腸、脂肪體、真皮、氣管未見明顯病變;96 h中腸、脂肪體、氣管個別細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)腫脹;120－144 h各組織細(xì)胞核的病變漸漸加重，但中腸病部分細(xì)胞腫脹，病變較輕，真皮未見明顯病變，至后期，也出現(xiàn)中腸細(xì)胞破碎解體［1］?？傊?，經(jīng)病毒處理的幼蟲，脂肪體儲量明顯減少，周緣層脂肪體及肌肉與體壁分離;脂肪體裂解成碎片，體壁內(nèi)表皮、外表皮結(jié)構(gòu)變得松弛，內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)異常，厚度不均勻且表皮細(xì)胞明顯增厚，正常表皮細(xì)胞為單層細(xì)胞，而感病試蟲增為2～4層，且排列凌亂。精巢未發(fā)現(xiàn)病變。

2 美國白蛾核型多角體病毒的致病性研究

有關(guān)HcNPV的致病性研究，主要集中在對寄主的毒力、傳播和交叉感染等基礎(chǔ)應(yīng)用方面。

2.1 HcNPV對寄主的毒力研究

1979年，Im［13］等在韓國首次發(fā)現(xiàn)了美國白蛾核型多角體病毒(HcNPV)，毒力測定表明，對2齡、5齡幼蟲的LD50分別為8.377×104PIB/mL，4.974×105PIB/mL;在106PIB/ml濃度下，2齡、3齡、4齡、5齡的LT50分別為9.6 d、11.5 d、12 d、17 d，在野外條件下，用6.4×107PIB/mL的病毒感染，3齡時LT50為4.8 d，5齡時為14.2 d，而且第1代幼蟲比第2代幼蟲更為敏感?？梢?，隨著齡期的增加，LD50增大，LT50延長。而同年，Boucias在室內(nèi)對美國白蛾質(zhì)型多角體病毒(Hc-CPV)進(jìn)行了研究，其結(jié)果表明，致死時間與幼蟲齡期和病毒的劑量有關(guān)，美國白蛾幼蟲的死亡率隨病毒劑量的增加而增高［14］。1995年對美國白蛾核型多角體病毒作了致病力測定，發(fā)現(xiàn)2、3齡幼蟲的死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于4齡幼蟲，在1.5×101～1.5×109PIB/mL喂幼蟲，死亡率在90%以上。對美國白蛾核型多角體病毒、斜紋夜蛾核型多角體病毒和從美國白蛾幼蟲上分離出的2種顆粒體病毒感染美國白蛾幼蟲，在105PIB/mL的劑量下，HcNPV和AcaNPV病毒的死亡率分別是62.5%～100%，70% ～80.5%;顆粒體病毒在5×109PIB/mL劑量下，致病死亡88.1% ～90.0%［15］。

吳戈宇［16］等研究美國白蛾核型多角體病毒(HcNPV)毒力發(fā)現(xiàn)，感染美國白蛾2齡幼蟲，LC50=1.26×105PIB/mL，感染3齡幼蟲LC50= 4.08×105PIB/mL，感染4齡幼蟲LC50=5.34× 105PIB/mL。以3×106PIB/mL HcNPV懸液感染美國白蛾2齡幼蟲LT50為7.625 d;3齡幼蟲LT50為8.625 d;4齡幼蟲LT50為9.875 d。以1 ×106PIB/mL HcNPV懸液感染美國白蛾2齡幼蟲LT50為9.625 d;3齡幼蟲LT50為9.625 d;4齡幼蟲LT50為10.625 d。不同齡期幼蟲對病毒的敏感性存在一定差異，低齡幼蟲較敏感。致死時間隨病毒感染濃度增加而減少，同一濃度感染不同蟲齡幼蟲，病毒感染潛伏期，隨蟲齡增加而延長。

2.2 HcNPV對寄主的傳播和交叉感染研究

1966年在東京大學(xué)的林業(yè)實驗站發(fā)生美國白蛾核型多角體病毒流行病。Hukuhara＆Namura等隨后研究了HcNPV在土壤中的分布［17］。發(fā)現(xiàn)在美國白蛾喜食樹種附近一定深度的土壤中有HcNPV的存在，而在非喜食樹種附近以及道路的土壤內(nèi)，沒有HcNPV的存在，說明土壤中該病毒來源于蟲尸。即由宿主危害的樹木上掉下來的蟲尸中逸散而出于土壤中。另有研究發(fā)現(xiàn)，風(fēng)力可以將HcNPV傳播到30 m以外的地方。1977年肯塔基大學(xué)的Bouclas＆Nordin研究了不同齡期的美國白蛾幼蟲對核型多角體病毒NPV和顆粒體病毒GV的敏感性，發(fā)現(xiàn)低齡幼蟲比老齡幼蟲對2種病毒的敏感性差異很大，2齡幼蟲的LD50值，后者比前者高100倍，5齡則高1 000倍［18］。1982年，Kunim用病毒糊、病毒懸液、病毒粉與凡士林的混合物處理未產(chǎn)卵的白蛾成蟲。用病毒糊處理的雌蛾產(chǎn)卵后，幼蟲可以被NPV感染致病;而用病毒懸液、病毒粉與凡士林的混合物處理后，幼蟲不感染病毒，而對雌蛾交尾、產(chǎn)卵行為無影響，但是，卵的孵化率下降［19］。Tomita＆Iwashita在1982年用HcNPV對其它鱗翅目幼蟲作了交叉感染試驗，發(fā)現(xiàn)紅腹燈蛾(Spilosoma subcarnea)對它的敏感性與美國白蛾接近，但它對桑絹野螟(Diaphania pyloalis)、家蠶(Bomyx mori)、分月扇舟蛾(Clostera anastomosis tristis)、桑毛蟲(Euproctis silimis)、黃斜帶毒蛾(Numenea disparills albofascia)、茶黃毒蛾(Euproctis Psendoconspersa)無致病力［20］。

段彥麗［21］等研究發(fā)現(xiàn)用不同濃度的美國白蛾核型多角體病毒亞致死劑量感染美國白蛾4齡和5齡幼蟲，并分別收集不同處理的殘余帶毒試蟲進(jìn)行室內(nèi)傳代飼養(yǎng)。結(jié)果表明:病毒對寄主昆蟲不僅具有直接致死作用，而且對蛹重和雌蟲產(chǎn)卵量均有明顯影響，尤其是對親代、子一代和子二代寄主昆蟲。對病毒傳播途徑的研究證實Hc-NPV可通過多種途徑傳播到寄主種群中。

不同細(xì)胞系對美國白蛾NPV的受納性是不同的。1987年，Lee H H在斜紋夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞TNM-FH-T內(nèi)成功復(fù)制出美國白蛾核型多角體病毒［22］。并在1988年對其做了溫度敏感性試驗，在32℃的條件下，12個突變種基本上都不能形成多角體。

2.3 HcNPV制劑對美國白蛾防治研究

我國也對應(yīng)用病毒制劑防治美國白蛾進(jìn)行了研究:劉岱岳［23］等在1985年在陜西省用美國白蛾核型多角體病毒制劑107PIB/mL進(jìn)行飛機(jī)常量低空噴霧防治美國白蛾。噴霧10 d以后調(diào)查，地面定點調(diào)查防治效果73.4%，樹梢定點調(diào)查防治效果為84.6%。趙海燕［24］等在2010年在青島城陽區(qū)開展了美國白蛾核型多角體病毒的林間防效試驗;藥后14 d，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)害蟲生物防治技術(shù)研究所提供HcNPV病毒液濃度分別為5×106PIB/mL、3.3×106PIB/mL和2.5×106PIB/mL，其校正防效分別為90.41%、87.67%、90.41%。

另外，HcNPV與其它細(xì)菌或者熒光染料復(fù)配后，殺蟲效果明顯提高。段彥麗［25］等發(fā)現(xiàn)與美國白蛾核多角體病毒單獨使用相比，HcNPV與Bt合劑使LT50縮短0.5－2.1 d，縮短了美國白蛾幼蟲死亡時間，加快美國白蛾核多角體病毒致死速度。楊唯一［26］等研究了3種熒光增白劑對Hc-NPV的增效作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.5%的VBL(熒光增白劑)和1%的BA(熒光增白劑)對HcNPV的增效作用明顯，可作為HcNPV的增效劑加入到制劑中。

3 美國白蛾核型多角體病毒的分子生物學(xué)研究

近幾十年來病毒分子生物學(xué)得到了蓬勃的發(fā)展，昆蟲病毒的研究也不例外，但是HcNPV的分子生物學(xué)研究與其它NPV相比才剛剛起步，但也積累了一些研究成果。1998年，應(yīng)用基因工程技術(shù)，將蘇云金桿菌庫爾斯塔克亞種的HD-1菌株中的殺蟲蛋白基因(ICP)，導(dǎo)入到美國白蛾核型多角體病毒中，制成了復(fù)合病毒制劑，命名為ICP-HcNPV殺蟲劑。試驗證明，Bt的殺蟲基因通過復(fù)合病毒在昆蟲細(xì)胞中以毒素蛋白的23形式表達(dá)出來，表現(xiàn)出很高的殺蟲活性［22］。Hyung-Hoan Lee［27］等用BamHI和SmaI 2種限制性外切酶對HcNPV基因組作酶切分析，繪制了HcNPV基因組物理圖。翌年用質(zhì)粒載體 pUC8和pBR322克隆了部分基因組EcoRI酶切片段［28］。同年克隆和定位了多角體蛋白基因 Polyhedrin［29］。

貢成良［30］等研究報道美國白蛾(Hy-phantria cunea)核型多角體病毒(HcNPV)CP基因的核苷酸序列及蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)特征;翌年測定了美國白蛾核型多角體病毒幾丁質(zhì)酶基因核苷酸序列［31］;2000年通過對HcNPV半胱氨酸蛋白酶、幾丁質(zhì)酶基因失活分析研究提示:CP、ChiA兩基因為病毒復(fù)制非必需基因，它們的失活不影響病毒的復(fù)制與多角體的形成，但感染細(xì)胞的存活時間比HcNPV、HcNPVPTTH+感染的多2 d。推測CP、ChiA兩基因失活后，可延長細(xì)胞持續(xù)表達(dá)外源基因的時間［32］。曹廣力等進(jìn)行了超氧化物歧化酶基因SOD和抑制細(xì)胞凋亡基因p35的克隆和序列分析［33，34］。

近年來，Ikda［35］等研究了美國白蛾核型多角體病毒的iap基因發(fā)現(xiàn):在HcNPV感染SpIm細(xì)胞的過程中，Hycu-IAP3對于阻止細(xì)胞凋亡來說是必要的。2006年，Ikda［36］等完成美國白蛾全基因組序列測定，基因組DNA結(jié)構(gòu)如圖1所示。HcNPV基因組序列全長132959 bp，G+C含量45.1%，有148個開放閱讀框(ORFs)，編碼50多種多肽。基于系統(tǒng)學(xué)上的親緣關(guān)系以及擁有g(shù)roup I NPVs中的特有基因如 gp64、ie-2、ptp-1等，推斷 HcNPV屬于 group I NPVs，并且與 Cf MNPV或Op MNPV非常相似。另外，美國白蛾核型多角體病毒基因組擁有6個獨特ORFs，他們分別是 ORF 71、ORF 41、ORF 99、ORF 100、ORF 121、ORF 148。這6個ORFs在核苷酸序列基因庫中沒有找到任何可識別的同源性序列。這些序列的功能雖然還不清楚，但是可以作為美國白蛾核型多角體病毒的特異性檢測序列，應(yīng)用到美國白蛾NPV的流行病毒學(xué)研究。Shirata［37］等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)家蠶核型多角體病毒(BmNPV)和Hc-NPV共同感染家蠶細(xì)胞時，HcNPV的ep32編碼的蛋白誘導(dǎo)家蠶細(xì)胞的球形蛋白合成量下降，限制了家蠶核型多角體病毒擴(kuò)增。這一研究結(jié)果為理解細(xì)胞對可感染病毒的抗性機(jī)制提供了一種模式。

圖1 HycuMNPV基因組DNA結(jié)構(gòu)和限制性內(nèi)切酶XhoⅠ的物理圖譜(摘自Motoko Ikeda et al.，2006)

4 美國白蛾核型多角體病毒殺蟲劑的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展

HcNPV作為一種重要的病原微生物和生物殺蟲劑，不僅具有專一性強(qiáng)、對環(huán)境和人畜安全、不殺傷天敵等優(yōu)點，而且在其應(yīng)用后能在自然界中長期存在，從而引起病毒流行病的大發(fā)生，可在較長時間內(nèi)自然控制害蟲種群密度的增長，在害蟲的持續(xù)控制研究中發(fā)揮著重要的作用。HcNPV對防治美國白蛾幼蟲具有上述優(yōu)點，可有效降低化學(xué)藥劑對環(huán)境的污染，可以大面積應(yīng)用［5～7］。

但病毒作為殺蟲劑在應(yīng)用之前，首先要解決大量增殖問題。目前，采用活蟲體進(jìn)行增殖依然是獲得大量病毒的主要途徑［38］，蟲齡和接種濃度(劑量)是影響病毒大量增殖的主要因素［39，40］。鄭桂玲［41］等對美國白蛾齡期接種劑量及其組合對該HcNPV產(chǎn)量的影響幼蟲進(jìn)行了研究，篩選出適合大量增殖的最佳條件為:在室內(nèi)大量增殖HcNPV時，以1.48×106OBs/頭的劑量飼喂5齡和6齡幼蟲均可以獲得最高的病毒產(chǎn)量，百頭幼蟲的病毒總產(chǎn)量可達(dá)到1.55×1011OBs和1.50 ×1011OBs，而單頭幼蟲的病毒產(chǎn)量最高可達(dá)2.319 ×109OBs，這為該病毒的大量增殖和病毒殺蟲劑的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。中國林業(yè)科學(xué)研究院應(yīng)用微生物研究室在美國白蛾幼蟲的人工大量飼養(yǎng)、病毒的工廠化生產(chǎn)以及病毒的田間應(yīng)用技術(shù)方面已獲得成功經(jīng)驗。

綜上所述，從侵染特點、致病性、流行病學(xué)、基因組特點及應(yīng)用前景等方面綜述了美國白蛾核型多角體病毒的研究進(jìn)展。隨著HcNPV全基因組序列測序的完成，相關(guān)的分子生物學(xué)的研究將會蓬勃向前推進(jìn)。另外，隨著美國白蛾幼蟲的規(guī)?；曫B(yǎng)技術(shù)(包括種蟲車間、健康幼蟲飼養(yǎng)車間、病毒感染增殖車間、制劑加工車間的設(shè)計和智能化;優(yōu)化幼蟲感染技術(shù)，穩(wěn)定單位病毒產(chǎn)量病毒技術(shù))的成熟，HcNPV殺蟲劑蟲將從實驗室走向大田，這將對科研成果的推廣起到良好的促進(jìn)作用。

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