肝郁脾虛證與饑餓素通路關(guān)系的探討*

北京中醫(yī)藥大學(xué) 李 靜 劉玥蕓 趙宏波 陳家旭 (北京100029)

隨著社會壓力的增大，肝郁的人群越來越多，除了有心情煩躁郁悶、胸脅滿悶不舒之外，日久還會伴有大便稀溏、食欲下降、體質(zhì)量減輕等脾虛的癥狀，這就形成了肝郁脾虛證。課題組前期實(shí)驗，觀察了束縛應(yīng)激致肝郁脾虛證大鼠的海馬、杏仁核相關(guān)指標(biāo)的變化，揭示了肝郁的部分生物學(xué)基礎(chǔ);關(guān)于脾虛的生物學(xué)基礎(chǔ)，則從下丘腦弓狀核的食欲調(diào)節(jié)因子入手逐步展開，課題組曾觀察到肝郁脾虛動物模型下丘腦ARC 中ob－R 蛋白與基因表達(dá)明顯上升而NPY mRNA 表達(dá)變化并不明顯。［1］

1 肝郁脾虛證

肝郁脾虛證主要以胸脅脹滿竄痛，善太息，納呆，便溏為主要表現(xiàn)。肝主疏泄，其涵義的一個重要方面是促進(jìn)脾胃的運(yùn)化。肝主疏泄，調(diào)暢全身氣機(jī)，其中自然包括中焦脾胃的氣機(jī)。所以肝的疏泄功能正常與否，關(guān)系到脾胃消化功能的正常與否。肝失疏泄，肝氣郁滯，則脾胃氣機(jī)升降失常，消化功能受到影響，形成肝郁脾虛證。

大量的臨床發(fā)現(xiàn)，肝郁的病人后期出現(xiàn)大便稀溏，食欲降低，體質(zhì)量減輕;眾多的實(shí)驗表明，束縛應(yīng)激導(dǎo)致的肝郁脾虛證大鼠模型，造模前期出現(xiàn)煩躁不安，后期出現(xiàn)毛發(fā)枯黃、攝食減少、體質(zhì)量減輕的脾虛癥狀。

2 饑餓素通路

2.1 下丘腦弓狀核 下丘腦是一個調(diào)節(jié)肌體多個生理過程的中樞，包括體溫調(diào)節(jié)、營養(yǎng)攝取、水平衡、內(nèi)分泌及情緒等生理過程。［2］其中攝食和能量消耗是一個重要方面。下丘腦的神經(jīng)核團(tuán)一直被認(rèn)為是調(diào)控能量平衡的關(guān)鍵部位，包括ARC(弓狀核)、PVN (室旁核)、DMH (背內(nèi)側(cè)核)、VMH(腹內(nèi)側(cè)核)、PFA (穹窿周圍)、LHA (外側(cè)核)。其中弓狀核ARC 為一級神經(jīng)元，外周的食欲信號首先匯聚于這里，經(jīng)過整合加工后，通過神經(jīng)末梢傳至下丘腦其他5 個神經(jīng)核團(tuán)，被稱為二級神經(jīng)元。二級神經(jīng)元再經(jīng)過整合加工，傳給腦干的低位中樞—孤束核，最終決定進(jìn)食的繼續(xù)或終止。

下丘腦弓狀核(ARC)位于下丘腦的基底部，在食欲調(diào)節(jié)和能量平衡中起重要作用。ARC 內(nèi)有兩組神經(jīng)元:［3］一組通過表達(dá)NPY 和AgRP 促進(jìn)攝食，另一組通過表達(dá)POMC 和CART 抑制攝食。外周分泌的饑餓素、瘦素、胰島素等能到達(dá)ARC，作用于這兩類食欲因子從而發(fā)揮作用。饑餓素與其受體GHSR 結(jié)合，上調(diào)NPY、AgRP，下調(diào)α－MSH(POMC 產(chǎn)生)、CART。

2.2 相關(guān)食欲因子

2.2.1 Ghrelin:譯為饑餓素，1999年日本學(xué)者Kojima 等［4］首先在大鼠胃中發(fā)現(xiàn)，是第一個被確認(rèn)的能促進(jìn)攝食的胃激素，也是唯一可以在外周刺激食欲的激素。它由28 個氨基酸組成，其中第三位絲氨酸的N－辛?；瞧浠钚缘谋匾揎?。［5］最主要的分泌部位是胃底，［6－7］此外在下丘腦弓狀核、垂體、腦干都有分泌。［8－9］饑餓素在胃底合成后，跟隨血液穿過血腦屏障，特異性地結(jié)合下丘腦弓狀核上的饑餓素受體GHSR，從而激活饑餓素通路來促進(jìn)攝食，因而它被認(rèn)為是飯前饑餓及啟動進(jìn)食的信號。

實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，腦室或外周注射Ghrelin 可增加大鼠攝食，表明外源性的Ghrelin 有增加攝食的作用;人體的內(nèi)源性Ghrelin 在空腹時升高，飯后迅速下降，說明人在空腹時的饑餓感，除了物理因素胃的排空加快之外，還可能是因為體內(nèi)的Ghrelin 濃度升高，促食欲因子NPY、AgRP 發(fā)揮正向的化學(xué)效應(yīng)所致;人在飯后產(chǎn)生的飽餐感，除了物理因素食物的占位外，還可能是因為體內(nèi)的Ghrelin 濃度降低，促食欲因子NPY、AgRP 的作用被抑制，抑食欲因子α－MSH、CART 發(fā)揮抑制食欲的作用所致。Theander－Carrillo 等［10］發(fā)現(xiàn)，在白色脂肪組織，Ghrelin 可促進(jìn)葡萄糖和三酰甘油的攝取，增加脂肪形成，抑制脂肪分解;在褐色脂肪組織，Ghrelin可減少解耦聯(lián)蛋白的表達(dá)，從而減少能量消耗。

筆者的實(shí)驗結(jié)果初步證實(shí)，ELISA 法檢測的慢性束縛應(yīng)激肝郁脾虛證大鼠血漿Ghrelin 水平，模型組顯著低于正常組，說明肝郁脾虛證大鼠脾虛生物學(xué)基礎(chǔ)可能是因為Ghrelin 濃度低，促食欲因子NPY、AgRP 的作用被抑制，抑食欲因子α－MSH、CART 發(fā)揮抑制食欲的作用導(dǎo)致食欲不振、體質(zhì)量減輕。

2.2.2 GHSR:全名是growth hormone secretogogue receptor，譯為生長激素促泌素受體，可以與生長激素促泌素結(jié)合發(fā)揮促進(jìn)生長發(fā)育的作用;另一個名字叫饑餓素受體，可以與饑餓素結(jié)合，加快胃的排空，使人產(chǎn)生饑餓感，從而促進(jìn)食欲。它是α 螺旋7 次跨越的G 蛋白偶聯(lián)受體，分1a 和1b 兩種亞型。1a 有366 個氨基酸，7 個跨膜域，是GHSR 的完整功能形式，Ghrelin 的大多數(shù)生理作用是通過GHSR－1a 介導(dǎo)的，［11］包括促進(jìn)生長發(fā)育和促進(jìn)食欲的作用。GHSR－1a 主要分布于下丘腦弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、漏斗核，海馬區(qū)及腺垂體。GHSR－1b 因缺少第6 和第7 個跨膜鏈，無法與Ghrelin結(jié)合，不具備信號傳遞能力，確切功能尚待進(jìn)一步研究。GHSR－1b 在所有組織中都有表達(dá)。

2.2.3 NPY:全名nervepeptide Y，譯為神經(jīng)肽Y。由36 個氨基酸組成，是1982年Tatemoto 等［12］從豬腦中發(fā)現(xiàn)的生物活性多肽，是神經(jīng)系統(tǒng)中分布最廣、濃度最高的肽類。NPY 廣泛分布于中樞系統(tǒng)和外周器官，如Allen 等用放免、組化技術(shù)研究鼠腦內(nèi)NPY 免疫活性，其濃度從前腦至腦干逐漸減低。陳家旭等［13］實(shí)驗也證實(shí)，NPY 免疫陽性神經(jīng)纖維主要分布于丘腦、下丘腦等腦區(qū)核團(tuán)。NPY 在下丘腦的濃度很高，主要分布于下丘腦弓狀核(ARC)神經(jīng)元，少部分分布于室旁核(PVN)、背中核(DMN)等區(qū)域。另外，NPY 免疫陽性神經(jīng)纖維存在于很多種屬腦血管中也得到證實(shí)。［14］

研究顯示，外源性NPY 注射到大鼠下丘腦特定核團(tuán)后，可使其食欲亢進(jìn)、攝入增加、產(chǎn)熱減少、脂肪酸合成、血脂升高、引起脂肪貯積和肥胖。［15］關(guān)于其增加攝食的機(jī)制，目前主要有兩種說法:

(1)直接型:NPY 通過與其受體相互作用，在攝食、體溫、血壓、情緒、生殖能力等方面發(fā)揮生理調(diào)節(jié)功能。NPY 受體包含了亞型Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8。其中Y1、Y2 和Y5是NPY 調(diào)節(jié)動物攝食行為的關(guān)鍵受體。Y1 受體是引起攝食效應(yīng)的關(guān)鍵，實(shí)驗發(fā)現(xiàn)Y1 受體抑制劑的注射對攝食有抑制作用。NPY 可產(chǎn)生于內(nèi)臟脂肪組織，并通過Y1 受體促進(jìn)脂肪細(xì)胞前體的增殖，［16］從而增加能量儲蓄。NPY 可通過刺激Y2 受體的釋放，促進(jìn)脂肪組織的生成與生長，從而引起脂肪細(xì)胞的堆積、體質(zhì)量增加以及代謝問題等。［17］Y5 受體在大鼠的胃中表達(dá)，郭錫熔等人通過注射NPY Y5 受體反義寡核苷酸發(fā)現(xiàn)其可特異地阻斷NPY 作用，并且可顯著影響大鼠C 肽水平、血清胰島素以及脂肪組織TNF 基因mRNA 的表達(dá)，進(jìn)而抑制大鼠攝食、減輕體質(zhì)量、減少肥胖癥的發(fā)生，甚至改善大鼠體內(nèi)的高胰島素血癥。［18］

(2)間接型:研究發(fā)現(xiàn)NPY 神經(jīng)纖維，通過釋放AgRP，可以間接性地增強(qiáng)促進(jìn)食欲的作用。［19］AgRP，譯為刺鼠基因相關(guān)蛋白。人和嚙齒動物的AgRP 分別由132 和131 個氨基酸組成，C 端含有特征性的Cys 結(jié)構(gòu)域。［20］人和鼠的AgRP 基因主要在下丘腦和腎上腺中高表達(dá)。AgRP 可競爭性結(jié)合MC4R，拮抗α－MSH 介導(dǎo)的G 蛋白活化，降低細(xì)胞內(nèi)cAMP 含量，從而起到增強(qiáng)食欲的作用。［20］

2.2.4 α－MSH:全名a－melanocyte stimulating hormone，譯為a－黑素細(xì)胞刺激素，是由13 個氨基酸殘基組成的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)肽。來源于阿黑皮素原(POMC)，POMC 是一種肽激素前體，存在于垂體、腦及外周，經(jīng)翻譯加工后可產(chǎn)生一系列有生物學(xué)活性而又功能各異的激素，稱黑皮質(zhì)激素。黑皮質(zhì)激素家族包括a－、β－、γ－黑素細(xì)胞刺激素、β 促脂解素，β 內(nèi)啡肽。目前已發(fā)現(xiàn)五種黑皮質(zhì)激素的受體亞型(MC1R～MC5R)，均為G 蛋白偶聯(lián)受體，對黑皮質(zhì)激素家族成員有不同的親和力。

a－MSH 在下丘腦弓狀核濃度最高，與不同的受體結(jié)合后，在色素沉著、退熱、抗炎、抑制攝食、神經(jīng)營養(yǎng)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、免疫調(diào)節(jié)等方面起重要作用。其中，抑制食欲作用主要結(jié)合的是MC4R。［19］Vergoni［11］等腦室微量注射a－MSH 可明顯減少動物的進(jìn)食量;研究發(fā)現(xiàn)破壞下丘腦MC4R通路可導(dǎo)致人及嚙齒類動物的肥胖;在意大利南部，對極度肥胖的個體研究發(fā)現(xiàn)，［21］其MC4R 基因變異。這些現(xiàn)象表明，a－MSH 是通過與受體MC4R 結(jié)合，發(fā)揮抑制食欲作用的。a－MSH 結(jié)合MC4R 可抑制食欲，減慢體質(zhì)量的增長，而AgRP結(jié)合MC4R 則促進(jìn)食欲，加快體質(zhì)量的增長。由此可見，AgRP 與a－MSH 是競爭性結(jié)合MC4R 受體的關(guān)系。

2.3 食欲調(diào)節(jié)機(jī)制

饑餓素在胃底分泌后，血液中饑餓素濃度升高，饑餓素穿過血腦屏障，與下丘腦弓狀核上的GHSR 特異性結(jié)合，激活饑餓素通路從而促進(jìn)食欲。但是人體在不同的狀態(tài)，體內(nèi)饑餓素的濃度是不同的。

當(dāng)人體處于饑餓狀態(tài)時，胃底分泌的饑餓素Ghrelin 增多，穿過血腦屏障，與弓狀核上的GHSR結(jié)合，上調(diào)NPY 促食欲通路:NPY 一方面通過結(jié)合自身受體Y1、Y2，另一方面通過分泌AgRP，結(jié)合其受體MC4R，發(fā)揮促進(jìn)食欲的作用。另外，這種狀態(tài)下的NPY 神經(jīng)元內(nèi)γ－氨基丁酸(簡稱GABA)分泌增多，結(jié)合其受體GABAR，興奮采食中樞，亦能增加攝食。NPY 或AgRP 的單獨(dú)缺失對饑餓素促進(jìn)食欲的作用影響很小，但如果同時缺失就完全消除了饑餓素促進(jìn)食欲的作用，表明饑餓素在發(fā)揮食欲調(diào)節(jié)作用時，NPY 和AGRP 是必需的。

當(dāng)肌體處于飽餐狀態(tài)時，瘦素Leptin 分泌增多，上調(diào)POMC 抑食欲通路:POMC 衍化為α－MSH，結(jié)合其受體MC4R，發(fā)揮抑制食欲的作用。由此可見，MC4R 既是促食欲因子AgRP 的受體，又是抑食欲因子α－MSH 的受體，AgRP 與α－MSH 是競爭性抑制的關(guān)系。二者哪一個濃度高，哪一個就會占據(jù)競爭性的優(yōu)勢，從而更多地奪取MC4R，來發(fā)揮它的主導(dǎo)作用。

3 肝郁脾虛證與饑餓素通路的關(guān)系

本課題組動物實(shí)驗研究結(jié)果表明:從基因水平采用RT q－PCR 法測得的肝郁脾虛證大鼠下丘腦弓狀核的GHSR 與NPY 濃度均下降，a－MSH 濃度則上升;從蛋白水平運(yùn)用Western Blot 法測得的肝郁脾虛證大鼠下丘腦弓狀核的GHSR 與NPY 濃度均下降，a－MSH 濃度則上升。血漿ELISA 法檢測的肝郁脾虛證模型大鼠下丘腦弓狀核Ghrelin 濃度降低。分析此結(jié)果的原因，是由于肝郁脾虛證大鼠因血中Ghrelin 濃度降低，穿過血腦屏障，到達(dá)下丘腦弓狀核特異結(jié)合的GHSR 濃度也降低，促食欲通路被抑制;a－MSH 濃度升高，抑食欲通路被激活;故肝郁脾虛證大鼠食欲降低，體質(zhì)量下降。基因?qū)用媾c蛋白層面檢測結(jié)果的一致性，使得結(jié)論更加具有說服力。這也從一個側(cè)面說明了肝郁脾虛證脾虛的部分生物學(xué)基礎(chǔ)可能與下丘腦弓狀核饑餓素通路中相關(guān)指標(biāo)的變化有關(guān)聯(lián)。

［1］S.X.Wang，J.X.Chen，G.X.Yue，et al.Xiaoyaosan decoction regulates changes in neuropeptide Y and leptin receptor in the rat arcuate nucleus after chronic immobilization stress ［J］.Evidence－Based Complementary and Alternative Medicine，2012(2012):1－16

［2］萬選才，楊天祝，徐承燾.現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)［M］.北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1991.432 –440

［3］Cone RD，Cowley MA，Butler AA，et al.The arcuate nucleus as a conduit for diverse signals relevant to energy homeostasis ［J］.International journal of obesity and related metabolic disorders，2001，25 Suppl 5:S63－7

［4］Kojima M，Hosoda H，Date Y，et al.Ghrelin is a growth－h(huán)ormone－releasing acylated peptide from stomach ［J］.Nature，1999，402 (6762):656－660

［5］Hosoda H，Kojima M，Matsuo H，et al.Ghrelin and des－acyl ghrelin:Two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue ［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2000，279 (3):900－913

［6］Mori K，Yoshimoto A，Takaya K，et al.Kidney produces a novel acylated peptide，ghrelin ［J］.FEBS Letters，2000，486 (3):213－216

［7］Date Y，Kojima M，Hosoda H，et al.Ghrelin，a novel growth hormone－releasing acylated peptide，is synthesized in a distinct endocrine cell type in the gastrointestinal tracts of rats and humans［J］.Endocrinology，2000，141 (11):4 255－4 261

［8］Cowley MA，Smith RG，Diano S，et al.The distribution and mechanism of action of ghrelin in the CNS demonstrates a novel hypothalamic circuit regulating energy homeostasis ［J］.Neuron，2003，37 (4):649－661

［9］Korbonits M，Bustin SA，Kojima M，et al.The expression of the growth hormone secretagogue receptor ligand ghrelin in normal and abnormal human pituitary and other neuroendocrine tumors ［J］.The journal of clinical endocrinology ＆ metabolism，2001，86(2):881－887

［10］Theander－Carrillo C，Wiedmer P，Rose PC，et al.Ghrelin action in the brain controls adipocyte metabolism ［J］.The journal of clinical investigation，2006，116 (7):1 983－1 993

［11］Smith RG.Development of growth hormone secretagogues ［J］.Endocrine reviews，2005，26 (3):346－360

［12］Tatemoto K，Carlquist M，Mutt V.Neuropeptide Y－a novel brain peptide with structural similarities to peptide and pancreatic polypeptide ［J］.Nature，1982，296:659

［13］陳家旭，楊維益，梁嶸，等.長期大強(qiáng)度運(yùn)動對大鼠腦組織神經(jīng)肽Y、亮氨酸腦啡肽、強(qiáng)啡肽A1－13動態(tài)變化的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志.1999，15 (4):306－309

［14］Allen JM，Schon F，Todd N et al.Presence of neuropeptide Y in human circle of Willis and its possible role in cerebral vasospasm ［J］.The Lancet，1984，324 (8402):550－552

［15］DA Daver.Dysfunctinal uterine bleeding in CR whitfield Dewhwrst＇s textbook of obstetrics and gynaecology for postgraduates fitted London ［J］.Blackwell Scientific Publications，1986，6:24－30

［16］晏曉青.神經(jīng)肽Y 調(diào)節(jié)應(yīng)激誘導(dǎo)的肥胖［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2007，87 (41):2 945

［17］Lavebratt C，Alpman A，Persson B，et al.Common neuropeptide Y2 receptor gene variant is protective against obesity among Swedish men ［J］.International journal of obesity，2006，30(3):453－459

［18］Balasubramaniam A，Joshi R，Su C，et al.Neuropeptide Y(NPY)Y2 receptor－selective agonist inhibits food intake and promotes fat metabolism in mice:combined anorectic effects of Y2 and Y4 receptor－selective agonists ［J］.Peptides，2007，28 (2):235－240

［19］Vergoni AV，Bertolini A.Role of melanocortins in the central control of feeding ［J］.European journal of pharmacology，2000，405 (1－3):25－32

［20］Ollmann MM，Wilson BD，Yang YK，Kerns JA，Chen Y，Gantz I，et al.Antagonism of central melanocortin receptors in vitro and in vivo by agouti－related protein ［J］.Science，1997，278(5335):135－138

［21］Alfieri A，Pasanisi F，Salzano S，et al.Functional analysis of melanocortin－4－receptor mutants identified in severely obese subjects living in Southern Italy ［J］.Gene，2010，457 (1－2):35－41