K-RAS和DCC在直結(jié)腸癌中的表達及意義

熊 慧，張阿偉，范貴民，扈清云

（佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007）

直結(jié)腸癌的發(fā)生經(jīng)歷了一系列組織學(xué)變化的過程，每一個階段都伴隨著特定的遺傳變異。一般來說，直結(jié)腸腫瘤的形成需要兩個必要條件，一是存在一個適合早期突變細胞無限克隆擴增的環(huán)境，二是腫瘤相關(guān)基因的不穩(wěn)定性。KRAS基因突變的常見方式為點突變，突變位點好發(fā)于1號外顯子的第12位、第13位密碼子上，其突變型可為半胱氨酸、纈氨酸、精氨酸，突變的發(fā)生導(dǎo)致編碼的氨基酸序列發(fā)生改變，從而編碼出致癌蛋白p21，p21蛋白能夠刺激細胞生長、發(fā)育和增殖，進而誘發(fā)細胞癌變，已有研究表明p21蛋白誘發(fā)直結(jié)腸癌。DCC基因編碼的DCC蛋白主要由胞內(nèi)多肽和胞外多肽兩部分組成，胞外多肽的氨基酸順序與神經(jīng)細胞黏附因子（neural cell adhesion molecule，NCAM）極其相似，當(dāng)抑癌基因DCC缺失，不能編碼DCC蛋白之后，細胞生長及分化發(fā)生障礙，此時細胞即可發(fā)生惡變。本研究采用免疫組織化學(xué)法，我們將同步檢測68例直結(jié)腸癌中癌基因KRAS和抑癌基因DCC的表達情況，以期找到它們之間的相關(guān)性，為直結(jié)腸癌的早期無創(chuàng)或微創(chuàng)性診斷提供一定的理論依據(jù)。K-RAS和DCC表達是否與腫瘤組織分型、浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)，是否可作為判斷直結(jié)腸癌生物學(xué)行為的一個指標，從而為直結(jié)腸癌的診斷和治療提供新的生物學(xué)標記和腫瘤基因治療的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2011～2013年手術(shù)切除的直結(jié)腸癌組織標本68例，直腸癌標本中男44例，女24例，31～80歲，平均58.5歲。良性病變組織標本45例，均為明確診斷病例，組織樣本及時用10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制片厚4～5μm，進行免疫組織化學(xué)染色。

1.2 主要試劑

K-RAS、DCC兔來源多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，采用該公司SP系列免疫組化試劑盒檢測。

1.3 實驗方法

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，采用SP試劑盒法，按說明步驟處理，一抗分別為K-RAS、DCC兔來源多克隆抗體，工作濃度為1：200，滴加后4℃冰箱孵育過夜，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片。陰性對照用PBS代替一抗。

1.4 結(jié)果判定

K-RAS陽性細胞分步彌散，染色位于包膜和胞質(zhì)；DCC蛋白陽性染色主要位于細胞質(zhì)內(nèi)，以上染色均呈棕黃色細顆粒狀。判斷標準：顯微鏡鏡下（×100）5個視野中平均陽性細胞所占比例，＞10%的癌細胞胞質(zhì)中或包膜呈棕黃色，淺黃色者定為弱陽性，計入陽性［1］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 K-RAS在直結(jié)腸癌中及良性病變組織的表達

68例直結(jié)腸癌病例中，K-RAS表達陽性42例，陽性率為61.8%，其中腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及組織學(xué)類型的表達率差異不顯著，45例良性病變組織中，KRAS表達陽性14例，陽性率為31.1%。直結(jié)腸癌組與良性病變組比較差異極顯著（P＜0.01）。

2.2 DCC在良性病變組織及直結(jié)腸癌中的表達

68例直結(jié)腸癌病例中，DCC表達陽性5例，陽性率為7.4%，45例良性病變組織中，DCC表達陽性41例，陽性率為91.1%。直結(jié)腸癌病例中，不同臨床病理特征表達陽性率差異不顯著。直結(jié)腸癌組與良性病變組比較差異極顯著（P ＜0.01）。

3 討論

Ras基因在人類的第12號染色體發(fā)現(xiàn)，在5'端包含4個編碼區(qū)外顯子和1個非編碼區(qū)外顯子，能夠編碼含189個氨基酸組成的ras蛋白，其相對分子量為21×103，故命名為p21蛋白。K-RAS基因突變的常見方式為點突變，突變位點好發(fā)于1號外顯子的第12位、第13位密碼子上，其突變型可為半胱氨酸、纈氨酸、精氨酸，突變的發(fā)生導(dǎo)致編碼的氨基酸序列發(fā)生改變，從而編碼出致癌蛋白p21，p21蛋白能夠刺激細胞生長、發(fā)育和增殖，進而誘發(fā)細胞癌變［2］，K-RAS的基因突變時，鳥苷三磷酸酶（guanosine triphosphatase，GTPase）活性降低，p21蛋白GTP結(jié)合牢固，不易被GTPase水解，p21蛋白長期處于激活狀態(tài)，進而持續(xù)刺激細胞生長、發(fā)育和增殖，最終誘發(fā)大腸癌［3］。在非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）患者中發(fā)現(xiàn)RAS基因的擴增［4］，研究表明，K-RAS基因過表達明顯降低自然殺傷細胞（natural killer cell，NK細胞）對腫瘤的殺傷作用，可作為大腸癌轉(zhuǎn)移，病情惡化的特征［5］。本研究中，K-RAS在直結(jié)腸癌組織中高表達，對于直結(jié)腸癌的臨床診斷有一定的意義，因此，我們認為，如果在直結(jié)腸病變組織中檢測K-RAS蛋白，則有利于直結(jié)腸癌的早期診斷，進一步研究未發(fā)現(xiàn)其表達與直結(jié)腸癌臨床病理特征的相關(guān)性，這與已有研究報道一致［6］。

DCC基因位于18號染色體，基因全長1400kb，包含29個外顯子，能夠編碼含1447個氨基酸的跨膜蛋白，DCC基因編碼的DCC蛋白主要由胞內(nèi)多肽和胞外多肽兩部分組成，胞外多肽的氨基酸順序與神經(jīng)細胞粘附因子（neural cell adhesion molecule，NCAM）極其相似，當(dāng)抑癌基因DCC缺失，不能編碼DCC蛋白之后，細胞生長及分化發(fā)生障礙，此時細胞即可發(fā)生惡變［4］。研究表明，DCC基因失活與直結(jié)腸癌的浸潤程度及轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)［9］，本研究中，DCC蛋白在直結(jié)腸癌中缺失率為92.6%，DCC的編碼產(chǎn)物與黏附分子具有同源性，它的缺失應(yīng)該會增加腫瘤細胞的侵襲力，但我們未發(fā)現(xiàn)其表達與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)，其相關(guān)性還有待于進一步研究揭示。相應(yīng)DCC蛋白的缺失率明顯增加，我們認為這對于研究直結(jié)腸癌的演變及進展具有重要意義。盡管目前對K-RAS和DCC基因的研究有了很大的進步，但是關(guān)于K-RAS和DCC基因的失活機制、K-RAS和DCC蛋白的功能、K-RAS和DCC基因與其它基因是如何協(xié)同作用與直結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中K-RAS和DCC基因誘導(dǎo)細胞分化的機制尚未完全清楚。K-RAS基因失活的同時DCC蛋白表達缺失是否能夠用于指導(dǎo)臨床早期診斷，是否關(guān)系直結(jié)腸癌腫瘤組織病理分型、腫瘤分期仍待于進一步探究。腫瘤發(fā)生可能是癌基因突變和抑癌基因失活共同作用的結(jié)果，目前尚無報道聯(lián)合檢測K-RAS和DCC表達情況，我們發(fā)現(xiàn)在直腸癌組織中，K-RAS呈高表達，DCC則呈缺失表達，從而我們認為以上兩種因素的協(xié)同調(diào)控直結(jié)腸癌的發(fā)生，K-RAS基因突變和DCC基因表達缺失與直結(jié)腸癌的發(fā)生關(guān)系密切，能夠在分子水平判斷直結(jié)腸癌生物學(xué)行為。這為直結(jié)腸癌的診斷和治療提供新的生物學(xué)標記和腫瘤基因治療的靶點。

［1］仇容，陳增良，司馬軍，等.DCC、P53及VEGF在結(jié)直腸腺癌癌組織中的表達［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2005，8

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［5］Minamoto T，Mai M，Ronai Z.K-ras mutation：early detection in molecular diagnosis and risk assessment of colorectal，pancreas，and lung cancers-a review［J］.Cancer detection and prevention，2000，24：1-12

［6］Gonzalez-Aguilera JJ，Oliart S，Azcoita MM，et al.Simultaneous mutations in K-ras and TP53 are indicative of poor prognosis in sporadic colorectal cancer［J］.American journal of clinical oncology，2004，27：39-45