2009-2012年寧夏人群感染布魯氏菌種型分布特征

高建煒，馬學(xué)平，韓 坤，張術(shù)斌

布魯氏菌病(Brucellosis，以下簡(jiǎn)稱(chēng)布病)是由布魯氏菌屬的細(xì)菌侵入機(jī)體，引起的人獸共患變態(tài)反應(yīng)性疾病，是《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定報(bào)告的乙類(lèi)傳染病[1]。近年來(lái)我國(guó)動(dòng)物間和人間布病疫情有回升勢(shì)頭。寧夏2004-2010年共報(bào)告布病病例509例，報(bào)告發(fā)病率0.017/10萬(wàn)～3.141/10萬(wàn)[2]，2010年對(duì)布魯氏菌病重點(diǎn)人群流行病學(xué)共調(diào)查3 977人，篩檢出血清陽(yáng)性者145人，感染率3.65%，吳忠市感染率、患病率均高于其他市、縣[3]。本研究對(duì)寧夏2009-2012年間現(xiàn)癥病人血液中分離布魯氏菌，并對(duì)可疑菌株利用傳統(tǒng)方法結(jié)合分子生物學(xué)方法鑒定，發(fā)現(xiàn)了近年寧夏人群感染布魯氏菌主要種型分布。

1 材料和方法

1.1材料 布魯氏菌104M疫苗株作為對(duì)照菌株由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供，22株布魯氏菌均從寧夏鹽池縣、紅寺堡開(kāi)發(fā)區(qū)、吳忠市利通區(qū)和銀川市西夏區(qū)布魯氏菌現(xiàn)癥病人血液中分離獲得。

1.2試劑與儀器 虎紅平板凝集抗原、試管凝集抗原、布魯氏菌診斷血清、單向特異性“A”和“M”血清、布魯氏菌噬菌體“Tb”和“Wb”和“Bk2”均由中國(guó)CDC傳染病預(yù)防控制所提供，均在有效期內(nèi)使用。雙相血培養(yǎng)瓶購(gòu)自法國(guó)bioMerieux,sa；AMOS 引物由北京賽百盛生物有限公司合成；DNA提取試劑盒、PCR試劑購(gòu)自天根生化科技( 北京) 有限公司。S1000TM型基因擴(kuò)增儀、Universal HoodⅡ凝膠成像儀BIO-RAD 公司生產(chǎn)；DDY-6C 型電泳儀北京六一廠生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1樣本采集與培養(yǎng) 無(wú)菌采集布魯氏菌病急性期( 或慢性感染急性發(fā)作期) 病人血液5 mL, 注入雙相血培養(yǎng)瓶中,混勻后置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每隔1 d觀察1次, 有菌生長(zhǎng)時(shí)挑出菌落轉(zhuǎn)種布氏瓊脂中培養(yǎng)傳代, 若液體渾濁也可將液體挑取1環(huán)接種于布氏瓊脂中。無(wú)菌生長(zhǎng)時(shí)將液面輕輕傾斜, 使液面浸過(guò)固體培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng)至30 d ,若仍無(wú)菌生長(zhǎng), 采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)BCSP31基因，PCR陽(yáng)性培養(yǎng)瓶樣本繼續(xù)接種培養(yǎng)，陰性培養(yǎng)瓶樣本高壓滅菌后棄之。

1.3.2傳統(tǒng)方法鑒定布魯氏菌 根據(jù)培養(yǎng)特性、二氧化碳需要、菌落生長(zhǎng)時(shí)間和形態(tài)觀察，革蘭染色和柯氏染色初步判定布魯氏菌。接種觀察硫堇、堿性復(fù)紅染料抑菌試驗(yàn)，A、M和R單相特異性血清凝集試驗(yàn)，Tb、BK2、Wb噬菌體裂解試驗(yàn)鑒定布魯氏菌種型[1]。

1.3.3布魯氏菌基因組DNA提取 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA(Lot#K0125)。

1.3.4BCSP31PCR鑒定布魯氏菌屬[4]PCR引物序列:

B4:5’-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3’;

B5:5’-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3。

PCR 反應(yīng)體系:10×PCRBuffer 2.5 μL,dNTP 2 μL,引物各1 μL,Taq酶1 μL ( 2.5 U ),模板1 μL,去離子水16.5 μL。PCR 反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,凝膠成像分析儀拍照。

1.3.5AMOS-PCR鑒定布魯氏菌種[5]AMOS-PCR引物和體系按參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行。P1:5-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3’;P2:5’-AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA-3’;P3:5’-CGGGTTCTGGCACCATCGTCG-3’;P4:5’-GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3’;P5:5’-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3’;P6:5’-CCCCGGAAGATATGCTTCGATCC-3’;P7:5’-GCGCCGCGAAGAACTTATCAA-3’;P8:5’-CGCCATGTTAGCGGCGGTGA-3’。

PCR反應(yīng)體系:10×PCR Buffer 2.5 μL, dNTP 2 μL,引物各0.5 μL (10 pmol/ L) , Taq酶1 μL ( 2.5 U ),模板1 μL,去離子水14.5 μL。PCR反應(yīng)程序: 93 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性1min, 60 ℃退火1.5 min, 72 ℃延伸1.5 min,共40個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物, 并用凝膠成像分析儀拍照。

2 結(jié) 果

2.1布魯氏菌培養(yǎng)特性 采用雙相血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)血液中的布魯氏菌4～5 d，固相瓊脂上有細(xì)小菌落生長(zhǎng)，菌落大小大約為0.5～1 mm，濕潤(rùn)、圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊、無(wú)色透明。革蘭氏染色鏡檢為G-、紅色的短小桿菌，柯氏特異性染色為細(xì)砂狀散落的紅色短小桿菌。生長(zhǎng)時(shí)間、菌落形態(tài)和染色特征均符合布魯氏菌的特征，同時(shí)培養(yǎng)結(jié)果表明分離菌株對(duì)CO2無(wú)依賴(lài)性。

2.2傳統(tǒng)方法鑒定布魯氏菌 利用布魯氏菌單項(xiàng)特異性血清A,M和R分別對(duì)22株分離株進(jìn)行特異性血清凝集試驗(yàn)，結(jié)果分離的22株菌均與A和M血清發(fā)生凝集反應(yīng)，而與R血清未發(fā)生凝集反應(yīng)；對(duì)分離株的染料抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株在硫堇和堿性復(fù)紅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好；噬菌體裂解結(jié)果顯示，分離株不被噬菌體Tb、Wb裂解,但是能被噬菌體Bk2裂解，根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，鑒定22株布魯氏菌均為羊種3型布魯氏菌。

2.3PCR方法在布魯氏菌分離和鑒定中的應(yīng)用 采用PCR方法檢測(cè)雙相血培養(yǎng)瓶在固相上未生長(zhǎng)而液相渾濁的樣本BCSP31基因，結(jié)果從部分樣品中擴(kuò)增到223 bp的特異性條帶(圖1)，證明液相中可能存在布魯氏菌生長(zhǎng)，對(duì)其液相進(jìn)一步接種培養(yǎng)，分離到布魯氏菌3株。

利用基因組DNA提取試劑盒提取高濃度基因組DNA，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果均能滿足PCR反應(yīng)條件，電泳結(jié)果見(jiàn)圖2?；蚪MDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所有菌株均擴(kuò)增出223 bp的特異性條帶，陰陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)成立，符合布魯氏菌擴(kuò)增理論值，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖1PCR檢測(cè)雙向血培養(yǎng)瓶液相布魯氏菌BCSP31基因Fig.1PCRdetectiononBCSP31genefrombloodculturebottle

M: Marker; 1-6: Positive; 7-9: Negative

圖2部分地方分離株基因組提取結(jié)果

Fig.2GenomicDNAextractionresultofsomestrains

M: Marker; 1-10: Strains bacteria

圖3地方分離菌株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果

Fig.3PCRresultofthestrains

M: Marker; 1-22: Strains bacteria; 23: Negative control; 24: 104M

2.4AMOS-PCR方法鑒定布魯氏菌 AMOS-PCR對(duì)22株分離株基因組進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳就檢測(cè)，所有菌株和104M疫苗株均擴(kuò)增出2條特異性片段，其中22株分離株擴(kuò)增片段大小為731 bp和178 bp，符合羊種布魯氏菌擴(kuò)增結(jié)果，104M擴(kuò)增出498 bp和178 bp，符合牛種布魯氏菌擴(kuò)增結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4地方分離菌株AMOS-PCR檢測(cè)結(jié)果

Fig.4AmplificationresultsofstrainsbyusingAMOS-PCR

M: Marker; 1-22: Strains; 23: Negative control; 24: 104M

3 討 論

目前傳統(tǒng)方法還是鑒定布魯氏菌的金標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用觀察菌落生長(zhǎng)時(shí)間和形態(tài)染色、二氧化碳需要、染料抑菌試驗(yàn)、單相特異性血清A、M和R凝集試驗(yàn)和噬菌體裂解試驗(yàn)等傳統(tǒng)方法對(duì)分離22株細(xì)菌鑒定為羊種生物3型布魯氏菌，但耗時(shí)較長(zhǎng)，并且存在生物安全的風(fēng)險(xiǎn)。

Bricker 等[6]研究用PCR能夠區(qū)別牛種布魯氏菌與其他種布魯氏菌，之后又用 PCR方法將布魯氏菌牛種(1，2，4 型)、羊種(1，2，3 型)、豬種(1 型)、綿羊附睪種區(qū)分鑒別，并將該方法稱(chēng)AMOS-PCR。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)各地不斷有布魯氏菌分離菌株報(bào)道，并利用PCR和AMOS-PCR方法對(duì)其進(jìn)行輔助鑒定[7-9]結(jié)果采用傳統(tǒng)分型方法結(jié)合MLVA方法對(duì)布魯氏菌進(jìn)行分型鑒定，可以增加鑒定工作的正確性。目前, AMOS-PCR在國(guó)內(nèi)外被廣泛應(yīng)用, 其鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)方法符合率高, 羊種菌為100% ,牛種菌為80% ,豬種菌為90%,綿羊附睪種菌為100%[5]。本研究從2009至2012年共分離到布魯氏菌22株，利用傳統(tǒng)方法結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定，其中PCR檢測(cè)BCSP31基因，能夠確定布魯氏菌屬，AMOS-PCR檢測(cè)結(jié)果能夠確定布魯氏菌種。為了防止布魯氏菌漏檢，當(dāng)固相無(wú)菌生長(zhǎng)時(shí)，利用PCR檢測(cè)方法檢測(cè)雙相培養(yǎng)瓶中液相布魯氏菌基因片段，作為判斷液相培養(yǎng)基中是否有菌生長(zhǎng)的指標(biāo)，結(jié)果從固相上未生長(zhǎng)而液相上生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中檢測(cè)到布氏菌PCR陽(yáng)性6份，分離到布魯氏菌3株，說(shuō)明PCR檢測(cè)靈敏度高于分離培養(yǎng)。

近年來(lái)，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，布病疫情有回升的勢(shì)頭，全國(guó)各地布病檢測(cè)陽(yáng)性和患病率逐年上升[10]，寧夏布病疫情與全國(guó)一致，從2004-2010年的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，報(bào)告發(fā)病率從0.017/10萬(wàn)上升到3.141/10萬(wàn)，職業(yè)以農(nóng)民居多，占69.94%，疫區(qū)范圍不斷擴(kuò)大，地區(qū)分布不均衡，患者以男性青壯年為主[11]。2012年布病發(fā)病率達(dá)8/10萬(wàn)以上，說(shuō)明寧夏的布病疫情處在高發(fā)水平。寧夏上個(gè)世紀(jì)就開(kāi)展了病原學(xué)監(jiān)測(cè)工作，自1958年寧夏首次在軍馬場(chǎng)確診病人體內(nèi)分離到羊種布魯氏菌后，到1989年該區(qū)共分離到布魯氏菌138株，包括4個(gè)種12個(gè)生物型，其中引起人體感染的主要種型為羊種布魯氏菌[12]，2009年寧夏開(kāi)展布病病原學(xué)監(jiān)測(cè)以來(lái)，主要菌型為羊種3型布魯氏菌，說(shuō)明近期分離布魯氏菌種型與以往感染人體主要菌型一致。

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