新改良PCR/LDR/毛細(xì)管電泳技術(shù)產(chǎn)前診斷胎兒β-地中海貧血的可行性研究

廖茜，易萍，鄭英如，俞麗麗，鐘小林，黃寅虎，韓磊，朱玉娟，李力

傳統(tǒng)獲取胎兒遺傳信息進(jìn)行的產(chǎn)前診斷技術(shù)為有創(chuàng)性操作[1-4]，對(duì)胎兒及母體均存在潛在的損傷，以致其臨床推廣及應(yīng)用受到一定程度的限制[5]。自Lo等[6]發(fā)現(xiàn)母體循環(huán)中存在游離胎兒DNA(cell-free fetal nucleic acids，cffDNA)后，利用孕婦外周血中的cffDNA進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷(noninvasive prenatal diagnosis，NIPD)取得了飛躍性的進(jìn)展。但胎兒DNA在孕婦血漿總DNA中所占比例甚微，其檢測(cè)受到較大限制。點(diǎn)突變檢測(cè)是目前DNA分子診斷的主要研究?jī)?nèi)容，但其技術(shù)要求高，尤其是低豐度DNA檢測(cè)技術(shù)要求更甚，故需探尋一種高靈敏度和高特異性的方法。

我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中以雌激素受體α的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)(c.454-397T＞C)、β-地中海貧血常見的2種單核苷酸突變[IVS-Ⅱ-654(C→T)、CD17(A→T)]作為研究對(duì)象，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)/連接酶檢測(cè)反應(yīng)(LDR)結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)血漿胎兒DNA實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)對(duì)低豐度基因突變的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1:10 000，初步證明其可滿足母體血漿胎兒DNA點(diǎn)突變檢測(cè)的要求[7]。但該方法需純化PCR產(chǎn)物，然后將純化的產(chǎn)物用于下一步的LDR反應(yīng)，純化過程中可能出現(xiàn)污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，擬直接將PCR產(chǎn)物應(yīng)用于LDR檢測(cè)，以達(dá)到簡(jiǎn)化步驟、減少污染的目的。本研究以β-地中海貧血CD17(A→T)突變作為研究對(duì)象，探索LDR技術(shù)結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)母體血漿中胎兒父系DNA點(diǎn)突變的可行性，以期為胎兒?jiǎn)位蜻z傳性疾病的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷尋求一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液標(biāo)本 β-地中海貧血外周血標(biāo)本：由大坪醫(yī)院檢驗(yàn)科提供，EDTA抗凝。正常人及正常孕婦外周血標(biāo)本：經(jīng)本人同意并簽署知情同意書后抽取，EDTA抗凝。

1.1.2 主要試劑及來源 普通寡核苷酸引物、LDR寡核苷酸引物由大連寶生物(TaKaRa)公司合成；熒光定量PCR相關(guān)引物及探針由上海生工合成；PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物(TaKaRa)公司；DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司；全血基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于Qiagen公司。

1.2 全血DNA提取 采用全血基因組DNA提取試劑盒提取全血DNA，操作步驟按說明書進(jìn)行，置－20℃冰箱內(nèi)備用。PCR引物：上游5'-ACTAGCAACCTCAAACAGACACCA-3'，下游5'-TCAGTGCCTATCAGAAACCCAAG-3'[7]。

1.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物電泳 擴(kuò)增體系包括PCR master mix 25μl，正、反向引物(10μmol/μl)各2μl，突變型外周血DNA 20pg，正常人外周血DNA(分別為100、50、10、1ng)，ddH2O補(bǔ)足至50μl；另設(shè)陰性對(duì)照組，只加入正常人外周血DNA。反應(yīng)條件：95℃ 5min；94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 30s，循環(huán)45次；72℃ 5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(120V，30min)，凝膠成像掃描系統(tǒng)下觀察結(jié)果并進(jìn)行圖像分析。

1.4 LDR反應(yīng) LDR上游引物序列為5'-GCCGTTACTGCCCTGTGGGGCT-3'，5'端6-FAM標(biāo)記；下游引物序列為5'-AGGTGAACGTGGATGAAGTTGGT GGTG-3'，5'端磷酸化修飾、3'端C3標(biāo)記[7]。PCR產(chǎn)物置于95℃環(huán)境中15min，緩慢冷卻至4℃?zhèn)溆?。反?yīng)體系為：10×Buffer 2μl，LDR上、下游引物(5μmol)各0.1μl，DNA連接酶8U，PCR產(chǎn)物5μl，ddH2O補(bǔ)足至20μl。95℃變性2min；94℃ 30s、65℃ 1min，循環(huán)20次；95℃ 10min。連接產(chǎn)物由重慶醫(yī)科大學(xué)感染分子生物中心進(jìn)行檢測(cè)。(1)純化：①取8μl LDR產(chǎn)物加入PCR管中，加入1μl 3mol/L醋酸鈉(pH5.2)和1μl 0.125mol/L EDTA，混勻后，加入20μl無水乙醇混勻，室溫放置15min；②3000g離心30min，倒置PCR管，去除上清；③加入30μl 70%乙醇，輕微震蕩后，1600g離心15min，倒置PCR管，去除上清；④重復(fù)步驟③；⑤在真空濃縮儀中，干燥沉淀。(2)變性：加入10μl Hi-Di甲酰胺和0.1μl GeneScanTM-500Liz?分子量?jī)?nèi)標(biāo)，95℃孵育5min，冰上放置5min。(3)上機(jī)：對(duì)PCR板相應(yīng)位置的樣品進(jìn)行編號(hào)，在室溫下，于POP-6膠(ABI)、1×電泳緩沖液(ABI)中電泳，應(yīng)用CEQ8000型遺傳分析儀，ABI片段分析軟件GeneMapper V3.5對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 孕婦血漿胎兒基因的檢測(cè) 血漿制備：采孕婦新鮮外周血5ml，EDTA-K2抗凝，1600g離心10min，取上清，16 000g再次離心10min，取上清，－20℃保存?zhèn)溆?。血漿DNA的提?。翰捎肣IAamp Blood DNA midi kit提取孕婦血漿DNA，60μl洗脫液溶解過濾，將回收液再次加入吸附柱中過濾，最終所得DNA －20℃保存?zhèn)溆?。限制性酶切：?5μl DNA加20U限制性內(nèi)切酶Hinp1 Ⅰ和20U Hha Ⅰ (NEB，USA)，37℃水浴16h，65℃水浴20min。實(shí)時(shí)定量PCR：以RASSF1A為靶點(diǎn)檢測(cè)胎兒基因，擴(kuò)增體系為緩沖液(含Mg2+)5μl，dNTP 4μl，TaqMan探針100μmol，Hot Start Version Taq(TaKaRa)300μmol，上、下游引物(10μmol)各1.4μl，酶切后DNA 20μl，ddH2O補(bǔ)足至50μl，離心混勻。50℃ 2min，95℃ 10min；95℃ 15s、62℃ 30s、72℃30s，循環(huán)50次。以β-actin基因作為內(nèi)參照[8]。

1.6 孕婦血漿模型的建立及檢測(cè) 正常孕婦血漿DNA中加入20pg CD17(A→T)突變雜合子外周血DNA后進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳及LDR方法同前所述，以正常孕婦血漿DNA作為陰性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序結(jié)果 利用AB片段反向引物測(cè)序，CD17(A→T)突變的AB片段測(cè)序結(jié)果顯示，第35位堿基(方框內(nèi))處有2個(gè)峰(T峰、A峰)，說明此處為CD17(A→T)突變的雜合子(圖1A)。利用CD片段反向引物測(cè)序，無CD17(A→T)突變的正常CD片段的測(cè)序結(jié)果顯示，第41位堿基(方框內(nèi))處只有一個(gè)峰(A峰)，無G峰，說明此處無CD17(A→T)突變(圖1B)。

圖1 CD17(A→T)突變的AB片段及正常AB片段測(cè)序結(jié)果(反向引物測(cè)序)Fig.1 Sequencing of CD17 (A→T) mutation of AB fragment (A) and normal AB fragment (B) (reverse primer sequence)

2.2 LDR檢測(cè) 以含有CD17(A→T)突變的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為L(zhǎng)DR模板，采用8U DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，采用CEQ8000型遺傳分析儀分析LDR產(chǎn)物。結(jié)果顯示，LDR檢測(cè)靈敏度可達(dá)1:5000，產(chǎn)物峰的面積隨著正常人外周血DNA濃度的增加而減少，至1:10 000處不能與雜峰區(qū)分，且無CD17(A→T)突變擴(kuò)增產(chǎn)物的陰性對(duì)照未檢測(cè)到LDR產(chǎn)物(圖2)。

2.3 孕婦血漿胎兒基因檢測(cè) 將酶切前后的孕婦血漿DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)(圖3)，可見RASSF1A基因酶切前Ct值為30.33，酶切后Ct值為32.61，以β-actin基因作為對(duì)照，其酶切前Ct值為30.33，酶切后未檢測(cè)出熒光。高甲基化RASSF1A可代表胎兒游離DNA，せ SSF1A基因可作為陽性質(zhì)控。

2.4 孕婦血漿模型LDR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果 正常孕婦血漿DNA中加入20pg CD17(A→T)突變雜合子外周血DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，LDR產(chǎn)物峰可明顯與雜峰區(qū)分(圖4)。

圖2 LDR產(chǎn)物分析圖Fig.2 Analysis of LDR productsA-D represent the LDR products with the different concentrations of normal peripheral blood DNA mixed with 20pg CD 17 (A→T) mutant hybrid DNA as template for PCR amplification, corresponding sensitivities are 1:100, 1:1000, 1:5000, 1:10000; E and F show the negative control.They are the electrophoresis results by genetic analyzer CEQ8000, abscissa indicates the length of fragment, ordinate indicates the intensity of fluorescence, arrows show connection product

3 討 論

Lo等[5]研究表明，母體血漿中胎兒DNA濃度占血漿總DNA濃度的0.4%～11.9%，檢測(cè)過程中母體等位DNA片段可干擾胎兒DNA片段的檢測(cè)，增加胎兒基因突變檢測(cè)的難度及誤診機(jī)會(huì)[9]。近幾年比較熱門的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷檢測(cè)技術(shù)包括大規(guī)模平行基因組測(cè)序、應(yīng)用鳥槍測(cè)序法通過計(jì)算父母的單倍體基因來測(cè)量胎兒的基因組[10]等，但上述方法往往因成本高、操作復(fù)雜、周期長(zhǎng)、對(duì)外周血樣本要求高等問題而難以廣泛開展。近期還有研究使用高分辨熔解分析(HRM)方法，用于父源性已知基因點(diǎn)突變的檢測(cè)，但其在妊娠早期不能完全與母體血漿DNA區(qū)分[11]。此外，反向斑點(diǎn)雜交也是目前的一種有效方法，可用于臨床檢測(cè)β-地中海貧血的基因突變，但對(duì)于β-地中海貧血的點(diǎn)突變?nèi)杂幸欢ㄕ`診率。有研究證明，單基因突變位點(diǎn)周圍的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)可直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，故應(yīng)根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性的寡核苷酸探針[12]。

圖3 孕婦血漿DNA酶切前后的實(shí)時(shí)熒光定量分析曲線圖Fig.3 Real-time fluorescence quantitative analysis curves of pregnant women plasma DNA before and after enzyme digestion2, 3 represent the RASSF1A gene in real-time fluorescence quantitative analysis before and after enzyme digestion. 1, 4 represent the β-actin gene in real-time fluorescence quantitative analysis before and after enzyme digestion

圖4 孕婦血漿模型LDR產(chǎn)物檢測(cè)分析圖Fig.4 LDR products of pregnant women plasma modelA represent the LDR product which is the normal maternal plasma DNA mixed with 20pg CD 17 (A→T) heterozygous mutant DNA PCR amplification product as a template; B is a negative control. It is the electrophoresis results by genetic analyzer CEQ8000; Abscissa indicates the length of fragment, ordinate indicates fl uorescence intensity

本研究將PCR和LDR技術(shù)相結(jié)合，建立了一種可針對(duì)孕婦外周血DNA中的父源性β-地中海貧血單基因點(diǎn)突變進(jìn)行檢測(cè)的方法。將低濃度突變型外周血基因組DNA混入不同濃度梯度的正常人外周血基因組DNA，擴(kuò)增后進(jìn)行LDR反應(yīng)，采用CEQ8000型遺傳分析儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR/LDR結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)可檢測(cè)出50ng正常基因組DNA中含有的20pg β-地中海貧血CD17(C→T)雜合突變LDR產(chǎn)物，且產(chǎn)物峰面積隨著正常模板濃度增加而降低，其基因突變檢測(cè)的靈敏度可達(dá)1:5000。因此，將PCR產(chǎn)物直接用于LDR檢測(cè)的靈敏度完全能夠滿足孕婦血漿中胎兒DNA的檢測(cè)，從而可以簡(jiǎn)化步驟，減少純化過程中導(dǎo)致污染的機(jī)會(huì)。而2006年發(fā)現(xiàn)的位于3號(hào)染色體的RASSF1A基因在胎兒DNA中表現(xiàn)為高甲基化，在母血細(xì)胞表現(xiàn)為低甲基化，通過這種不同甲基化形式的差異可檢測(cè)出孕婦外周血漿DNA中的胎兒源性DNA[7,13]。故用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶Hinp1 Ⅰ和Hha Ⅰ切掉非甲基化的母源性DNA，余下的即為胎兒源性DNA，將其作為下一步臨床病例驗(yàn)證的陽性質(zhì)控可降低假陰性率。在正常孕婦外周血血漿DNA中加入20pg β-地中海貧血CD17(C→T)雜合突變擴(kuò)增產(chǎn)物，采用本研究建立的方法，LDR產(chǎn)物峰可明顯與雜峰區(qū)分。

綜上所述，PCR/LDR/毛細(xì)管電泳技術(shù)用于檢測(cè)低豐度基因點(diǎn)突變具有很高的靈敏度，有望用于母體血漿中胎兒DNA點(diǎn)突變的檢測(cè)，且該方法與目前常用的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)相比具有操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、僅需一個(gè)工作日即可完成等優(yōu)勢(shì)。該方法理論上也可用于其他單基因點(diǎn)突變疾病的檢測(cè)，但尚有待臨床驗(yàn)證。

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