牙周組織再生動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

陶成鳳

(昆明市南屏口腔醫(yī)院修復(fù)科，云南 昆明 650041)

牙周組織再生動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

陶成鳳

(昆明市南屏口腔醫(yī)院修復(fù)科，云南 昆明 650041)

牙周炎是以造成牙周組織破壞為特點(diǎn)的口腔疾病，牙周膜是口腔牙周組織重要的組成部分，牙周組織的喪失是成年人失牙的主要原因，如何有效地終止病變并再生牙周組織在將來有可能會(huì)成為牙周炎新的治療方法之一。牙周組織的再生研究中，動(dòng)物模型起到了非常重要的作用，本文對(duì)牙周組織再生研究中使用的動(dòng)物及其特點(diǎn)做一綜述。

牙周組織再生；動(dòng)物模型；牙周炎；牙周膜

牙周炎是一種由微生物導(dǎo)致的炎癥，以牙周支持組織破壞喪失為特征的口腔疾病[1]，有將近51%的成年人隨著年齡增長(zhǎng)，因牙周炎而導(dǎo)致失牙，是造成成年人失牙的主要原因[2]。牙周膜（PDL）是牙周組織結(jié)構(gòu)的一部分，是連接牙齒和牙槽窩的軟組織，具有穩(wěn)固牙齒、咀嚼時(shí)提供支持和緩沖保護(hù)、傳導(dǎo)感受等作用[3]，是牙周組織中不可替代的組成部分。大多數(shù)情況下被破壞的牙周支持組織難以恢復(fù)，即使牙周病變終止，牙周支持組織的恢復(fù)能力也很有限[4]。目前，以組織工程學(xué)方法有效地再生恢復(fù)被破壞的牙周支持組織是研究的熱點(diǎn)之一。在再生牙周組織的研究中，建立牙周組織再生動(dòng)物模型對(duì)研究有重要的作用和意義，本文就牙周組織再生研究中使用的動(dòng)物模型及其特點(diǎn)做一綜述。

1 牙周組織再生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立

1.1 Beagle犬牙周組織再生動(dòng)物模型Beagle犬屬于哺乳動(dòng)物，又稱為獵兔犬，性情溫順，易于管理飼養(yǎng)。Beagle犬的牙周組織生理結(jié)構(gòu)，流行病學(xué)和組織病理學(xué)和人類都很相似。早在20世紀(jì)70～80年代就被用于牙周病的實(shí)驗(yàn)研究[5-6]。Iwata等[7]采用犬牙周膜來源的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)后的牙周膜細(xì)胞制成細(xì)胞膜片。將犬前磨牙拔除后5周，在犬第一磨牙近中制備出深5 mm×5 mm×4 mm（深，近遠(yuǎn)中，頰舌向距離）窩洞，同時(shí)刮除第一磨牙近中根中1/3的牙骨質(zhì)，在刮除了牙骨質(zhì)表面的根面覆蓋三層制備好的細(xì)胞膜片，再于細(xì)胞膜片表面覆以聚羥基乙酸膜，以β-三磷酸鈣填充窩洞剩余部分，將牙齦縫合復(fù)位，對(duì)照組只放置聚羥基乙酸膜，不放置細(xì)胞膜片。6周后處死Beagle犬，取相應(yīng)部位組織進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)未放置膜片的對(duì)照組中牙槽骨恢復(fù)至原有水平的一半，而放置了細(xì)胞膜片的實(shí)驗(yàn)組，不僅牙槽骨恢復(fù)形成新的牙槽脊，還可通過微型CT三維重觀察到與牙周膜纖維連接良好的牙骨質(zhì)形成，Azan染色顯示在新形成的牙骨質(zhì)和牙槽骨之間有韌帶樣組織的形成，在偏振光下進(jìn)一步確認(rèn)了牙周韌帶標(biāo)志性的膠原纖維的存在。在“種植體修復(fù)缺失牙：組織工程學(xué)方法建立牙周韌帶”的研究中，將經(jīng)過培養(yǎng)的Beagle犬牙周膜細(xì)胞種植于制成圓柱形生物性鈦片表面(15 mm長(zhǎng)，直徑5～7 mm)，使植體表面被牙周膜來源地細(xì)胞覆蓋，形成“牙周膜種植體(Ligaplant)”，將此種植體植入近中骨壁缺損的Beagle犬缺失牙區(qū)域，種植完成后以活動(dòng)牙周夾板予以固定55～73 d后，獲取組織樣本，Masson三色染色后可觀察到植體和牙槽骨之間存在垂直于植體和牙槽骨的牙周膜樣組織，植體為緊密的膠原纖維所覆蓋[8]。Beagle犬來源較廣，體型適中，加上與人類相似的牙周組織結(jié)構(gòu)，是建立牙周組織再生模型較理想的動(dòng)物。

1.2 猴牙周組織再生動(dòng)物模型猴屬于非人靈長(zhǎng)類，其生理結(jié)構(gòu)及遺傳在許多方面與人類極其相似。大多數(shù)非人靈長(zhǎng)類的牙體及牙周組織結(jié)構(gòu)與人類高度近似，除了在牙體體積大小上差異較為明顯[9]。在“釉質(zhì)基質(zhì)蛋白不同成分對(duì)猴頰側(cè)牙槽骨缺損模型上對(duì)牙周再生的影響研究”中，3～4歲齡的食蟹猴上頜從尖牙到第一磨牙頰側(cè)翻粘骨膜瓣，除去暴露的牙骨質(zhì)和牙周膜組織。從6個(gè)月齡小型豬的未萌出前磨牙和磨牙上用器械刮取釉質(zhì)基質(zhì)，取得釉質(zhì)基質(zhì)加入賦形劑制作成釉質(zhì)基質(zhì)制劑，將此釉質(zhì)基質(zhì)制劑覆于暴露的頰側(cè)根面表面，將黏骨膜瓣復(fù)位至術(shù)前水平，縫合。8周后通過光鏡和組織形態(tài)學(xué)方法下觀察術(shù)區(qū)牙周組織，觀察發(fā)現(xiàn)在術(shù)區(qū)根面使用了釉質(zhì)基質(zhì)的前磨牙在8周后超過一半的被破壞牙周組織得到恢復(fù)，使用了釉質(zhì)基質(zhì)酸性提取物的前磨牙術(shù)區(qū)8周后，牙周組織再生恢復(fù)明顯，但是伴有輕度的牙齦退縮[10]。猴雖然是很多實(shí)驗(yàn)研究中理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但是猴屬于自然保護(hù)動(dòng)物，加上倫理方面的限制，價(jià)格昂貴，想要用猴作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行大規(guī)模實(shí)驗(yàn)較為困難。

1.3 鼠牙周組織再生動(dòng)物模型鼠繁殖能力強(qiáng)，來源廣泛，價(jià)格適中，用于實(shí)驗(yàn)用途的鼠種類較多，可供選擇的范圍較廣。目前，對(duì)鼠牙齒皮下移植后牙周組織再生情況的研究較多。Kawasaki等[11]對(duì)4周齡大小的Wistar大鼠雙側(cè)上頜第一和第二磨牙拔除后立即接種到大鼠腹部軟組織，或者將拔除的牙齒用液氮冷凍過夜后再進(jìn)行移植，研究冷凍對(duì)于牙齒再植后牙周組織再生的影響；Hosoya等[12]植GFP轉(zhuǎn)基因大鼠的磨牙到野生型大鼠的皮下組織中，移植后5 d，HE染色觀察發(fā)現(xiàn)移植牙被含有豐富血管的連接組織圍繞，10 d后發(fā)現(xiàn)骨樣組織形成于根分叉的分支部位，20 d后骨樣組織幾乎延伸充滿整個(gè)根分叉部分；有學(xué)者等也進(jìn)行了類似的研究，將大鼠上頜第一、二磨牙拔出后自體移植，與1、2、4、10周分別觀察牙周組織再生和炎癥，牙骨質(zhì)再生和形成和牙槽骨的形成[13]。在上述3項(xiàng)研究中，通過不同的檢測(cè)觀察手段發(fā)現(xiàn)，在移植一定時(shí)間后，均發(fā)現(xiàn)移植牙體周圍有新的硬組織形成，并且與牙體表面牙骨質(zhì)之間有新的或者類似牙周膜的軟組織形成，形成新的牙周組織結(jié)構(gòu)。雖然鼠牙齒體積較小，對(duì)于實(shí)驗(yàn)操作有一定的要求，但是由于來源廣泛，繁殖力強(qiáng)，價(jià)格適中，可以進(jìn)行擴(kuò)大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)研究，應(yīng)用于牙周組織再生研究中。

1.4 小型豬牙周組織再生動(dòng)物模型小型豬在我國種類眾多，如滇南小耳豬、巴馬香豬、五指山豬和西藏小型豬荷包豬等。小型豬由于飼養(yǎng)成本低，體型較小，便于操作，而且小型豬由于在生理學(xué)，病理學(xué)、免疫學(xué)和解剖結(jié)構(gòu)方面與人相似[14]，是研究一些人類疾病理想的動(dòng)物模型。在“干細(xì)胞介導(dǎo)的牙周再生組織”的研究中，研究人員采用自體同源的牙周膜干細(xì)胞(從拔出的小型豬牙齒上取得，體外培養(yǎng))，用手術(shù)去除牙槽骨+絲線結(jié)扎的方法造成牙周炎，將培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞接種于手術(shù)造成的牙周炎缺損部位。實(shí)驗(yàn)總共14只小型豬，12只用于實(shí)驗(yàn)，2只不做任何處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死，其牙周組織作為正常牙周組織對(duì)照。12只豬選擇第一磨牙作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，于第一磨牙近中造成7 mm×3 mm×5 mm(長(zhǎng)×寬×高)，共計(jì)48個(gè)缺損，模型建立后隨機(jī)分為三組。治療組治療12周后影像學(xué)顯示牙槽骨水平恢復(fù)明顯，接近術(shù)前水平，牙周探診深度減小，附著喪失程度較陰性對(duì)照組明顯減輕，雖然經(jīng)治療后仍然存在輕度的牙齦退縮，但是干細(xì)胞治療再生牙周組織仍然起到了相當(dāng)?shù)寞熜15]；Fawzy等[16]進(jìn)行了與上述研究類似的牙齦緣來源的干細(xì)胞介導(dǎo)的牙周組織再生的實(shí)驗(yàn)研究，其實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也是小型豬。實(shí)驗(yàn)在小型豬第四前磨牙，第一、二磨牙近中造成缺損，以牛松質(zhì)骨和膠原蛋白作為載體，將干細(xì)胞接種到缺損區(qū)域，12周后觀察發(fā)現(xiàn)，以牛松質(zhì)骨作為載體的實(shí)驗(yàn)組牙周袋深度變化和臨床附著喪失水平等各向指標(biāo)較治療前均有明顯好轉(zhuǎn)，但是一樣存在輕度的牙齦退縮。

在人體中具有多種干細(xì)胞存在，存在于多種組織當(dāng)中，如骨髓、滑膜、骨膜、骨骼肌、脂肪組織等[17]。通過干細(xì)胞介導(dǎo)的治療方法在小型豬動(dòng)物模型上進(jìn)行的探索為將來牙周炎新療法的產(chǎn)生提供了一個(gè)重要的發(fā)展方向。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的來確定，同時(shí)也需要考慮實(shí)驗(yàn)室的條件情況，如動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境或者標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼養(yǎng)等。一般來說，如果是考察食物，細(xì)菌或者其他因素對(duì)牙周炎癥的影響，使用一些小型的動(dòng)物即可滿足要求，如大鼠和豚鼠；如果是生物活性材料和新療法安全性的最后確認(rèn)，則需要較大的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如猴和犬，但是在使用猴和犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的時(shí)候，必須要通過倫理審查[18]，方能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

在選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)，一方面，選擇其生理特點(diǎn)和病理變化與人相近者為佳，另外一方面，要求實(shí)驗(yàn)動(dòng)物容易獲得，便于管理，成本合理。一般而言，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等級(jí)越高，其代謝、結(jié)構(gòu)和病理變化等與人類就越接近。目前生理和遺傳與人類最接近的是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(黑猩猩、猴子、狒狒等)，與人類在眾多方面相似度極高。選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行和實(shí)驗(yàn)預(yù)期目標(biāo)的達(dá)成有重要的意義。

3 總結(jié)

牙周膜在牙周組織中起著非常重要的作用，牙周膜的破壞喪失往往意味著牙齒的松動(dòng)，并伴有不同程度的不適和功能下降，牙周膜破越嚴(yán)重，牙齒保留的希望就越小。有調(diào)查研究顯示，隨著年齡的增長(zhǎng)，因?yàn)檠乐軉栴}而失牙的比例呈增加趨勢(shì)[19]。如何有效地終止牙周病變并恢復(fù)牙周膜和其周圍牙周組織一直是一個(gè)重要的研究課題。

動(dòng)物模型在牙周組織再生實(shí)驗(yàn)研究中一直占有重要的地位，對(duì)牙周炎的治療研究起到了不可替代的作用。有各種種屬不同的動(dòng)物被用于牙周炎的實(shí)驗(yàn)研究，如猴，犬、鼠、兔、羊[18]和小型豬等，目前對(duì)這些動(dòng)物的牙周組織再生研究都取得了一定的成果。然而，想要將現(xiàn)階段取得的成果轉(zhuǎn)化為真正可以應(yīng)用于臨床的治療手段還有很多問題有待解決，不停地探索和研究將會(huì)為未來牙周疾病的治療產(chǎn)生出新的更有效的治療手段。

[1]Hajishengallis G,Lambris JD.Complement-targeted therapeutics in periodontitis[M].ComplementTherapeutics.Springer,2013: 197-206.

[2]Phipps KR,Stevens VJ.Relative contribution of caries and periodontal disease in adult tooth loss for an HMO dental population [J].Journal of Public Health Dentistry,1995,55(4):250-252.

[3]Beertsen W,Mcculloch CA,Sodek J.The periodontal ligament:a unique,multifunctional connective tissue[J].Periodontology 2000, 1997,13(1):20-40.

[4]Bartold PM,Shi S,Gronthos S.Stem cells and periodontal regeneration[J].Periodontology 2000,2006,40(1):164-172.

[5]Sorensen WP,LE H,Ramfjord SP.Periodontal disease in the beagle dog A cross sectional clinical study[J].Journal of Periodontal Research,1980,15(4):380-389.

[6]Lindhe J,Berglundh T,Ericsson I,et al.Experimental breakdown of peri-implant and periodontal tissues.A study in the beagle dog[J]. Clinical Oral Implants Research,1992,3(1):9-16.

[7]Iwata T,Yamato M,Tsuchika H,et al.Periodontal regeneration with multi-layered periodontal ligament-derived cell sheets in a canine model[J].Biomaterials,2009,30(14):2716-2723.

[8]Gault P,Black A,Romette JL,et al.Tissue-engineered ligament:implant constructs for tooth replacement[J].Journal of Clinical Periodontology,2010,37(8):750-758.

[9]Chandna S,Hegde S,Bathla M.Animal models in Periodontology: a review[J].Journal of Oral Health Research,2011,2(2):165-166.

[10]Hammarstr ML,Heijl L,Gestrelius S.Periodontal regeneration in a buccal dehiscence model in monkeys after application of enamel matrix proteins[J].Journal of Clinical Periodontology,1997,24(9 Pt 2):669.

[11]Kawasaki N,Hamamoto Y,Nakajima T,et al.Periodontal regeneration of transplanted rat molars after cryopreservation[J].Archives of Oral Biology,2004,49(1):59-69.

[12]Hosoya A,Ninomiya T,Hiraga T,et al.Alveolar bone regeneration of subcutaneously transplanted rat molar[J].Bone,2008,42(2): 350-357.

[13]Staels S,De Coster P,Vral A,et al.An experimental study on periodontal regeneration after subcutaneous transplantation of rat molar with and without cryopreservation:an in vivo study[J].Cryobiology,2013,66(3):303-310.

[14]Wang S,Liu Y,Fang D,et al.The miniature pig:a useful large animal model for dental and orofacial research[J].Oral Diseases, 2007,13(6):530-537.

[15]Liu Y,Zheng Y,Ding G,et al.Periodontal ligament stem cell-mediated treatment for periodontitis in miniature swine[J].Stem Cells, 2008,26(4):1065-1073.

[16]Fawzy El-Sayed KM,Paris S,Becker ST,et al.Periodontal regeneration employing gingival margin-derived stem/progenitor cells: an animal study[J].Journal of Clinical Periodontology,2012,39 (9):861-870.

[17]Shirasawa S,Sekiya I,Sakaguchi Y,et al.Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues:superiority of synovium as a cell source[J].Arthritis&Rheumatism,2005,52(8): 2521-2529.

[18]Struillou X,Boutigny H,Soueidan A,et al.Experimental animal models in periodontology:a review[J].The Open Dentistry Journal,2010,4(37)258-259.

[19]Oliver RC,Brown LJ.Periodontal diseases and tooth loss[J].Periodontology 2000,1993,2(1):117-127.

Animal models in periodontal tissue regeneration.

TAO Cheng-feng.
Nanping Stomatology Hospital of Kunming,

Kunming 650041,Yunnan,CHINA

Periodontitis is an oral disease that causes destruction of the periodontal tissue,periodontal ligament is an important part of the periodontal tissue,the loss of periodontal tissue is the main cause of adult tooth loss, and how to terminate the lesions and regenerate the periodontal tissue is likely to be one of the new treatments for periodontitis.Animal model counts for much in the periodontal regeneration research,a review about animal model in the periodontal regeneration research and their characteristics will be present here.

Periodontal regeneration;Animal models;Periodontitis;Peridontal ligament

R781.4

A

1003—6350（2014）08—1166—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.08.0451

2013-10-25)

陶成鳳。E-mail：wrd5501@163.com