熱熔擠出法制備布渣葉提取物固體分散體

涂瑤生， 朱 穎,2， 孫冬梅*， 徐文杰

(1. 廣東省中醫(yī)研究所，廣東 廣州 510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405)

布渣葉，又名破布葉，為椴樹科破布葉屬植物破布葉Microcospaniculata. L的葉。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)布渣葉提取物能顯著降低高脂血癥小鼠模型血清中總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含有量[1]。但是布渣葉提取物在0.1 mol/L鹽酸、水和磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)中的表觀溶解度分別為1.78 g/100 mL，1.73 g/100 mL和1.80 g/100 mL，根據(jù)《中國藥典》2010版凡例“項(xiàng)目與要求”項(xiàng)下溶解度的規(guī)定屬于略溶。布渣葉提取物溶解性差，導(dǎo)致其口服生物利用度低。

固體分散體(solid dispersion, SD)作為一種新型的載藥系統(tǒng)，主要用于改善難溶性藥物的溶出與吸收，提高生物利用度[2-3]。固體分散技術(shù)在改善藥物溶出方面有突出的效果，但由于制備方法存在工藝復(fù)雜、重現(xiàn)性低、有機(jī)溶劑殘留等問題，工業(yè)化推廣難度較大[4]。熱熔擠出技術(shù)(hot-melt extrusion technique, HME)又稱熔融擠出技術(shù)(melt extrusion technique)，它本身是一種工業(yè)化大生產(chǎn)技術(shù)，工藝簡單，自動(dòng)化程度高，不使用有機(jī)溶劑，恰好彌補(bǔ)了以上不足，又因?yàn)樗哂歇?dú)特的混合機(jī)理，使藥物和載體達(dá)到了分子水平的混合。通過優(yōu)選載體，可以使藥物以無定形狀態(tài)分散在載體中或者以分子狀態(tài)溶解在載體中。因此 HME技術(shù)用于制備速釋制劑有著明顯的優(yōu)勢[5-8]。HME技術(shù)作為一種新的制劑方法，已成為國外制備固體分散體的主導(dǎo)技術(shù)。

本研究利用熱熔擠出技術(shù)將布渣葉提取物制備成固體分散體，提高其體外溶出度，以達(dá)到促進(jìn)其體內(nèi)釋放和吸收，提高其生物利用度的目的，為中藥有效部位新劑型的開發(fā)提供一定的參考。

1 材料

HaakeMini CTW微量混合擠出機(jī)(美國賽默飛世爾公司)；Nicolet 6700型傅立葉變換紅外光譜儀(美國賽默飛世爾公司)；TG 209型熱重分析儀(德國NETZSCH公司)；銳影(Empyrean)X-射線衍射儀(荷蘭帕納科公司)；UV 2550紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；Agilent1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，Waters Xbridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱(美國Waters公司)。

蘆丁對照品(批號080-9303，純度≥99.99%)、牡荊苷對照品(批號111687-200602，純度≥99.99%)均購于中國食品藥品檢定研究院；異牡荊苷對照品(批號Y-127-110705，HPLC分析純度≥98%)、水仙苷對照品(批號S-127-110705，HPLC分析純度≥98%)均購于成都瑞芬思生物科技有限公司；布渣葉藥材為廣東市售，經(jīng)廣東省中醫(yī)研究所劉法錦研究員鑒定為椴樹科植物破布葉MicrocospaniculataL.的干燥葉，其提取物為自制(總黃酮含有量≥50%)；泊洛沙姆407、PEG6000均購于ISP公司。

2 方法和結(jié)果

2.1 HME技術(shù)制備布渣葉提取物固體分散體

2.1.1 藥物與載體熱穩(wěn)定性的考察 采用熱重分析(thermal gravitational analysis, TGA)法，分別取藥物和載體適量，置于鋁盤中，以氧化鋁為參比物，在空氣流中，從室溫到700 ℃，以10 ℃/min的速率升溫。

藥物和載體的失重曲線見圖1。結(jié)果顯示，藥物和載體在150 ℃以下穩(wěn)定，提示熱熔擠出操作溫度低于150 ℃為宜。

圖1 藥物和載體的熱重分析圖

2.1.2 熱熔擠出操作 設(shè)定溫度均為110 ℃；設(shè)定螺桿轉(zhuǎn)速為100 r/min。將藥物與各載體按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的比例混合均勻，得物理混合物，稱取10 g物理混合物投入加料斗中，待物料由?？讛D出后，盛接于不銹鋼盤中，-20 ℃條件下放置24 h后，置干燥器中干燥，粉碎，過60目篩，備用。

2.1.3 單一載體固體分散體的制備 按藥物與載體質(zhì)量比為1∶1，1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，分別準(zhǔn)確稱取布渣葉提取物、PEG6000和泊洛沙姆407，按“2.1.2”項(xiàng)下所述方法分別制備布渣葉提取物與PEG6000、泊洛沙姆407固體分散體。

2.1.4 二元載體固體分散體的制備 固定藥物與載體的質(zhì)量比為1∶2，PEG6000與泊洛沙姆407質(zhì)量比為4∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶4稱取，按“2.1.2”項(xiàng)下所述方法制備布渣葉提取物與PEG6000、泊洛沙姆407二元載體的固體分散體。

2.1.5 物理混合物的制備 按藥物與載體的質(zhì)量比為1∶2準(zhǔn)確稱取布渣葉提取物與二元載體(PEG6000與泊洛沙姆 407質(zhì)量比1∶4)置于乳缽中研細(xì)，混勻，過60目篩，置干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 體外溶出度測定

2.2.1 UV法測定總黃酮的量

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取蘆丁對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1 mL含0.306 mg的對照品溶液。精密量取蘆丁對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置25 mL量瓶中，按照參考文獻(xiàn)方法[9-10]測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=13.27×10-3C-30.46×10-3，r=0.999 7，在14.188～85.128 μg/mL呈良好線性關(guān)系。

2.2.1.2 專屬性試驗(yàn) 取蘆丁對照品溶液、PEG6000/泊洛沙姆407(1∶4)-布渣葉提取物溶液、PEG6000/泊洛沙姆407(1∶4)溶液測定。結(jié)果見圖2，對照品溶液和布渣葉提取物的最大吸收波長一致，兩者在(500±2) nm處有最大吸收，載體材料對總黃酮的含量測定沒有干擾，故選擇500 nm為測定波長。

圖2 對照品、樣品及載體UV掃描圖

2.2.2 HPLC法測定牡荊苷、異牡荊苷、水仙苷的量

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 色譜條件參照參考文獻(xiàn)[11]，取牡荊苷對照品、異牡荊苷對照品、水仙苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含牡荊苷192.6 μg、異牡荊苷 210.4 μg、水仙苷229.1 μg的混合對照品貯備液。精密量取貯備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，分別取10 μL注入液相色譜儀，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為：

牡荊苷Y=3.202×103X+3.707(r=0.999 5)；

異牡荊苷Y=3.605×103X+4.933 (r=0.999 5)；

水仙苷Y=10.088×103X+5.610 (r=0.999 5)。

結(jié)果表明牡荊苷、異牡荊苷和水仙苷分別在7.704～77.040 ng、8.416～84.160 ng和9.165～91.650 ng范圍呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2.2 專屬性試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液、PEG6000/泊洛沙姆407(1∶4)-布渣葉提取物溶液、PEG6000/泊洛沙姆407(1∶4)溶液各10 μL，HPLC測定。結(jié)果表明各輔料對牡荊苷、異牡荊苷和水仙苷含量測定沒有干擾，見圖3。

1.牡荊苷 2.異牡荊苷 3.水仙苷 1.vitexin 2.isovitexin 3.narcissi

2.2.3 藥物的溶出度測定 精密稱取布渣葉提取物和各種固體分散體(相當(dāng)于含布渣葉提取物0.8 g)，按溶出度測定方法(《中國藥典》2010 年版二部附錄 XC 槳法)，以水(900 mL)為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度(37±0.5)℃，分別于5、10、15、30、45、60 min 取樣 5 mL(同時(shí)補(bǔ)加同溫度等量溶出介質(zhì))，以0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)行 HPLC 和UV測定，計(jì)算累積溶出率，結(jié)果見表1～表3和圖4。

由表1可知，PEG6000作為布渣葉提取物(Bzy)的載體材料，可以顯著提高牡荊苷、異牡荊苷、水仙苷的溶出度和溶出速率，且隨著PEG6000用量的增加溶出度增大。但是，對總黃酮的溶出度影響不大，當(dāng)藥輔比為1∶6時(shí)，總黃酮溶出度為63%，較原料藥溶出度增加12%，隨著PEG6000用量再增加時(shí)，總黃酮溶出度并未增加。

由表2可知，泊洛沙姆407作為布渣葉提取物的載體材料，可以顯著增加總黃酮的溶出度，且隨著泊洛沙姆407用量的增加，總黃酮的溶出度也隨之增大。泊洛沙姆407也可增加牡荊苷、異牡荊苷、水仙苷的溶出度，但均低于PEG6000為載體制備的固體分散體；牡荊苷、異牡荊苷的溶出度隨著泊洛沙姆407用量的增加而增加；45 min內(nèi)，水仙苷的溶出速率隨著泊洛沙姆407用量的增加而降低。

為了同時(shí)增加總黃酮、牡荊苷、異牡荊苷、水仙苷的溶出度，以及盡量減少輔料用量，擬將PEG6000和泊洛沙姆407作為聯(lián)合載體應(yīng)用。在固定藥物和輔料質(zhì)量比為1∶2的情況下，又對PEG6000和泊洛沙姆407之間的質(zhì)量比例進(jìn)行了考察，結(jié)果表3。由表3和圖4可知，隨著泊洛沙姆407的用量增加，總黃酮的溶出度明顯增加，當(dāng)PEG6000與泊洛沙姆407質(zhì)量比為1∶4時(shí)，總黃酮的溶出度最好，達(dá)到了80%；較相同藥輔比情況下單一載體(PEG6000、泊洛沙姆407)制備的固體分散體中總黃酮溶出度分別增加20%和30%。PEG6000和泊洛沙姆407各質(zhì)量比均可顯著提高牡荊苷、異牡荊苷、水仙苷的溶出度，且不受PEG6000和泊洛沙姆407比例的影響；當(dāng)PEG6000與泊洛沙姆407質(zhì)量比為1∶4時(shí)，牡荊苷、異牡荊苷、水仙苷的溶出度分別為100%、100%、90%。所以，確定采用PEG6000與泊洛沙姆407質(zhì)量比為1∶4作為二元載體，藥物與輔料的質(zhì)量比為1∶2制備固體分散體。

表1 PEG6000不同比例對總黃酮、牡荊苷、異牡荊苷、水仙苷溶出的影響(n=6)

表2 泊洛沙姆407不同比例對總黃酮、牡荊苷、異牡荊苷、水仙苷溶出的影響(n=6)

表3 二元載體PEG6000與泊洛沙姆407不同比例對總黃酮、牡荊苷、異牡荊苷、水仙苷溶出的影響(n=6)

圖4 單一載體和二元載體對總黃酮、牡荊苷、異牡荊苷、水仙苷溶出的影響(n=6)

2.4 固體分散體的鑒別

2.4.1 紅外光譜分析 采用Nicolet 6700傅立葉紅外光譜儀，采用KBr壓片法制備樣品，掃描范圍為 400～4 000 cm-1，分別對布渣葉提取物、PEG6000、泊洛沙姆407、PEG6000/泊洛沙姆407(1∶4)-布渣葉提取物物理混合物及其固體分散體進(jìn)行紅外光譜分析。

由圖5可知，物理混合物在3 405.75 cm-1波數(shù)有-OH的吸收峰，而固體分散體中的吸收峰向高波數(shù)發(fā)生位移(3 420.27 cm-1)，強(qiáng)度也大幅降低，認(rèn)為可能由于布渣葉提取物與載體以氫鍵的形式結(jié)合。

圖5 藥物、載體、固體分散體和物理混合物IR圖

2.4.2 X-射線粉末衍射分析 Cu 靶 Kα1射線，電壓 40 kV，電流 40 mA，發(fā)射狹縫1/32°，防散射狹縫1/16°，防散射狹縫7.5 mm，2θ范圍：3°～50°，步長0.02°，每分鐘停留40 s。分別對布渣葉提取物、PEG-6000、泊洛沙姆407、物理混合物和固體分散體進(jìn)行 X-射線粉末衍射分析。

由結(jié)果可知，泊洛沙姆407在19.14°，23.41°出現(xiàn)強(qiáng)衍射峰，PEG-6000在19.19°，23.08°，23.44°出現(xiàn)強(qiáng)衍射峰，而布渣葉提取物沒有明顯的晶體衍射峰，三者的固體分散體中仍有晶體衍射峰出現(xiàn)，但峰強(qiáng)度明顯減弱，與物理混合物的X-射線衍射曲線類似，提示固體分散體沒有形成新的物相。

3 討論

布渣葉是廣東道地藥材，具有消食化滯，清熱利濕之功效，臨床常用于治療飲食積滯，感冒發(fā)熱，濕熱黃疸等。其保健作用雖得到廣泛認(rèn)可，但作為藥用的歷史不長，對其研究報(bào)道也不多，多數(shù)集中于化學(xué)成分研究[12-13]以及粗提物藥理作用研究[14]，對其有效部位的開發(fā)尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)對布渣葉有效部位進(jìn)行制劑研究，利用熱熔擠出技術(shù)制備得到固體分散體，提高其體外溶出速率。中藥有效部位成分復(fù)雜，單一指標(biāo)考察很難體現(xiàn)藥物作用的整體效果。所以，本實(shí)驗(yàn)采用多個(gè)指標(biāo)同時(shí)評價(jià)體外溶出度的方法，進(jìn)行載體的篩選。結(jié)果表明，采用不同的單一指標(biāo)進(jìn)行體外溶出度評價(jià)就會(huì)得出不同的結(jié)果，最后所選用的輔料及輔料用量亦不同；采用多個(gè)指標(biāo)同時(shí)評價(jià)，結(jié)合各輔料優(yōu)勢，以PEG6000和泊洛沙姆407聯(lián)合應(yīng)用為載體，既提高了溶出度，又減少了輔料的用量。

差示掃描量熱法(DSC)、紅外光譜法(IR)、X-射線衍射為固體分散體常用物相鑒別的方法，通過觀察藥物的DSC、IR、X-射線衍射這幾個(gè)譜圖的變化，可以觀察到藥物存在狀態(tài)的改變。但目前固體分散技術(shù)和物相鑒別技術(shù)主要用于藥物單體的制備和鑒別。由于本研究的藥物是從布渣葉中提取的混合物，并非單體藥物，DSC方法并不適用，所以僅采用IR和X-射線衍射對制備的固體分散體進(jìn)行物相鑒別。本實(shí)驗(yàn)為中藥提取物或中藥有效部位固體分散體的研究提供參考。

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