鈣激活鉀通道α亞單位與高血壓關(guān)系的研究

李暢　曾曉榮

[摘要] 了解調(diào)節(jié)血管張力的靶點及內(nèi)源性活性物質(zhì)配體的BKca通道的特性，有助于深入研究通道特性及臨床治療藥物篩選。用脂質(zhì)體（lipofectamine2000）轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染BKca表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-BKca篩選穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞系研究其基本的生理學(xué)特性，同時建立BKca動力學(xué)研究模型。建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BKca通道α亞單位的HEK293細(xì)胞系，通過膜片鉗記錄到與天然細(xì)胞BKca電生理BKca相似電流，可以用于分析通道動力模型及藥物動力學(xué)作用機(jī)制。成功建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BKca通道α亞單位的HEK293細(xì)胞系，膜片鉗實驗證明具有典型的BKca電生理特性，同時建立細(xì)胞系可以較好的運用于BKca通道功能調(diào)控研究和動力學(xué)參數(shù)分析。

[關(guān)鍵詞] 大電導(dǎo)鈣激活鉀通道；α亞單位；高血壓

[中圖分類號] R544.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）02-47-03

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（Bkca）廣泛分布于哺乳動物平滑肌、骨骼肌以及神經(jīng)元上，其中平滑肌上分布最為豐富。Bkca在維持和調(diào)節(jié)平滑肌張力機(jī)制中發(fā)揮重要作用，具有典型的電壓敏感性，與高血壓的發(fā)生發(fā)展以及臨床降壓藥物的治療效果具有密不可分的聯(lián)系。平滑肌上BKca通道包括形成孔道的α和調(diào)節(jié)性β1兩個膜亞基。BKca通道是目前研究降壓藥物的重點和難點。研究表明α亞單位是BKca的基本功能單位，負(fù)責(zé)BKca通道離子的流動，決定BKca的K+選擇性和Ca2+敏感性，從而影響血管的健康狀況。目前已經(jīng)將利用膜片鉗技術(shù)探討B(tài)Kcaα亞單位活性及表達(dá)，作為研究降壓治療藥物的直接依據(jù)。筆者于2012年6月～2013年6月期間通過脂質(zhì)體（lipofectamine2000）轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染BKca表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-BKca篩選穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞系研究其基本的生理學(xué)特性，同時建立BKca動力學(xué)研究模型了解調(diào)節(jié)血管張力的靶點及內(nèi)源性活性物質(zhì)配體的BKca通道的特性。本文擬就Bkca的分子結(jié)構(gòu)、生理功能，及利用膜片鉗技術(shù)對BKcaα亞單位的活性及表達(dá)進(jìn)行探討研究，對鈣激活鉀通道α亞單位與高血壓及降壓藥物療效的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 BKca通道

1.1 BKca通道總論

BKca通道是具有大電導(dǎo)并由Ca2+激活K+通道，是相當(dāng)高的單通道電導(dǎo)（large-conductance，Ca2+-activated K+ channel，BKca通道），早在1981年牛嗜鉻細(xì)胞（chromafin cells）[1]中被發(fā)現(xiàn)，BK通道在不同組織，細(xì)胞和荷爾蒙環(huán)境下有不同的顯性特征，例如在調(diào)節(jié)血管張力，血流量及血壓調(diào)控作用等很多生物學(xué)過程起著非常重要的作用。大電導(dǎo)Ca2+ 激活的K+通道（BKca）也稱為slo或Maxik通道[2]，除了受電壓調(diào)節(jié)外還受胞內(nèi)微摩爾濃度范圍內(nèi)的Ca2+調(diào)節(jié)，去極化時電導(dǎo)非常大，一般在200ps左右。BKca通道由每個α亞單位結(jié)合一個β亞單位之后再形成的BKca通道的四聚體[3]組成。α亞單位質(zhì)量約為125kDa，分別由1200個氨基酸殘基組成。β1β2β3β4四個亞基構(gòu)成β亞單位，分別由191，235，257-279，210個氨基酸殘基組成，質(zhì)量約為22，27.1，29.1-31.6，29kDa.在各種興奮性和非興奮細(xì)胞中都存在有BKca通道，在BKca通道中如果α亞基的不表達(dá)，會導(dǎo)致失禁，膀胱過度興奮，而它的刪除會影響小腦功能并產(chǎn)生耳聾現(xiàn)象，BKca通道β亞基在平滑肌細(xì)胞中，通過調(diào)節(jié)興奮-收縮耦聯(lián)參與正常血壓維持的生理過程，其參與多種疾病的病理過程，所以目前BKca通道已成為很多重要的藥物作用的靶點。

1.1.1 BKca通道α亞單位分子結(jié)構(gòu)及特性 BKca通道α亞單位分3種（slo1，slo2，slo3），是功能性的結(jié)構(gòu)單位，由一個鉀通道功能的依賴電壓激活的核心區(qū)域（S0～S8）及一個高度保守的同鈣調(diào)節(jié)相關(guān)的近羧基端的尾區(qū)域（S9～S10），而S0是α亞單位近氨基末端的跨膜片段，其區(qū)別于其他電壓依賴型通道，對β亞單位起重要的調(diào)節(jié)作用[4]。

1.1.2 BKca通道β亞單位的分子結(jié)構(gòu)及特性 由兩個跨膜（transmembrane，TM）單位組成β亞單位，它的多樣性是由位于胞質(zhì)（Cytoplasm）中COOH-末端和NH2-末端決定的，其由一個大的胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)（-loop-）相連，它的重要性在于它與α亞基的結(jié)合能明顯的改變BK通道的各種電性質(zhì)，另外α亞基和β亞基結(jié)合的多種類組合是造成原代細(xì)胞中的BK通道電性質(zhì)不確定性的根源，這也是構(gòu)成BKca通道功能多樣性結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)。

1.2 BKca通道α亞單位的由來

1991年在果蠅（Drosophila）slowpoke基因座上了發(fā)現(xiàn)BKca通道的α亞單位。其廣泛表達(dá)于線蟲類（Caenorhabditis，nematods），昆蟲類（Drosophia，insects）以及哺乳類（mammmls）等多種物質(zhì)中。由于消除了肌肉和神經(jīng)元中Ca2+激活K+通道的電流，所以這些通道又被簡稱為dslo[3]。

1.3 α亞單位組織的分布

BK通道通過蛋白質(zhì)免疫學(xué)和原位雜交檢測表明，α、β亞單位在動物多種組織細(xì)胞廣泛存在。例如蒼白球、紋狀體等神經(jīng)組織細(xì)胞[5-6]，平滑肌細(xì)胞等肌細(xì)胞[7]，心肌細(xì)胞、以及腎細(xì)胞，胰β細(xì)胞等腺細(xì)胞[8-9]。

1.4 BKca通道α亞基的識別

目前識別BKca通道分子的手段主要為免疫印跡[5-10]，免疫組織化及原位雜交等，針對α抗原決定族的抗體均位于C末端LS8-S9之后的區(qū)域，其中抗體和抗原最為關(guān)鍵。

1.5 α亞基功能結(jié)構(gòu)域及調(diào)控

α亞單位是離子孔道部分，有7個跨膜片段（S0-S6），連通細(xì)胞外的N端于α亞單位鏈接，而4個胞內(nèi)疏水片段（S7-S10）和數(shù)個剪接點通過細(xì)胞膜內(nèi)的C端連接α亞單位通過N端連接β。根據(jù)功能α亞單位分為：（1）電壓敏感區(qū)，由S1-S4片段組成，主要感受細(xì)胞膜電位變化。（2）孔道區(qū)，用S5-S6片段組成，主要調(diào)控通道在不同刺激下的通透性。（3）細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，由S7-S10組成，感知多種配體的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，而S0是人區(qū)別于其他鈣激活鉀離子通道的結(jié)構(gòu)域，它可以結(jié)合β亞單位的調(diào)節(jié)起重要作用。

1.5.1 K+的選擇性通道 BKca通道的孔道部分位于4個α亞單位的中心，而每個α亞單位上分別由S5，S6和P-loop共同組成。離子選擇特異性由六個保守的氨基酸殘基（TVGYGD）組成的結(jié)構(gòu)域決定，而在第5，6跨膜區(qū)之間的孔道區(qū)間[11]，S6結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為該K+選擇性孔道的關(guān)鍵。根據(jù)MacKinnon的假說，BKca通道模擬了K+水合物中氧原子排列的情形，通過選擇區(qū)氧原子排列讓足夠多的K+進(jìn)入孔道，然后選擇過的K+又重新被水包裹住。水化后的K+不僅降低靜電排斥力，也使離子重復(fù)進(jìn)行傳導(dǎo)，也為高效率轉(zhuǎn)運K+提供了基礎(chǔ)。

1.5.2 BKca通道α亞單位對Ca2+敏感性 BKca通道α亞單位C末端有一個由RCK結(jié)構(gòu)域和Ca2+球兩個可能結(jié)構(gòu)單元決定的通道活性區(qū)域，該區(qū)域現(xiàn)在研究認(rèn)為，參與對胞質(zhì)Ca2+的依存性[12]。在果蠅和哺乳動物的克隆之間表現(xiàn)了最高的序列的保守性，它由N末端的7個跨膜片段（S0-S6）、S5與S6片段之間的1個孔區(qū)和胞內(nèi)C末端的4個疏水片段（S7-S10）組成。疏水跨膜片段S0可與之結(jié)合，其中β亞基調(diào)節(jié)α亞基的功能；C末端區(qū)域包括S7與S8片段，含有K+電導(dǎo)調(diào)節(jié)區(qū)域（RCK），每一個RCK區(qū)域包含一個Ca2+結(jié)合點；S9和S10片段之間有著鈣敏感性的結(jié)合點，其稱為“鈣池”（calcium bowl）的負(fù)電荷區(qū)域。

2 α亞單位與高血壓的關(guān)系

隨著物質(zhì)生活的不斷改善，高血壓一直以來困擾著人類，它嚴(yán)重威脅人們的健康。目前認(rèn)為高血壓是一種以動脈血壓持續(xù)升高為特征“心血管綜合征”?，F(xiàn)在血管平滑肌細(xì)胞（vaucular smooth muscle cells ，VSMCs）中至少已確認(rèn)存在4種鉀通道，其通道影響動脈的張力及直徑，不僅調(diào)節(jié)VSMCs的膜電勢（membrane equilibrium potential，Em），也是許多血管活性物質(zhì)的作用靶點。經(jīng)大鼠實驗證明BKca主要調(diào)節(jié)VSMCs舒縮和負(fù)反饋調(diào)節(jié)小動脈肌源性緊張等方面，而電壓依賴性Ca2+通道導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，從而引起B(yǎng)Kca通道活性增強(qiáng)。胡志等[13]學(xué)者報道表明，BKca通道活性增強(qiáng)會伴隨著VSMCs通道α亞單位表達(dá)增強(qiáng)，通過熒光染色發(fā)現(xiàn)BKcaα亞單位主要分布在高血壓大鼠VSMCs胞膜上，腸系膜動脈電流密度增加，可能與α亞單位表達(dá)及合成增強(qiáng)有關(guān)，也可能與電流密度增加引起血管的舒張[14]，不能抵消平滑肌細(xì)胞肌源性收縮有關(guān)。觀察BKca與血管平滑肌細(xì)胞周期和增殖內(nèi)在聯(lián)系，可見阻斷或開放BKca能調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖，具體的機(jī)制可能與改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度有關(guān)。高血壓發(fā)病時細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運發(fā)生異常，包括Na+、K+協(xié)同轉(zhuǎn)運缺陷、細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)、鈉泵活性降低，最終導(dǎo)致膜電位降低，Ca2+濃度升高，使血管平滑肌肥大增生、反應(yīng)收縮性增強(qiáng)，增高血管阻力，血壓升高。由此可推斷，降低Ca2+依賴性進(jìn)行血管平滑肌細(xì)胞，即可降低血管阻力，降低血壓。自發(fā)性高血壓大鼠研究中發(fā)現(xiàn)，血壓升高可引起電壓依賴Ca2+通道上調(diào)，檢測出BKca代償性過表達(dá)，因此血管平滑肌細(xì)胞膜上電壓依賴性Ca2+通道對于促發(fā)血管平滑肌收縮和血管肌源性緊張度密切相關(guān)。

綜上所述，BKca通道是較為廣泛分布在血管平滑肌的細(xì)胞膜上，其電壓敏感性，胞內(nèi)鈣敏感性，大電導(dǎo)特征性決定在調(diào)節(jié)血管平滑肌張力機(jī)制中起重要作用。對BKca通道的研究成為目前在臨床降壓用藥的熱點和重點，很多研究表明α亞單位是BKca的基本功能單位，其負(fù)責(zé)BKca通道離子的流動，決定BKca的K+選擇性和Ca2+敏感性，從而影響血管的健康狀況，目前將利用膜片鉗技術(shù)對BKcaα亞單位的活性及表達(dá)進(jìn)行探討研究，為進(jìn)一步臨床選擇降壓藥物提供直接的依據(jù)。

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（收稿日期：2013-11-07）