齊墩果酸抗原發(fā)性肝癌作用機(jī)制的研究

王 悅，呂邵娃，孫 爽，李永吉

( 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

齊墩果酸(OA)是一種五環(huán)三萜類化合物，存在于自然界多種植物中，含量極其豐富.五環(huán)三萜化合物是一類因其具有多靶點(diǎn)調(diào)控能力而極具抗腫瘤研發(fā)價(jià)值的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物[1].OA還具有保肝、降脂、降糖、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用.研究表明，其對(duì)于原發(fā)性肝癌的防治具有確切療效[2-3].本文綜述了近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)OA抗HCC分子水平作用機(jī)制的最新研究進(jìn)展.

1 齊墩果酸抗肝癌作用的途徑

OA的抗肝癌作用幾乎貫穿了腫瘤發(fā)展的各個(gè)階段，其作用機(jī)制包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等途徑[4].其中，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯是其抗肝癌作用的主要途徑.

1.1 齊墩果酸誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡這一概念是1972年由Kerr提出的[5]，與細(xì)胞壞死構(gòu)成了細(xì)胞死亡的2種方式.細(xì)胞壞死是病理性的非正常死亡，是被動(dòng)死亡；而細(xì)胞凋亡是指為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，由基因來控制細(xì)胞自主有序死亡的主動(dòng)過程.它涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控等作用.Sheng-lei Yan等研究表明[6]，OA能夠誘導(dǎo)人肝癌HepG2、Hep3B、Huh7和HA22T細(xì)胞株凋亡.其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要通過四種通路發(fā)揮作用：1)線粒體通路：MING-HUAN SHYU等研究表明[7]，線粒體通路是OA誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞凋亡的主要途徑.它通過調(diào)節(jié)抗癌基因和相關(guān)酶類，控制脂解作用，使脂肪分解為游離脂肪酸，并進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化，產(chǎn)生活性氧(ROS).線粒體ROS可以促進(jìn)促凋亡基因Bax、抑制抗凋亡基因Bcl-2的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控線粒體細(xì)胞色素C及其他凋亡因子的釋放.細(xì)胞色素C與相關(guān)的凋亡蛋白激活因子形成凋亡小體，在細(xì)胞質(zhì)中的脫氧三磷酸腺苷(dATP)和ATP的作用下，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，執(zhí)行凋亡.2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路：McCullough KD等報(bào)道[8]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路可能是通過凋亡信號(hào)下調(diào)Bcl-2，耗竭谷胱甘肽及增加活性氧等機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞凋亡.OA能夠抑制Bcl-2的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路是腫瘤細(xì)胞凋亡通路之一，它有一套獨(dú)立的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng).當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能損壞時(shí)，會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(ERS)[9]，維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定，恢復(fù)細(xì)胞功能.但當(dāng)細(xì)胞損害過于嚴(yán)重，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不能恢復(fù)細(xì)胞功能時(shí)，ERS就會(huì)轉(zhuǎn)換成促凋亡模式，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，執(zhí)行凋亡.3)死亡受體通路：腫瘤壞死因子TNF和Fas死亡受體家族是主要的死亡受體.OA誘導(dǎo)死亡受體與相應(yīng)的配體結(jié)合，形成死亡受體三聚體.死亡受體家族在細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的區(qū)域即死亡結(jié)構(gòu)域，與凋亡相關(guān)因子前體結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)復(fù)合體，進(jìn)而引起cascase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-11].4)溶酶體通路：OA誘導(dǎo)的溶酶體通路一方面與線粒體通路相互協(xié)調(diào)，促進(jìn)線粒體通路的進(jìn)行，稱為線粒體-溶酶體途徑；另一方面也可以獨(dú)立完成細(xì)胞凋亡過程[12].與線粒體-溶酶體途徑相關(guān)的關(guān)鍵酶是組織蛋白酶，OA誘導(dǎo)線粒體途徑產(chǎn)生的活性氧ROS可以影響到線粒體附近的溶酶體，使溶酶體膜通透性增大，溶酶體內(nèi)多種分子質(zhì)量較小的小于閾值的組織蛋白酶就會(huì)從溶酶體中泄露出來，作用于線粒體外膜上的Bid等細(xì)胞凋亡因子，參與并促進(jìn)線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡.此外，OA也可以使促凋亡信號(hào)刺激溶酶體，使溶酶體膜通透性增大，釋放組織蛋白酶等促凋亡因子，直接引起caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)入細(xì)胞凋亡過程.Jianteng Wei等通過實(shí)驗(yàn)[13]，探討了OA誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的線粒體通路和溶酶體通路，也提示了OA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的途徑.

1.2 OA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯

研究表明[14]，OA通過對(duì)ERK-p53、p21信號(hào)和相關(guān)周期蛋白的調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞G2/ M期阻滯.細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次有絲分裂產(chǎn)生新細(xì)胞開始，到下一次有絲分裂形成子細(xì)胞為止經(jīng)歷的整個(gè)過程，分為間期和裂期.間期可以分為DNA合成前期(G1期)、DNA的合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)三個(gè)時(shí)期；有絲分裂期為M期.正常細(xì)胞中 ，在 G1/S 期、S 期及 G2/M 期的轉(zhuǎn)換都是受到多個(gè)調(diào)控因子和多個(gè)檢測(cè)點(diǎn)嚴(yán)密調(diào)控的，以保證其協(xié)調(diào)有序并且精確的進(jìn)行.在不同的細(xì)胞周期，負(fù)責(zé)調(diào)控周期進(jìn)程的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cdk)和細(xì)胞周期蛋白(cyclin)有所不同，因此起作用的 Cdk-cyclin 復(fù)合物亦不同.當(dāng)這些調(diào)控因子和檢測(cè)點(diǎn)功能發(fā)生紊亂時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展.黃開順等[14]研究表明，OA能夠通過對(duì)相關(guān)因子的調(diào)節(jié)，抑制相關(guān)Cdk-cyclin 復(fù)合物的活性，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞G2/ M期停滯.

1.3 OA抑制腫瘤血管生成及腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移

Chun-Che Lin等報(bào)道[15]，OA能夠影響肝癌Hep3B、Huh7和HA22T細(xì)胞株的浸潤(rùn)和遷移.OA通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其他相關(guān)因子的表達(dá)，從而抑制腫瘤新生血管的生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[4].腫瘤因能夠誘導(dǎo)血管生成而具有大量豐富的血管，其生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移都依賴體內(nèi)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給，血管又是提供氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要渠道，因而腫瘤的侵襲和遷移是依賴腫瘤血管的生成進(jìn)行的.抑制腫瘤血管的生成是抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的核心.腫瘤血管的生成與細(xì)胞含氧量有關(guān).腫瘤的過度增殖會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞嚴(yán)重缺氧，在無氧環(huán)境時(shí)，乏氧誘導(dǎo)基因會(huì)結(jié)合成二聚體，啟動(dòng)能夠促進(jìn)腫瘤血管生成的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)錄，并使其表達(dá)增加，從而適應(yīng)氧氣與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，進(jìn)而生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移.

2 齊墩果酸影響肝腫瘤細(xì)胞的相關(guān)因子

2.1 ERK-p53信號(hào)

OA通過對(duì)蘇氨酸蛋白激酶p53信號(hào)(ERK-p53)的調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)線粒體通路和細(xì)胞周期阻滯.其中，ERK-p53信號(hào)在這兩個(gè)過程中發(fā)揮了核心作用[16].ERK存在于胞漿內(nèi)，是一種細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，與JNK和MAPK共同構(gòu)成了MAPK家族.ERK主要包括ERK1和ERK2兩個(gè)亞型，負(fù)責(zé)將信號(hào)從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核.磷酸化激活的ERK由胞質(zhì)轉(zhuǎn)至核內(nèi)，從而參與細(xì)胞的增殖、分化，維持細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞惡變等多種生理反應(yīng)[17].YU通過MTT法證實(shí)[18]，熊果酸(UA)通過p53誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡.Li Liao等實(shí)驗(yàn)[19]，證明OA對(duì)SMMC-7721細(xì)胞具有細(xì)胞毒性.UA是OA的同分異構(gòu)體，因此兩實(shí)驗(yàn)研究提示了OA對(duì)p53信號(hào)的作用.p53是一種抗癌基因(tumor suppressor gene).惡性腫瘤的產(chǎn)生，50%以上的原因就是該基因發(fā)生突變失活，且p53基因編碼的p53蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，控制細(xì)胞周期的啟動(dòng).在肝癌細(xì)胞中，OA磷酸化激活ERK，使p53表達(dá)增加，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯.

2.2 環(huán)腺苷3'，5'-單磷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)與β氧化(FAO)

Xin Wang等報(bào)道[16]，在OA線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中，環(huán)腺苷3'，5'-單磷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB能夠通過調(diào)控過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)和脂肪酶(HSL)，控制脂解作用，進(jìn)而啟動(dòng)肝癌細(xì)胞凋亡.p53負(fù)責(zé)CREB的激活.PPAR分為α、β、γ三種壓型，其中γ亞型主要表達(dá)于脂肪組織及免疫系統(tǒng)，在脂肪組織中誘導(dǎo)脂肪的形成.研究發(fā)現(xiàn)[20]，沒有PPARγ脂肪就不會(huì)形成.HSL則通過水解甘油二酯和甘油三酯而發(fā)揮脂解作用，是脂肪分解的關(guān)鍵酶之一.CREB能夠抑制PPARγ的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)HSL，從而啟動(dòng)脂解程序.

脂肪分解為游離脂肪酸(FFAs)，進(jìn)入線粒體進(jìn)行β氧化(FAO)，產(chǎn)生活性氧(ROS).同時(shí)，PPARγ輔激活因子1α(PGC-1α)的過度表達(dá)，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝基因，能夠增加脂肪酸的氧化能力.PGC-1α作為一種轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平.機(jī)體的代謝途徑至少有一部分是通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平來完成的[21].氧化游離的脂肪酸是線粒體ROS的主要來源，而ROS的產(chǎn)生是線粒體凋亡的主要原因[22].ROS[23]可以促進(jìn)促凋亡基因Bax、抑制抗凋亡Bcl的轉(zhuǎn)錄，Bax和Bcl是Bcl-2癌基因家族的成員.Bcl-2家族蛋白是一種膜整合蛋白，存在于細(xì)胞核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體上.Bcl-2主要分為促凋亡蛋白(Bax和Bak等)和抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-xL等)兩種，是細(xì)胞凋亡的主要調(diào)節(jié)者.Bc1-2蛋白家族能夠調(diào)控線粒體細(xì)胞色素C及其他凋亡分子的釋放、線粒體ROS的大量產(chǎn)生，能夠使線粒體膜電位下降，通透性增強(qiáng)，使細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，形成凋亡小體，推動(dòng)OA線粒體通路凋亡進(jìn)程.

2.3 p21信號(hào)與cyclin B1-Cdc2 復(fù)合物

季宇彬等報(bào)道[24]，cyclin B1-Cdc2 復(fù)合物是細(xì)胞周期G2/M 期檢測(cè)點(diǎn)起作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，又稱有絲分裂促進(jìn)因子(MPF).當(dāng)細(xì)胞在 G2期DNA受損或癌變時(shí)，OA就會(huì)通過對(duì)ERK-p53基因的調(diào)控，使p21表達(dá)上調(diào)，抑制 cyclin B1/ Cdc2的活性，阻止細(xì)胞進(jìn)入M期.p21是細(xì)胞周期重要的調(diào)控基因，位于p53下游，是細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子，能夠抑制cyclin B1/cdc2的活性.細(xì)胞G2/ M期阻滯，使得細(xì)胞有充分的時(shí)間來修復(fù)受損的DNA，并阻止癌細(xì)胞有絲分裂而增殖.

2.4 HIF-1α與VEGF

OA能夠使乏氧誘導(dǎo)基因HIF-1α與內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)下調(diào)，從而抑制腫瘤新生血管的生成、侵襲和轉(zhuǎn)移.JIA通過實(shí)驗(yàn)[25]，證實(shí)了肝細(xì)胞癌(HCC)中HIF-1α和VEGF的表達(dá)及其臨床意義.HIF-1 是一種異二聚體，位于細(xì)胞核內(nèi)，分為HIF-1α和 HIF-1β兩個(gè)亞型，是調(diào)節(jié)細(xì)胞缺氧反應(yīng)最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一[26].VEGF也是OA作用的靶點(diǎn)之一，研究發(fā)現(xiàn)[27]，VEGF在缺氧環(huán)境下被誘導(dǎo)生成，能夠促進(jìn)腫瘤新生血管生成，同時(shí)也與腫瘤的侵襲和遷移有關(guān).在正常的肝細(xì)胞中，含氧量正常，腫瘤抑制基因(VHL)能夠調(diào)控HIF-1α的降解， HIF-1α經(jīng)脯氨酸羥化酶羥基化，后與VHL泛素化形成泛素蛋白酶體，作用于HIF-1α，使之降解.在無氧環(huán)境時(shí)，乏氧誘導(dǎo)基因HIF-1α和 HIF-1β結(jié)合成二聚體，啟動(dòng)VEGF的轉(zhuǎn)錄并增加VEGF mRNA的穩(wěn)定性，使VEGF的表達(dá)增加.HIF-1α與VEGF 是OA抑制腫瘤血管生成的主要靶點(diǎn).

3 肝癌細(xì)胞凋亡與級(jí)聯(lián)反應(yīng)機(jī)制

Yan SL等研究表明[28]，OA線粒體通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡途徑中，caspase-3和caspase-9裂解產(chǎn)生的活性酶能夠裂解聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP).PRAP是DNA修復(fù)酶，PARP的裂解滅活直接導(dǎo)致DNA修復(fù)功能的喪失，使基因組不能維持穩(wěn)定，從而促使細(xì)胞凋亡.Zhang W等實(shí)驗(yàn)[29]，用齊墩果烷三萜類化合物處理HepG2細(xì)胞并用MTT法測(cè)定，結(jié)果表明caspase酶家族是主要的凋亡觸發(fā)通路.另有報(bào)道[30]，OA內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)換成促凋亡模式時(shí)，胞質(zhì)中的caspase-7激活后易位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，切割活化caspase-12，活化后的caspase-12進(jìn)而激活caspase-9和caspase-3，引起caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡，此過程中caspase-9和caspase-3的激活與線粒體途徑中二者的激活無關(guān)，而是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑自身的信號(hào)傳導(dǎo)通路.此外，有文獻(xiàn)報(bào)道[31]，熊果酸對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒性與caspase-8和死亡受體DR4和DR5有關(guān)，提示了OA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的死亡受體通路與caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān).死亡受體通路中，死亡受體家族在死亡結(jié)構(gòu)域與caspase-8或caspase-10前體結(jié)合，形成了死亡誘導(dǎo)復(fù)合體，進(jìn)而切割激活caspase-8和caspase-10，更進(jìn)一步活化caspase-9和cascase-3，引起cascase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.OA誘導(dǎo)的所有細(xì)胞凋亡途徑最終都是通過激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生的[32].caspase 家族是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，分為凋亡相關(guān)因子和炎癥介導(dǎo)因子.凋亡相關(guān)因子包括啟動(dòng)因子和執(zhí)行因子，caspase-2，8，9，10等都屬于啟動(dòng)因子，它們能與死亡信號(hào)傳導(dǎo)通路中的分子結(jié)合成二聚體，通過自身的催化和識(shí)別作用，激活下游的執(zhí)行因子(caspase-3，6，7等)，分解相關(guān)蛋白及核酸，執(zhí)行凋亡.caspase家族之間可以相互激活，導(dǎo)致級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而不斷促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生.[33]

4 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，OA一方面通過線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路、死亡受體通路和溶酶體通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)出對(duì)肝癌的抑制作用.另一方面，其通過p21介導(dǎo)的cyclin B1/cdc2的下調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯.每種抗肝癌的途徑都不是孤立的，而是相互協(xié)調(diào)、相互影響的.此外，研究證實(shí)[16]，OA的毒性作用具有細(xì)胞類型特異性，能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，而對(duì)人正常肝細(xì)胞無影響.但其對(duì)于正常細(xì)胞無影響的原因及分子機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究.

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