鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯對羅非魚肝臟轉(zhuǎn)錄組影響研究

張林寶,胡 瑩,陳海剛,賈曉平,蔡文貴

?

鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯對羅非魚肝臟轉(zhuǎn)錄組影響研究

張林寶,胡 瑩,陳海剛,賈曉平,蔡文貴*

(中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站,廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室,廣東 廣州 510300)

鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)作為生產(chǎn)量和使用量最多的一種鄰苯二甲酸酯類化合物,其對水生生物具有多種毒性. 本研究選用中國南方地區(qū)最重要的經(jīng)濟魚類尼羅羅非魚()作為實驗對象, 研究DEHP(50mg/kg bw)作用下羅非魚肝臟組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄組的響應特征.利用IlluminaTM HiSeq 4000測序平臺對DEHP處理組和對照組尼羅羅非魚肝臟RNA樣品分別進行轉(zhuǎn)錄組測序.對照組和DEHP暴露組分別獲得30.10Mb 和 30.16Mb待分析數(shù)據(jù)(clean reads),對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行組裝并去冗余后得到 58,585個Unigene.將DEHP處理組和對照組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較一共獲得5,008個差異表達基因,其中上調(diào)表達基因和下調(diào)表達基因分別為3,217個和1,791個.通過GO和KEGG功能分析后發(fā)現(xiàn)這些差異表達基因主要為機體免疫、生殖內(nèi)分泌以及脂類代謝相關(guān)基因,這表明DEHP對尼羅羅非魚肝臟毒性主要表現(xiàn)為免疫毒性、生殖毒性和脂類代謝紊亂.另外,實時熒光定量PCR驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)基本可靠.上述結(jié)果為在轉(zhuǎn)錄組水平篩選DEHP生物標志物,解析DEHP對羅非魚毒性作用的分子機制提供了科學參考.

鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯；尼羅羅非魚；肝臟；轉(zhuǎn)錄組；差異表達基因

鄰苯二甲酸酯(PAEs)是一類重要的化工原料,主要用作增塑劑,同時也廣泛應用于化妝品、食品包裝、涂料、粘合劑、驅(qū)蟲劑、建筑材料和醫(yī)用品等多個領(lǐng)域[1].鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)是生產(chǎn)量(占50%)和使用量最多的PAE[2],普遍存在于水環(huán)境中.DEHP可通過食物鏈在水生生物體內(nèi)累積,有調(diào)查研究表明珠江三角洲及香港地區(qū)淡水養(yǎng)殖魚類體內(nèi)DEHP均具有較高的殘留量[3-5],如香港當?shù)厮a(chǎn)市場羅非魚體內(nèi)DEHP殘留量可達到0.26~6.53mg/kg濕重[4].我國是世界上生產(chǎn)和使用塑料產(chǎn)品最多的國家,而廣東是塑料生產(chǎn)量最大的省份,其池塘、河流、湖泊、近海等水域中PAEs污染較為嚴重[4-10].因此,開展DEHP對水生生物毒理效應研究和生態(tài)風險評估迫在眉睫.

目前國內(nèi)外對DEHP毒理學效應研究主要是建立在小鼠、大鼠等模型動物上,水生生物也多采用藻類、蚤類、斑馬魚、淸鳉等,研究結(jié)果表明DEHP的毒性效應主要表現(xiàn)為生殖干擾毒性、肝臟損傷、神經(jīng)毒性、免疫毒性、氧化應激以及機體能量代謝異常等方面[11-17].DEHP對水生生物,尤其是養(yǎng)殖魚類的毒性效應研究較少.羅非魚是我國南方地區(qū)重要的經(jīng)濟魚類,其中廣東省是羅非魚養(yǎng)殖大省,僅2015年的產(chǎn)量就占全國的43%[18].尼羅羅非魚()原產(chǎn)于非洲,為聯(lián)合國糧農(nóng)組織向全球各國推薦的養(yǎng)殖對象[19].同時,廣東省內(nèi)淡水和近岸海水中DEHP污染也較為嚴重[6].本實驗以尼羅羅非魚為研究對象,選取目前使用量最多的DEHP,從轉(zhuǎn)錄組水平探討DEHP對羅非魚肝臟毒性效應及其致毒機制,為該類物質(zhì)在漁業(yè)水域環(huán)境中的控制及管理提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持.

1 材料和方法

1.1 實驗樣品及處理

實驗用雌性尼羅羅非魚135.09±27.43g,購自珠江水產(chǎn)研究所高要水產(chǎn)良種基地,經(jīng)實驗室馴養(yǎng)15d后,選取大小接近活潑健康的個體用于后續(xù)實驗.馴養(yǎng)期間采用充分曝氣的自來水,溫度為(26±2)℃,實驗過程中每天定時投喂羅非魚飼料(3%魚體重). DEHP為分析純,橄欖油為藥用級,均購自阿拉丁試劑網(wǎng)(上海晶純生化科技股份有限公司).

在工商業(yè)發(fā)展較快的珠三角地區(qū)水生生物中DEHP殘留量達到0.20~30.34mg/kg(干重),其水產(chǎn)市場羅非魚體內(nèi)DEHP的殘留量高達5~10mg/kg濕重[3-4],因此本研究DEHP的注射濃度設置為5倍環(huán)境濃度,即為50mg/kg體重.實驗過程中根據(jù)羅非魚體重及注射濃度,用橄欖油配置4mg/mL DEHP母液,并設置橄欖油溶劑對照組.每個實驗組設置3個平行玻璃鋼,每個玻璃鋼中注入100L新鮮自來水并投放15尾尼羅羅非魚.采用腹腔注射的方式進行DEHP曝毒實驗,注射體積為2mL(對照組為2mL橄欖油,DEHP處理組為 2mL含有50mg/kg體重DEHP的橄欖油).實驗期間每天定時喂食,腹腔注射7d,注射前稱量每尾魚的體重,根據(jù)體重和暴露濃度計算DEHP用量.曝毒時間結(jié)束后,隨機取溶劑對照組和DEHP處理組的羅非魚各9尾(3尾用于轉(zhuǎn)錄組分析,6尾用于實時熒光定量PCR實驗),采用MS- 222對魚進行麻醉,快速處死并剖離肝臟置于-80℃保存用于后續(xù)分析.

1.2 RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測序

羅非魚肝臟組織總RNA提取按照Trizol試劑盒操作說明進行(Invitrogen公司),并使用DNase I消化 DNA, 總RNA質(zhì)量和純度用瓊脂糖凝膠電泳檢測, RNA完整性用Agilent 2100檢測.用帶有Oligo(dT)的磁珠對提取的總RNA進行mRNA富集和純化,然后加入片段化試劑將mRNA打斷成短片段.以片段化的mRNA為模板合成一鏈cDNA和二鏈cDNA,并使用試劑盒進行純化回收、粘性末端修復、cDNA3￠末端加上堿基“A”并連接接頭,然后進行片段大小選擇,最后進行PCR擴增.文庫用Agilent 2100Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質(zhì)檢,合格后使用Illumina HiSeq 4000平臺進行測序,獲得橄欖油對照組和DEHP暴露組測序數(shù)據(jù).測序得到的原始序列過濾掉低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的序列,得到待分析數(shù)據(jù).采用Trinity軟件對待分析數(shù)據(jù)進行組裝[20],然后使用Tgicl將組裝的轉(zhuǎn)錄本進行聚類去冗余,得到Unigene[21].

1.3 Unigenes功能注釋

利用Blast軟件對Unigene進行NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(Nr)、NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫(Nt)、注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(SwissProt)、KEGG直系同源(KO)數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫(COG)以及基因本位(GO)數(shù)據(jù)庫注釋,獲得與之具有較高同源性/相似性的序列,由此獲得該unigene的注釋信息.

1.4 差異表達基因篩選及分析

使用 Bowtie 2將待分析數(shù)據(jù)比對到Unigene,然后利用RSEM軟件進行基因表達定量分析[22],采用FPKM (每百萬fragments中來自于某基因每千堿基長度的fragments個數(shù))進行表達量計算,使用DESeq算法進行差異表達分析,以￡0.05、假陽性率(FDR)￡0.001和|Log2 差異表達倍數(shù)|31為標準,篩選DEHP暴露后羅非魚肝臟的差異表達基因[23].采用GOSeq軟件(http://www.blast2go.com/b2ghome; v2.5.0)對差異表達基因進行GO富集分析,并對富集結(jié)果進行差異表達基因數(shù)量統(tǒng)計.根據(jù)unigenes的KO注釋結(jié)果,統(tǒng)計差異表達基因在各個通路上的分布數(shù)量,利用超幾何分布計算方式,以<0.05作為閥值,確定富集通路并統(tǒng)計差異表達基因的數(shù)量.

1.5 實時熒光定量PCR驗證(RT-PCR)

用于進行qRT-PCR分析的實驗魚肝臟組織提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后進行實時熒光定量PCR實驗.使用Primer Primeir 5軟件,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組相關(guān)基因的序列設計基因特異引物(表1).這些基因主要包括免疫相關(guān)基因[凝血因子(CF),轉(zhuǎn)鐵蛋白(TF),補體因子B(CF-B),甘露糖結(jié)合凝集素絲氨酸蛋白酶(MBLSP),補體 C3 (CC3),溶酶體膜蛋白(LMP)],脂類代謝相關(guān)基因[脂肪酸羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白(FAH-DCP), Δ-6-脂肪?；摎涿?δ6-FAD),二酰甘油-O-酰基轉(zhuǎn)移酶(2AOA),過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ),?；?CoA去飽和酶(A- COA-D)]以及生殖內(nèi)分泌相關(guān)基因[胞漿磺基轉(zhuǎn)移酶(C-SULT),透明帶精子結(jié)合蛋白(ZPSBP),卵黃蛋白原(VL),細胞色素P450 3A40 (CYP4503A),類固醇21-羥化酶(S21-H)].在實驗中以羅非魚持家基因延伸因子elongation factor-1α (EF-1α)為內(nèi)參照.數(shù)據(jù)處理首先用EF-1α作為內(nèi)標基因?qū)ζ渌芯炕虮磉_量進行標準化,計算△C值.以對照組作為參照因子(calibrator),其倍數(shù)變化為1,DEHP處理組基因表達差異相對于參照因子基因表達的倍數(shù)為2-ΔΔCT.每個樣品設置6個生物學重復,并進行3次技術(shù)重復,對這些目標基因進行定量分析,計算DEHP處理后基因差異表達倍數(shù).數(shù)據(jù)結(jié)果用(平均值±標準差)表示,并與RNA-seq測序后相關(guān)基因表達量進行比較.

表1 靶基因qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 羅非魚肝臟轉(zhuǎn)錄組的測序與組裝

本研究羅非魚肝臟組織2個轉(zhuǎn)錄組分別獲得30.77Mb和30.47Mb原始序列,去除低質(zhì)量和含有接頭的序列以后,分別得到30.10Mb和30.03Mb待分析數(shù)據(jù) (見表2).堿基Q20和GC含量分別為97.01%和96.93%,45.76%和46.73%,這說明轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量和數(shù)據(jù)量相對較高.利用Trinity軟件對對照組和DEHP處理組的待分析數(shù)據(jù)進行組裝,分別獲得46047和42340條Unigenes,其平均長度分別為872和857bp,N50值分別為1614和1539bp.

表2 尼羅羅非魚肝臟轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果統(tǒng)計

2.2 尼羅羅非魚肝臟Unigenes功能注釋

通過BLASP將所有Unigenes(58,585條)序列比對到Nr、Nt、SwissProt、KEGG、COG和GO數(shù)據(jù)庫,得到與Unigenes具有高度序列相似性的蛋白,從而得到該Unigenes的蛋白功能注釋信息注釋統(tǒng)計結(jié)果如表3所示.

表3 注釋結(jié)果統(tǒng)計

2.3 DEHP暴露尼羅羅非魚肝臟差異表達基因的篩選

利用DESeq算法計算unigene在對照組和DEHP暴露實驗組中基因表達量進行差異分析,以|Log2Ratio|31,￡0.05, FDR￡0.001為篩選標準,共得到5008個差異表達基因,其中上調(diào)基因有3217個,下調(diào)基因有1791個.圖1為差異表達基因的Volcano-plot分布圖(藍色點表示下調(diào)表達的基因,紅色點表示上調(diào)表達的基因,黑色點表示基因表達變化倍數(shù)<2).其中基因表達增加或降低變化倍數(shù)最高的前20個基因信息如表4所示,這些基因絕大部分涉及到羅非魚免疫系統(tǒng)、生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)和脂肪代謝系統(tǒng).如免疫系統(tǒng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)鐵蛋白和凝血因子的表達量被顯著誘導至對照組的11倍多,而補體C1q類似蛋白基因表達水平被顯著抑制(-10.46).涉及脂肪代謝的基因如脂肪酸羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白、2-?；视?o-脂肪酰轉(zhuǎn)移酶及?；?CoA去飽和酶等基因表達水平也被顯著誘導或降低.另外,與羅非魚內(nèi)分泌生殖系統(tǒng)相關(guān)的諸多基因表達水平也被顯著改變,如類固醇21-羥化酶、脫氫/還原酶SDR家族成員、胞漿磺酸轉(zhuǎn)移酶、卵黃蛋白原、透明帶精子結(jié)合蛋白等.

圖1 DEHP處理組和對照組差異表達基因的Volcano-plot分布

表4 DEHP作用下尼羅羅非魚肝臟基因表達變化倍數(shù)最高的前20個基因

2.4 差異表達基因GO和KEGG富集分析

將差異表達基因按照生物過程(Biological proeess)、細胞組分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)進行GO富集,結(jié)果顯示2985個差異表達基因顯著富集在1756個GO terms中,包括992個生物學過程,207個細胞組分和557個分子功能.DEHP作用下羅非魚肝臟差異表達基因主要參與細胞過程(Cellular process)、代謝過程(Metabolic process)和單有機體過程(Single-organism process)等生物學過程.從細胞組成看,差異表達基因主要定位于細胞(Cell)、細胞組分(Cell part)和膜(Membrane)中.從分子功能上分析差異基因主要為結(jié)合類(Binding)和催化類(Catalytic) (圖2).差異表達基因KEEG富集分析結(jié)果顯示2932個差異基因分布在303個通路中.其中富集最顯著的前20個KEGG通路如表5所示,大量差異表達基因在免疫疾病相關(guān)的通路中被顯著富集,包括移植排斥(Allograft rejection)、原發(fā)性免疫缺陷(Primary immunodeficiency)、自身免疫性甲狀腺病(Autoimmune thyroid disease)、移植物抗宿主疾病(Graft-versus-host disease)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus)、哮喘(Asthma)和類風濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)等.除與免疫疾病相關(guān)的基因表達以外,傳染病相關(guān)的通路在pathway中也被富集,如金黃色葡萄球菌感染(Staphylococcus aureus infection)和肺結(jié)核(Tuberculosis).另外,還有其他免疫相關(guān)基因在造血細胞譜系(Hematopoietic cell lineage)和吞噬小體(Phagosome)中被顯著富集.其次內(nèi)分泌系統(tǒng)(PPAR signaling pathway)和脂類代謝(Fatty acid metabolism和Fatty acid degradation)相關(guān)的差異表達基因也被顯著富集.

對KEGG通路進行分類統(tǒng)計,差異表達基因數(shù)目較多的次級富集通路依次為全局和概覽通路(Global and overview maps)、信號轉(zhuǎn)導(Signal transduction)、免疫系統(tǒng)(Immune system)、病毒感染性疾病(Infectious diseases: Vira)、癌癥(Cancers: Overview)、運輸與分解代謝(Transport and catabolism)、細菌感染性疾病(Infectious diseases: Bacterial)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(Endocrine system)、信號分子與相互作用(Signaling molecules and interaction)、脂類代謝(Lipid metabolism)等(圖3).

基因表達數(shù)量

表5 差異表達基因富集最顯著的前20個KEGG通路

續(xù)表5

基因表達數(shù)量

2.5 qRT-PCR驗證

為了驗證DEHP染毒后羅非魚肝臟轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的真實可靠性,本研究挑選了15個差異表達基因進行熒光定量PCR驗證.實驗結(jié)果表明DEHP脅迫下各基因差異表達倍數(shù)與RNA-seq對應的Unigene差異表達倍數(shù)趨勢基本一致(圖4).

圖4 qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果

CF = coagulation factor, TF = transferrin, CF-B = complement factor B, MBLSP = mannan-binding lectin serine protease, CC3 = complement C3, LMP = lysosome membrane protein,FAH-DCP = fatty acid hydroxylase domain-containing protein,δ6 -FAD = delta 6fatty acyl desaturase, 2AOA = 2-acylglycerol O-acyltransferase, PPARγ = peroxisome proliferator-activated receptor gamma, A-COA-D = acyl-CoA desaturase, C-SULT = cytosolic sulfotransferase, ZPSBP = zona pellucida sperm-binding protein, VL = vitellogenin, CYP4503A = cytochrome P450 3A40, S21-H = steroid 21-hydroxylase

3 討論

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的廣泛應用,為研究環(huán)境污染物對海洋生物基因組轉(zhuǎn)錄水平的影響,分析其分子作用機制提供了重要的技術(shù)手段.用轉(zhuǎn)錄組學的方法,也可以在分子水平更靈敏地發(fā)現(xiàn)一些毒性效應,如5~50 μg/L納米銀材料暴露斑馬魚()28d后,其鰓組織在組織形態(tài)結(jié)構(gòu)上沒有顯著變化,但基因的表達卻發(fā)生了變化,這些基因主要與發(fā)育、生長、DNA 修復和損傷有關(guān)[24].目前,有關(guān)PAE對魚類基因組轉(zhuǎn)錄水平影響的研究尚未見報道.本研究選用目前生產(chǎn)量和使用量最多的DEHP作為實驗對象,研究其對中國南方地區(qū)最重要的經(jīng)濟魚類羅非魚肝臟轉(zhuǎn)錄組的毒性效應.將DEHP處理組和橄欖油對照組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較一共獲得4784個差異表達基因,其中2814個基因被誘導,1790個基因表達水平被抑制.通過GO和KEGG功能分析后發(fā)現(xiàn)這些差異表達基因主要為機體免疫、生殖內(nèi)分泌以及脂類代謝等相關(guān)基因.

3.1 DEHP暴露對尼羅羅非魚免疫系統(tǒng)的影響

在本研究中,大量基因在“Hematopoietic cell lineage”(造血細胞譜系)和“Phagosome”(吞噬小體)中被顯著富集.吞噬小體是一種在胞吞作用中在被吞噬物質(zhì)周圍形成的囊泡,這種囊泡由細胞膜向細胞內(nèi)凹陷產(chǎn)生.吞噬體是一種在免疫過程中常見的細胞結(jié)構(gòu),入侵機體的病原微生物可在吞噬體中被殺滅、消化[25].本研究中很多免疫相關(guān)因子包括B細胞受體CD22、凝血因子、L-鼠李糖凝集素、cathepsin S, 抗原肽轉(zhuǎn)運蛋白、白細胞介素等基因表達均被明顯影響.凝集素能識別碳水化合物,參與細胞間的粘附、識別以及外源物質(zhì)的吞噬清除和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導,對維持機體自身穩(wěn)態(tài)等生理功能以及在感染、炎癥等疾病過程中發(fā)揮重要作用[26].此外,與補體相關(guān)的因子complement factor B, complement C3, complement component C6, complement C1q tumor necrosis factor-related protein以及complement C1q-like protein等表達也受到影響.補體是機體免疫防御系統(tǒng)進化歷程中最古老的免疫成分之一,它是脊椎動物和無脊椎動物中都具有的一個復雜的限制性蛋白水解系統(tǒng)[27].補體因子既是固有免疫系統(tǒng)的重要組成成分,也是聯(lián)系固有免疫和獲得性免疫的紐帶,在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的防御和監(jiān)視作用[28-29].以上研究結(jié)果表明羅非魚肝臟在DEHP暴露下,引起免疫應激反應.

另外,大量差異基因在免疫疾病相關(guān)的通路中被顯著富集,包括移植排斥(Allograft rejection)、原發(fā)性免疫缺陷(Primary immunodeficiency)、自身免疫性甲狀腺病(Autoimmune thyroid disease)、移植物抗宿主疾病(Graft-versus-host disease)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus)、哮喘(Asthma)和類風濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)等.除與免疫疾病相關(guān)的基因表達以外,傳染病相關(guān)的通路在pathway中也被富集,如金黃色葡萄球菌感染(infection)和肺結(jié)核(Tuberculosis).Bennett等[30]認為傳染性疾病與病菌原的侵染有關(guān),這些基因影響著水生生物的生存與健康,然而關(guān)于污染物與免疫疾病以及傳染性疾病關(guān)系的研究還比較少.有研究表明外源性污染物對某些細胞和生理功能產(chǎn)生負面影響,可能會導致疾病[31].因此,本研究結(jié)果表明免疫疾病和傳染性疾病相關(guān)的基因表達變化可能與羅非魚肝臟在DEHP脅迫后產(chǎn)生損傷干擾羅非魚免疫系統(tǒng)有關(guān),但有關(guān)羅非魚肝臟免疫疾病和傳染性疾病與污染物脅迫的相關(guān)性有待進一步深入研究.

總之,在本研究中DEHP作用下尼羅羅非魚肝臟多種與免疫相關(guān)的基因表達水平受到明顯影響,表明羅非魚的免疫系統(tǒng)受到DEHP暴露的干擾.DEHP暴露引起免疫毒性在其他水生生物中也有發(fā)現(xiàn),例如在虹鱒()體外培養(yǎng)的免疫組織中,DEHP暴露抑制B細胞增殖,并導致抗體分泌細胞數(shù)量減少[32].Huang等[11]研究發(fā)現(xiàn)DEHP作用下海水淸鳉()體內(nèi)白細胞介素1β基因表達量顯著升高.DEHP作用下菲律賓蛤仔()免疫相關(guān)基因的表達量也發(fā)生顯著升高[33].DEHP導致黃刺魚()的血液指標惡化與免疫相關(guān)功能受到抑制[16].

3.2 DEHP暴露對尼羅羅非魚內(nèi)分泌生殖系統(tǒng)的影響

研究發(fā)現(xiàn),DEHP能夠干擾多種水生生物的生殖發(fā)育過程[8,15,34-35].本研究中羅非魚肝臟卵黃蛋白原()基因表達水平被顯著抑制.卵黃蛋白原一般在雌性激素的誘導下在肝臟中合成,然后遷移至卵巢轉(zhuǎn)化為卵黃蛋白,為正在發(fā)育的胚胎提供營養(yǎng)和功能性物質(zhì)[36],因此血漿中卵黃蛋白原的含量可作為機體內(nèi)分泌紊亂的生物標志物.Kim等[37]研究發(fā)現(xiàn)DEHP作用下日本青鳉()血液中卵黃蛋白原含量顯著降低.然而雄性斑馬魚連續(xù)10天腹腔注射5000mg/kg DEHP,能夠激活肝臟內(nèi)雌激素介導的信號通路使卵黃蛋白原VTG的轉(zhuǎn)錄顯著增加[38].另外,本研究中轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)大量與激素合成相關(guān)基因的表達也受到DEHP暴露的影響,如類固醇21-羥化酶不同亞型基因表達水平被顯著誘導或抑制,脫氫/還原酶SDR家族成員和胞漿磺酸轉(zhuǎn)移酶等基因表達水平顯著升高(表4).這些基因表達水平的紊亂可能會影響羅非魚血液中激素的含量.海水青鳉在DEHP中暴露6個月后隨著激素合成相關(guān)基因表達水平的增加,血漿中雌激素水平顯著升高,睪酮/雌激素比值顯著降低[15].稀有鮈鯽()在DEHP脅迫下雌魚血漿中雌激素濃度下降、睪酮上升,而雄魚的雌激素和睪酮水平均顯著上升[39].

3.3 DEHP暴露對尼羅羅非魚脂類代謝的影響

Meng等[12]研究發(fā)現(xiàn)DEHP作用下黃顙魚肝臟內(nèi)與脂類代謝相關(guān)酶活力和基因表達水平均被顯著影響.肝臟是魚體內(nèi)脂肪合成和儲藏的最重要部位[40].在本研究中,大量差異表達基因(如PPARα、PPARγ、脂肪酸羥化酶、脂肪酸合成酶、脂肪酸結(jié)合蛋白、2-?；视?o-脂肪酰轉(zhuǎn)移酶及?；?CoA去飽和酶等)富集在“PPAR signaling pathway”, “fatty acid metabolism” and “fatty acid degradation”等KEGG通路中,這表明DEHP暴露引起羅非魚肝臟脂類代謝紊亂.PPARα 和 PPARγ基因調(diào)節(jié)脂肪酸的合成、轉(zhuǎn)運和儲存[41-42].脂肪酸結(jié)合蛋白是脂肪酸和其他脂類物質(zhì)的轉(zhuǎn)運蛋白[43].脂肪酸羥化酶、脂肪酸合成酶、2-酰基甘油-o-脂肪酰轉(zhuǎn)移酶及?；?CoA去飽和酶等都是脂肪酸合成和脂類代謝動態(tài)平衡過程中的關(guān)鍵酶[44-45].類似的結(jié)果在小鼠()中也有發(fā)現(xiàn),DEHP作用下小鼠PPARα, PPARγ 和脂蛋白脂肪酶等脂類代謝相關(guān)基因的表達水平受到顯著影響[46].

4 結(jié)論

4.1 尼羅羅非魚DEHP處理組和橄欖油對照組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較一共獲得5,008個差異表達基因,其中3,217個基因表達被誘導, 1,791個基因表達被抑制.通過實時熒光定量PCR驗證發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)基本可靠.

4.2 通過GO和KEGG功能分析發(fā)現(xiàn)DEHP作用下尼羅羅非魚肝臟差異表達基因主要涉及機體免疫(轉(zhuǎn)鐵蛋白、凝血因子、補體等基因)、生殖內(nèi)分泌(卵黃蛋白原和性激素合成相關(guān)酶類基因)以及脂類代謝(脂肪酸合成、轉(zhuǎn)移等酶類基因)等生理過程,這表明DEHP對尼羅羅非魚肝臟的毒性主要表現(xiàn)為免疫毒性、生殖毒性和脂類代謝紊亂.

[1] Wan H T, Leung P Y, Zhao Y G, et al. Blood plasma concentrations of endocrine disrupting chemicals in Hong Kong populations [J]. Journal of hazardous materials, 2013,261(13):763-769.

[2] Ma T, Zhou W, Chen L, et al. Toxicity effects of di-(2-ethylhexyl) phthalate to Eisenia fetida at enzyme, cellular and genetic levels[J]. PLoS ONE, 2017,12(3):e0173957.

[3] 李 瀟,聶湘平,潘德博,等.養(yǎng)殖魚體鄰苯二甲酸酯含量與分布特征 [J]. 環(huán)境與健康雜志, 2008,25(3):202-205. Li X, Nie X P, Pan D B, et al. Analysis of PAEs in muscle tissue of freshwater fish from fishponds in Pearl River Delta [J].Journal of Environmental Health, 2008,25(3):202-205.

[4] Cheng Z, Nie X P, Wang H S, et al. Risk assessments of human exposure to bioaccessible phthalate esters through market fish consumption [J]. Environment International, 2013,57-58:75-80.

[5] 林 欽,石鳳瓊,柯常亮,等.水產(chǎn)品中鄰苯二甲酸酯殘留與健康風險評價研究進展 [J]. 南方水產(chǎn)科學, 2014,(10)1:92-99. Lin Q, Shi F Q, Ke C L, et al. Residues of phthalic acid esters in aquatic products and their health risk assessment [J]. South China Fisheries Science, 2014,(10)1:92-99.

[6] Li C, Zhao Y, Li L, et al. Exposure assessment of phthalates in non-occupational populations in China [J]. Science of the Total Environment, 2012,427-428(12):60-69.

[7] Kong S, Ji Y, Liu L, et al. Diversities of phthalate esters in suburban agricultural soils and wasteland soil appeared with urbanization in China [J]. Environmental Pollution, 2012,170(8):161-168.

[8] Liu N, Wang Y, Yang Q, et al. Probabilistic assessment of risks of diethylhexyl phthalate (DEHP) in surface waters of China on reproduction of fish [J]. Environmental Pollution, 2016,213(213): 482-488.

[9] Zhan Y, Sun J, Luo Y, et al. Estimating emissions and environmental fate of di-(2-ethylhexyl) phthalate in Yangtze River Delta, China: Application of inverse modeling [J]. Environmental Science & Technology, 2016,50(5):2450-2458.

[10] Zhang L, Liu J, Liu H, et al. The occurrence and ecological risk assessment of phthalate esters (PAEs) in urban aquatic environments of China [J]. Ecotoxicology, 2016,24(5):1-18.

[11] Huang Q, Chen Y, Chi Y, et al. Immunotoxic effects of perfluorooctane sulfonate and di(2-ethylhexyl) phthalate on the marine fish Oryzias melastigma [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2015,44(1):302-306.

[12] Ma T, Zhou W, Chen L, et al. Toxicity effects of di-(2-ethylhexyl) phthalate to Eisenia fetida at enzyme, cellular and genetic levels [J]. Plos One, 2017,12(3):e0173957.

[13] Meng F X, Li M, Song M Z, et al. Di-2-ethylhexyl phthalate (DEHP) exposure disturbs lipid metabolism in juvenile yellow catfish Tachysurus fulvidraco [J]. Journal of Fish Biology, 2017,92:85-93.

[14] Xiang N, Zhao C, Diao X, et al. Dynamic responses of antioxidant enzymes in pearl oyster Pinctada martensii exposed to di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) [J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2017,54:184-190.

[15] Ye T, Kang M, Huang Q, et al. Exposure to DEHP and MEHP from hatching to adulthood causes reproductive dysfunction and endocrine disruption in marine medaka (Oryzias melastigma) [J]. Aquatic Toxicology, 2014,146(146C):115-126.

[16] Yuan L, Li M, Meng F, et al. Growth, blood health, antioxidant status, immune response and resistance to Aeromonas hydrophila of juvenile yellow catfish exposed to di-2-ethylhexyl phthalate (DEHP) [J]. Comparative Biochemistry Physiology, 2017,202C:79-84.

[17] Li C, Chen X, Zhang P, et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate mediates glycolysis and the TCA cycle in clam Venerupis philippinarum [J]. Invertebrate Survival Journal, 2014,11:174-181.

[18] 周遠揚,王玉梅,曹俊明,等.2015年廣東羅非魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展形勢與對策建議[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學, 2016,43(6):23-27. Zhou Y Y, Wang Y M, Cao J M, et al. Development situation and countermeasures of Guangdong tilapia industry in 2015 [J]. Guangdong Agricultural Sciences, 2016,43(6):23-27.

[19] 余嘉欣,吳 芳,孫成飛,等.尼羅羅非魚-干擾素基因的克隆、結(jié)構(gòu)分析及組織表達[J]. 南方水產(chǎn)科學, 2017,(13)1:85-93. Yu J X, Wu F, Sun C F, et al. Cloning, structure analysis and expression of interferon gamma (IFN-γ) gene in Oreochromis niloticus [J]. South China Fisheries Science, 2017,(13)1:85-93.

[20] Grabherr M G, Haas B J, Yassour M, et al. Trinity: reconstructing a full-length transcriptome without a genome from RNA-Seq data [J]. Nature Biotechnology, 2011,29(7):644-652.

[21] Pertea G, Huang X, Liang F, et al. TIGR Gene Indices clustering tools (TGICL): a software system for fast clustering of large EST datasets [J]. Bioinformatics, 2003,19(5):651-652.

[22] Li B, Dewey CN. RSEM: accurate transcript quanti?cation from RNA-Seq data with or without a reference genome [J]. BMC Bioinformatics, 2011,12(1):323.

[23] Benjamini Y, Yekutieli D. The control of the false discovery rate in multiple testing under dependency [J]. Annals of Statistics, 2001, 29(4):1165-1188.

[24] Griffitt R J, Lavelle C M, Kane A S, et al. Chronic nanoparticulate silver exposure results in tissue accumulation and transcriptomic changes in zebrafish [J]. Aquatic Toxicology, 2013,130(2):192-200.

[25] Jiang X, Qiu L, Zhao H, et al. Transcriptomic responses of Perna viridis embryo to benzo(a)pyrene exposure elucidated by RNA sequencing [J]. Chemosphere, 2016,163:125-132.

[26] Moreira R, Balseiro P, Planas J V, et al. Transcriptomics of in vitro immune-stimulated hemocytes from the Manila clam Ruditapes philippinarum using high-throughput sequencing [J]. Plos One, 2012,7(4):e35009.

[27] 金伯泉.細胞和分子免疫學(第二版) [M]. 北京:科學出版社, 2001. Jin B Q. Cellular and molecular immunology [M]. 2nded. Beijing: Science Press, 2001.

[28] Volanakis J E, Frank M. The human complement system in health and disease [D]. New York: Marcel Deiierk Inc, 1998.

[29] Ghai R, Waters P, Roumenina L T, et al. C1q and its growing family [J]. Immunobiology, 2007,212(4/5):253-266.

[30] Bennett J E, Dolin R, Blaser M J. Principles and Practice of Infectious Diseases [D]. Elsevier Health Sciences, 2014.

[31] Mix M C. Shellfish diseases in relation to toxic chemicals [J]. Aquatic. Toxicology, 1988,11(1):29-42.

[32] Martins K, Applegate B, Hagedorn B, et al. Di(2-ethylhexyl) phthalate inhibits B cell proliferation and reduces the abundance of IgM- secreting cells in cultured immune tissues of the rainbow trout [J]. Fish Shellfish Immunology, 2015,44(1):332-341.

[33] Lu Y, Zhang P, Li C, et al. Characterisation of immune-related gene expression in clam (Venerupis philippinarum) under exposure to di(2-ethylhexyl) phthalate [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2013, 34(1):142-146.

[34] Wang Y X, Zeng Q, Sun Y, et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China [J]. Environmental Research, 2016,150:557-565.

[35] Zarean M, Keikha M, Poursafa P, et al. A systematic review on the adverse health effects of di-2-ethylhexyl phthalate [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2016,23(24):24642-24693.

[36] Chen T T, Reid P C, Beneden R V, et al. Effect of Aroclor 1254and mirex on estradiol-lnduced vitellogenin production in juvenile rainbow trout (Salmo gairdneri) [J]. Journal Canadien Des Sciences Halieutiques Et Aquatiques, 1986,43(1):169-173.

[37] Kim E J, Kim J W, Lee S K. Inhibition of oocyte development in Japanese medaka (Oryzias latipes) exposed to di-2-ethylhexyl phthalate [J]. Environment International, 2003,28(5):359-365.

[38] Urenwebster T M, Lewis C, Filby A L, et al. Mechanisms of toxicity of di (2-ethylhexyl) phthalate on the reproductive health of male zebrafish [J]. Aquatic Toxicology, 2010,99(3):360-369.

[39] Wang X, Yang Y, Zhang L, et al. Endocrine disruption by di-(2- ethylhexyl)-phthalate in Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) [J]. Environmental Toxicology Chemistry, 2013,32(8):1846-1854.

[40] Nanton D A, Vegusdal A, Amb R, et al. Muscle lipid storage pattern, composition, and adipocyte distribution in different parts of Atlantic salmon (Salmo salar) fed fish oil and vegetableoil [J]. Aquaculture, 2007,265(1):230-243.

[41] Wilbanks M S, Gust K A, Atwa S, et al. Validation of a genomics- based hypothetical adverse outcome pathway: 2,4-dinitrotoluene perturbs PPAR signaling thus impairing energy metabolism and exercise endurance [J]. Toxicological Sciences, 2014,141(1):44-58.

[42] Jia Y, Wu C, Kim J, et al. Astaxanthin reduces hepatic lipid accumulations in high-fat-fed C57BL/6J mice via activation of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha and inhibition of PPAR gamma and Akt [J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 2016,28:9-18.

[43] Chmurzyńska A. The multigene family of fatty acid-binding proteins (FABPs): Function, structure and polymorphism [J]. Journal of Applied Genetics, 2006,47(1):39-48.

[44] Nakamura M T, Nara T Y. Structure, junction, and dietary regulation of Delta 6, Delta 5, and Delta 9desaturases [J]. Annual Review of Nutrition, 2004,24:345-376.

[45] Huang C, Chen Q L, Luo Z, et al. Time-dependent effects of waterborne copper exposure influencing hepatic lipid deposition and metabolism in javelin goby Synechogobius hasta and their mechanism [J]. Aquatic Toxicology, 2014,155(4):291-300.

[46] Xu Y, Agrawal S, Cook T J, et al. Maternal di-(2-ethylhexyl)- phthalate exposure influences essential fatty acid homeostasis in rat placenta [J]. Placenta, 2008,29(11):962-969.

Transcriptome analysis in the liver of Nile tilapia () after treated with di (2-ethylhexyl) phthalate.

ZHANG Lin-bao, HU Ying, CHEN Hai-gang, JIA Xiao-ping, CAI Wei-gui*

(Scientific Observing and Experimental Station of South China Sea Fishery Resources & Environments, Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Fishery Ecology and Environment, Guangdong Province, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China)., 2019,39(1)：386~396

Di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) is currently the most frequently detected phthalic acid esters (PAEs) and can induce diverse toxicities on aquatic organisms. To understand the transcriptomic responses of fish exposed to DEHP, we performed transcriptomic profiles in liver of tilapia (), which is the most important commercial fishes in Guangdong province. Transcriptome sequencing in liver of Nile tilapia exposed to olive oil (control group) and 50mg kg-1body weight of DEHP for 7days was performed respectively using Illumina HiSeq 4000platform. A total of 30.10Mb and 30.16Mb clean reads were retrieved from the control and DEHP treated libraries, respectively. De-novo assembly of all the clean reads obtained 58,585unigenes. After comparing the two libraries, 3,217 and 1,791genes were identified as significantly increased and depressed, respectively. Gene ontology (GO) classification system and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database analysis demonstrated that DEHP significantly disturbed the expression level of genes associated with immunity, endocrine and reproductive system, lipid metabolism and so on. Quantitative real-time PCR was performed to validate the results of RNA-sequencing (RNA-seq) analysis. The resulting data provide new insights for exploring the molecular basis of tilapia response to DEHP exposure.

DEHP；Nile tilapia；liver；transcriptome；different expression genes

X55,S949

A

1000-6923(2019)01-0386-11

張林寶(1984-),女,安徽安慶人,副研究員,博士,主要從事分子毒理學研究.發(fā)表論文30余篇.

2018-06-15

中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費資助專項(2015TS01,2017YB09和2016TS19);國家自然科學基金資助項目(41306113)

* 責任作者, 研究員, cai-wengui@163.com