復方多西環(huán)素緩釋凝膠的體內釋放度測定

程鳳峽 張海芳 楊玉鵬 田華 劉勇

牙周病是牙周致病菌及其毒性產物引發(fā)的宿主免疫和炎性反應，是造成牙周組織破壞的主要原因，其最終結果將導致牙周袋形成，牙槽骨吸收，牙齒松動、脫落。近年來，局部用藥尤其是局部緩釋制劑受到越來越多的關注。多西環(huán)素和骨碎補可在牙周治療中起到抑菌，抑制膠原酶活性，刺激牙周膜細胞增殖及新附著生成等重要作用［1－3］，將其聯(lián)合應用于牙周局部藥物治療筆者尚未見報導。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是FDA認證的生物可降解高分子聚合物，具有良好的生物相容性和持久的緩釋能力［4］。復方多西環(huán)素緩釋凝膠以多西環(huán)素和骨碎補為主藥，PLGA為緩釋輔料制成凝膠，體外釋放試驗提示其緩慢釋放可長達7 d。本研究應用高效液相色譜法，檢測牙周上藥后不同時間齦溝液內多西環(huán)素的濃度，以確定凝膠的體內緩釋效應，指導臨床治療時復診給藥時間。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 島津LC-20AT高效液相色譜儀，Kromasil C18(100 mm ×4.6 mm，5 μm)，SPD-M20A 紫外檢測器，LCsolution色譜工作站，梅特勒AG-254電子天平。多西環(huán)素對照品(批號:0485-0401)由中國藥品生物制品檢定所提供。復方多西環(huán)素緩釋凝膠(含10%多西環(huán)素、骨碎補提取液和適量聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA75∶25)和復方多西環(huán)素凝膠(含10%多西環(huán)素和骨碎補提取液)均為自制。

1.2 方法

1.2.1 入選條件:按美國牙周病學會制定的牙周炎診治參照標準［5］，選擇我院門診患者中確診為中、重度慢性牙周炎病例11例，其中男6例，女5例;平均年齡48.7歲;入選患牙26顆。選擇標準:①無全身系統(tǒng)疾病，女性未妊娠或哺乳，無近期受孕計劃;②無四環(huán)素藥物過敏史;③口腔內至少有兩顆不在同一象限的牙齒牙周袋探診深度(PD)≥4 mm、牙齦探診出血(BOP)(+)，X線片顯示牙槽骨有不同程度的吸收;④3個月內未接受過牙周治療，未使用抗生素或非甾體類抗炎藥物;⑤患者了解本實驗過程，知情同意自愿參加本實驗。

1.2.2 試驗設計:本實驗采用同一患者口腔內病情相近牙齒的自身對照設計，將患者口內符合納入標準位于不同象限的牙位隨機分為實驗組和對照組。入選患者接受口腔衛(wèi)生宣教，進行徹底的基礎治療。1周后復診，0.9%氯化鈉溶液沖洗牙周袋，隔濕牙面，實驗組牙周上藥用復方多西環(huán)素緩釋凝膠，對照組牙周上藥用復方多西環(huán)素凝膠。上藥方法均為將凝膠注射器針頭輕輕插入牙周袋袋底，邊注射邊后退，至袋口有少許凝膠溢出，囑患者一小時內勿刷牙、漱口及進食。1周內每天定時采集齦溝液樣本一次進行藥物濃度測定。

1.2.3 齦溝液采集:將whatman3號濾紙裁成規(guī)格為2 mm×10 mm的濾紙條，將每兩個濾紙條置入一個Ep管中電子天平稱量(W1)，備用。隔濕，擦干牙面，將濾紙條分別置于頰側正中和舌側正中牙周袋口30 s取出，將濾紙條重新置入Ep管中并稱重(W2)。若有血液則棄去，重新釆集。齦溝液的量(W)=W2－W1，并按照1 mg/μl換算成體積，－70℃冰箱避光保存。

1.3 高效液相色譜法測定齦溝液內藥物濃度

1.3.1 液相色譜條件:色譜柱:Kromasil C18(100 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相:乙腈-1‰醋酸銨水溶液(50∶50)，調 pH 值到8.0 左右。流量:1.0 ml/min;柱溫:室溫;檢測波長:350 nm。

1.3.2 輔料干擾試驗:取不含多西環(huán)素的緩釋凝膠約0.1 g注射到甲醇溶液100 ml中，過濾，取濾液進樣20 μl。結果在波長350 nm下，輔料在多西環(huán)素的保留時間處無吸收，不干擾測定。

1.3.3 空白試驗:按齦溝液采集方法用濾紙條取治療后未上藥的齦溝液樣本，精密吸取200 μl甲醇溶液加入裝有樣品的Ep管，超聲處理30 min，8 000 r/min離心3 min，取上清液20 μl進樣。觀察在多西環(huán)素保留時間處無吸收峰，不干擾測定。見圖1。

圖1 GCF的色譜圖

1.3.4 標準曲線標準曲線:取多西環(huán)素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升中含多西環(huán)素1 000 μg的溶液，作為對照品溶液A。精密稱取對照品溶液A適量，用甲醇稀釋至濃度分別為 0、25、50、100、200、300、400、500 μg/ml，進樣20 μl測定峰面積，以峰面積對濃度進行線性回歸，得出回歸方程為:A=2710.7CX+11249，r=0.9995。結果表明，多西環(huán)素在0～500 μg/ml范圍內線性關系良好。見圖2A。

1.3.5 齦溝液樣品內多西環(huán)素濃度測定:精密吸取200 μl甲醇溶液加入裝有樣品的 Ep管，超聲處理30 min，使藥物充分溶出，8 000 r/min離心3 min，取上清液20 μl進樣。根據預先繪制的多西環(huán)素標準曲線計算出多西環(huán)素的濃度。見圖2B。

圖2 多西環(huán)素的色譜圖

2 結果

復方多西環(huán)素凝膠在用藥后第1天，齦溝液內多西環(huán)素濃度為309.71 μg/ml。到用藥后第3天，齦溝液內多西環(huán)素濃度已降至6.82 μg/ml。

復方多西環(huán)素緩釋凝膠在用藥后第1天，齦溝液內多西環(huán)素濃度為425.57 μg/ml，至用藥后第3天，多西環(huán)素的濃度仍高達208.31 μg/ml，到用藥后第7天，齦溝液內多西環(huán)素的濃度為60.46 μg/ml。見圖3。

圖3 應用兩種制劑后GCF內多西環(huán)素濃度的對比

3 討論

牙周袋內緩釋藥物的應用因其方便、無創(chuàng)、藥效持續(xù)時間長等優(yōu)點逐漸成為牙周病藥物治療的發(fā)展趨勢。牙周局部緩釋用藥的理想標準包括:藥物可持續(xù)釋放較長時間發(fā)揮作用，減少毒副作用;對牙周致病菌有較強的殺滅或抑制作用;可促進牙周組織再生;減少上藥頻率，提高患者依從性;藥物可貼附在牙周袋中不易脫落，無不適;緩釋載體有良好的生物相容性，可生物降解;劑型便于臨床操作，能深入牙周袋底及根分叉處等;但目前臨床尚沒有一種制劑能滿足這些要求［6，7］。

鹽酸多西環(huán)素不僅能抑制多種牙周致病菌，還能調節(jié)宿主防御反應，抑制膠原酶活性和骨吸收，可以減緩牙周組織炎癥時的組織破壞［1］。骨碎補具有促進骨折愈合、強骨補腎的功效。近年來很多研究發(fā)現(xiàn)骨碎補在牙周組織修復中起重要作用，它可以刺激成纖維細胞的附著和生長，另有實驗表明骨碎補可以抑制牙槽骨吸收，促進牙槽骨再生［2，3］。這些藥物在牙周組織的作用滿足了牙周局部制劑的治療需要。

將這些藥物局部應用并緩慢釋放需要一個合適的載體。PLGA是由兩種單體(乳酸和羥基乙酸)聚合而成的一種生物可降解高分子有機化合物，其降解產物為乳酸和羥基乙酸，并最終在人體中代謝為二氧化碳和水。由于其具有良好的生物相容性和生物可降解性且降解速度可控，PLGA材料已經通過FDA認證，被正式作為藥用輔料收錄進美國藥典，作為人工導管、藥物緩釋載體、組織工程支架材料被較為廣泛的應用［8，9］。1MP 作為溶劑，GTA 作為增塑劑，均有良好的生物降解性能，對凝膠最終的物理性狀起到重要作用，滿足了牙周局部凝膠應用方便，可深入牙周袋底部及根分叉區(qū)，藥物緩慢釋放，不易脫落，異物感小等要求。

由于多西環(huán)素遇光不穩(wěn)定，在整個試驗過程均應注意遮光操作，避免其分解。本實驗中復方多西環(huán)素緩釋凝膠注入牙周袋內凝結成膜狀，黏附于袋內壁不易脫落，結果表明該緩釋凝膠在牙周袋內可緩慢釋放，至第7天齦溝液內復方多西環(huán)素的濃度仍高達60.46 μg/ml，遠遠高于多西環(huán)素對多種牙周可疑致病菌的最低抑菌濃度 0.06 ～6 μg/ml［10］。緩釋凝膠中的緩釋輔料PLGA遇水凝結形成多孔道骨架，藥物可沿多孔道緩慢釋放，這在藥物緩釋中起了主要作用。對照組所用的復方多西環(huán)素凝膠比較黏稠，但很難成膜，上藥后牙周袋內多西環(huán)素的有效濃度也可維持2～3 d，這可能是GTA是凝膠遇水時收縮，凝聚，使藥物釋放減緩。由于中藥成分復雜，單個有效成分的釋放由于量比較微小很難監(jiān)測，因而骨碎補在牙周袋內的釋放有待于進一步探討。

1 曹采方主編.臨床牙周病學.第1版.北京:北京大學出版社，2006.279-280.

2 胡其勇，陳莉麗，王仁飛.骨碎補柚皮苷對人牙周韌帶細胞增殖和成骨分化潛能的影響.浙江大學學報(醫(yī)學版)，2010，39:79-83.

3 劉斌，司徒鎮(zhèn)強，吳軍正，等.枸杞和骨碎補對HGF體外附著影響.中華口腔醫(yī)學雜志，1992，27:159.

4 The United States Pharmacopoeia Commission Inc.The United States Pharmacopoeia 32-NF27.Rockville:The United States Pharmacopoeia Convention，2009.2212.

5 牙周病診治的參照標準.美國牙周病學會制定.中華口腔醫(yī)學會牙周病學專業(yè)委員會翻譯.2004.

6 毛永利，劉魯川.牙周藥物緩釋系統(tǒng)研究進展.口腔醫(yī)學，2008，28:271-272.

7 Jain N，Jain GK，Javed S，et al.Recent approaches for the treatment of periodontitis.Drug Discov Today，2008，13:932-943.

8 Li M，Panagi Z，Avgoustakis K，et al.Physiologically based pharmacokinetic modeling of PLGA nanoparticles with varied mPEG content.Int J Nanomedicine，2012，7:1345-1356.

9 Khoee S，Rahmatolahzadeh R.Synthesis and characterization of pH-responsive and folated nanoparticles based on self-assembled brush-like PLGA/PEG/AEMA copolymer with targeted cancer therapy properties:A comprehensive kinetic study.Eur J Med Chem.2012，50:416-427.

10 Demetrick W，F(xiàn)rank J，Maria F，et al.In Vitro Activity of Amoxicillin，Clindamycin，Doxycycline，Metronidazole，and Moxifloxacin Against Oral Actinomyces.J Endod，2007，33:557-560.