低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5對(duì)骨的影響

吳學(xué)倫，朱曉燕(綜述)，薛 鵬，李玉坤*(審校)

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院內(nèi)分泌二科，河北省骨科生物力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050051；2.河北省邢臺(tái)市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北 邢臺(tái) 054000)

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(low density lipoprotein receptor related protein，LRP5)是低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白家族成員之一，表達(dá)于人類多種組織細(xì)胞，以肝臟、胰腺最多。在骨中主要表達(dá)于骨內(nèi)膜和骨小梁表面的成骨細(xì)胞，尚未發(fā)現(xiàn)在破骨細(xì)胞表達(dá)。LRP5與果蠅生長(zhǎng)因子Wingless共受體Arrow序列同源，它是由1 615個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白，由一個(gè)假定的信號(hào)肽、4個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)樣重復(fù)序列、3個(gè)低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)重復(fù)序列跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)部分組成。人LRP5進(jìn)化高度保守，與小鼠LRP5的蛋白序列95 %同源[1]。

1 LRP5概述

LRP5功能缺失突變會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥假神經(jīng)膠質(zhì)瘤(osteoporosis pseudoglioma syndrome，OPPG)，OPPG是一種骨形成嚴(yán)重減少和胚胎期視血管持續(xù)形成進(jìn)而導(dǎo)致低骨量和失明的罕見疾病[2]。另外，LRP5功能獲得突變會(huì)導(dǎo)致一種高骨量綜合征(high bone mass syndrome，HBM)，HBM具有非常高的骨量，耐高沖擊性骨折(比如車禍)，并且游泳時(shí)不能浮在水面上[3]。同種基因的不同突變導(dǎo)致兩種性質(zhì)相反的骨骼疾病，表明LRP5通路對(duì)骨形成及骨量至關(guān)重要。

LRP5通過成骨細(xì)胞Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨量。LRP5(和同源LRP6)與卷曲蛋白(frizzled)一起作為Wnt蛋白的共受體。Wnt與LRP5-frizzled共受體結(jié)合使糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase，GSK-3β)失活，導(dǎo)致β-catenin的胞質(zhì)積累，隨后β-catenin轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核影響基因轉(zhuǎn)錄。實(shí)驗(yàn)[4]表明，LRP5為成骨細(xì)胞Wnt信號(hào)和β-catenin激活所必需，其基因突變阻礙了LRP5內(nèi)化及與其他配體Dkk1等的結(jié)合。LRP5與Arrow序列同源，Wnt蛋白啟動(dòng)的LRP5和Axin交互細(xì)胞實(shí)驗(yàn)同樣表明，LRP5是Wnt蛋白的一個(gè)共受體。因此，OPPG和HBM被視為Wnt相關(guān)疾病。

然而，某些實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果與這一觀點(diǎn)相矛盾。第一，與大多數(shù)Wnt蛋白功能發(fā)展形成鮮明對(duì)比的是，LRP5功能缺失突變(LRP5-/-)胚胎并沒有明顯的骨骼缺損；第二，功能獲得性LRP5基因突變不會(huì)引起骨腫瘤，Wnt信號(hào)通路在其他器官的活化則可能會(huì)導(dǎo)致骨腫瘤的發(fā)生[5]；第三，成骨細(xì)胞經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的分子節(jié)點(diǎn)β-catenin的特定缺失和功能獲得突變，既不影響骨形成，也不影響LRP5特異性失活所引發(fā)的失控基因的表達(dá)[6]。這些研究結(jié)果表明，LRP5和經(jīng)典Wnt信號(hào)通路通過不同機(jī)制調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的功能。

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是產(chǎn)生于腦干神經(jīng)元和腸嗜鉻細(xì)胞的一種活性胺，不能通過血腦屏障。因此，由于其合成的部位不同，它實(shí)際上具有2種功能特性，大腦產(chǎn)生的5-HT參與人的認(rèn)知功能；而占總數(shù)95%的腸道5-HT，即腸源性血清素(gut derived serotonin，GDS)的功能，目前尚存爭(zhēng)議。GDS生物合成途徑與限速酶色氨酸羥化酶1(tryptophan hydroxylase 1，Tph1)有關(guān)。GDS釋放、彌散于血液中，大多數(shù)通過特定運(yùn)輸途徑被血小板攝取、儲(chǔ)存，另外在血清中游離的一小部分，與靶細(xì)胞的5-HT受體(5-hydroxytryptamine receptor，HTR)結(jié)合發(fā)揮作用。值得注意的是，長(zhǎng)期服用5-HT再攝取抑制劑(serotonin specific reuptake inhibitor，SSRIs)的患者，其細(xì)胞外5-HT的濃度增加，而骨量減少[7]。另外，在尋找解釋LRP5調(diào)節(jié)骨形成的分子機(jī)制過程中，Yadav等[8]確定Tph1是LRP5-/-模型中骨組織過度表達(dá)程度最高的基因；Tph1在敲除LRP5的十二指腸細(xì)胞中表達(dá)也會(huì)增加。抑制LRP5-/-小鼠的5-HT合成能糾正其骨表型，腸道特定敲除LRP5 能復(fù)制LRP5-/-小鼠的骨表型，但在成骨細(xì)胞敲除則不能。5-HT結(jié)合到HTR1B受體，通過調(diào)節(jié)CyclinD1分子的表達(dá)，影響成骨細(xì)胞增殖，最終決定骨形成的程度。

2 LRP5突變導(dǎo)致的骨骼疾病

LRP5突變主要導(dǎo)致2種骨骼疾病的發(fā)生：一種是常染色體隱性遺傳疾病——OPPG，以出生早期出現(xiàn)的視力損害及骨脆性增加為特點(diǎn)；另一種是常染色體顯性遺傳疾病——HBM，主要影響長(zhǎng)骨和顱骨的皮質(zhì)骨。這兩種疾病的分子決定因素都映射到11號(hào)染色體相同的區(qū)域，后來被證實(shí)為L(zhǎng)RP5編碼區(qū)。

OPPG患者的LRP5基因突變，導(dǎo)致LRP5功能缺失和Wnt信號(hào)活動(dòng)減少，進(jìn)而導(dǎo)致成骨細(xì)胞活動(dòng)減少，這與在小鼠模型中特定破壞LRP5的骨骼表型相一致[9]。HBM表型患者雜合LRP突變的分子特點(diǎn)表明，此突變發(fā)生于LRP5結(jié)構(gòu)中一個(gè)進(jìn)化高度保守的區(qū)域，形成一個(gè)β螺旋結(jié)構(gòu)，通過此結(jié)構(gòu)，LRP5與Dkk1相互作用。體外試驗(yàn)進(jìn)一步證明，在LRP5錯(cuò)義突變情況下，Dkk1對(duì)Wnt信號(hào)的正常抑制發(fā)生缺陷，從而導(dǎo)致Wnt信號(hào)和成骨細(xì)胞活動(dòng)增加，這一結(jié)論在LRP5突變小鼠的成骨細(xì)胞系細(xì)胞中得以證實(shí)[10]。后續(xù)7個(gè)不同的LRP5基因突變的分子特性呈現(xiàn)出一種明顯的HBM，表明LRP5突變蛋白減少了與Dkk1的交互作用且受Dkk1的抑制程度降低。

與上述發(fā)現(xiàn)相一致，最近的研究也表明，在骨細(xì)胞中含有特定OPPG錯(cuò)義突變的LRP5表達(dá)的小鼠，會(huì)導(dǎo)致骨量丟失；在晚期成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中含有特定HBM錯(cuò)義突變的LRP5表達(dá)的小鼠，會(huì)導(dǎo)致骨量增加。另外，LRP5 似乎作用于其局部微環(huán)境，因?yàn)長(zhǎng)RP5的HBM形式特定限制在外周骨，導(dǎo)致外周骨量的增加，對(duì)中樞骨量沒有影響[11]?？傊换騆RP5的突變導(dǎo)致本質(zhì)完全相反的骨疾病(低或高骨質(zhì))，均能表明LRP5在骨形成中的重要作用。

3 LRP5對(duì)骨的直接作用

2個(gè)不同研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)觀察到LRP5獲得性突變對(duì)骨骼的直接影響。Yadav等[12]把G171V敲進(jìn)cDNA的LRP5基因突變編碼區(qū)域，其模型優(yōu)勢(shì)在于有一個(gè)環(huán)狀5′-端的cDNA終止序列，以致G171V等位基因的表達(dá)能在特定組織通過cre介導(dǎo)重組被激活。Babij等[13]使用3.6kol鼠Ⅰ型膠原蛋白啟動(dòng)子在小鼠成骨細(xì)胞過表達(dá)人類LRP5-G171V功能突變。這種轉(zhuǎn)基因小鼠成骨細(xì)胞呈現(xiàn)HBM表型。此外，成骨細(xì)胞的野生型受體的過度表達(dá)也會(huì)增加骨量，然而與G171V誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的過表達(dá)程度不同。這些觀察盡管與Yadav等[12]研究結(jié)果不同，但都表明LRP5有直接的骨骼效應(yīng)。鑒于動(dòng)物模型之間的差異，LRP5及其功能獲得性突變可能只在過量時(shí)存在直接的骨骼效應(yīng)，而不是在生理水平。另外，兩者的差異可能源于不同系種、不同階段成骨細(xì)胞啟動(dòng)子的利用。成骨細(xì)胞譜系LRP5信號(hào)通路有可能在的早期階段是必需的，而Yadav等[8]在LRP5對(duì)早期骨骼施加直接影響后，才開始驅(qū)動(dòng)成骨細(xì)胞LRP5突變。

LRP5-/-小鼠原代成骨細(xì)胞機(jī)械負(fù)荷反應(yīng)改變表明，LRP5對(duì)骨骼存在直接作用[14]。機(jī)械負(fù)荷和其他刺激可能產(chǎn)生一個(gè)局部環(huán)境刺激LRP5直接骨骼效應(yīng)。

研究表明LRP5是一個(gè)真正的Wnt受體。然而，是否經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑足夠解釋LRP5突變對(duì)骨量的影響？盡管LRP5缺失的純合子小鼠(具有與OPPG患者相似的特點(diǎn))出生后骨量低源于成骨細(xì)胞數(shù)量和活動(dòng)較少，而早期或晚期成骨或骨細(xì)胞β-catenin缺失小鼠的骨量減少，主要是由于骨吸收增加而不是骨形成減少。而且，骨Wnt針對(duì)性去除引起的骨吸收增加，至少部分是由于破骨細(xì)胞分化因子配體(nuclear factor-κB ligand，RANKL)的激活和骨分化抑制劑骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)表達(dá)的減少[6, 15]。有趣的是，應(yīng)該注意成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞β-catenin缺失小鼠骨吸收增加和骨量減少，與包含一個(gè)自發(fā)的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(low density lipoprotein receptor related protein，LRP6)次等位基因突變小鼠骨表型非常類似。因此，LRP5和LRP6是否以同樣的方式調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)？LRP5在成骨細(xì)胞內(nèi)作用是否增強(qiáng)成骨細(xì)胞活動(dòng)和骨形成？LRP6在成骨細(xì)胞內(nèi)作用是否限制破骨細(xì)胞的功能？上述問題仍有待進(jìn)一步研究[16-17]。

4 LRP5對(duì)骨的間接作用

LRP5-/-小鼠骨細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)下降。據(jù)報(bào)道，LRP5-/-小鼠成骨細(xì)胞缺乏，而從LRP5-/-小鼠分離的成骨細(xì)胞體外增殖正常，所以可能是成骨細(xì)胞外信號(hào)導(dǎo)致了LRP5-/-成骨細(xì)胞增殖的減少。Tph1是在LRP5-/-骨中表達(dá)差異最大的基因，而且LRP5-/-小鼠在十二指腸也有Tph1表達(dá)并隨5-HT水平升高。高水平5-HT抑制LRP5-/-和野生型小鼠體外成骨細(xì)胞的增殖，而LRP5-/-小鼠低色氨酸飲食或給予5-HT的合成抑制劑后表現(xiàn)出5-HT濃度降低和骨骼表型的正常。這些結(jié)果初步證明高水平的5-HT抑制LRP5-/-小鼠骨形成，導(dǎo)致其骨量下降[18]。

為研究LRP5、5-HT與骨之間聯(lián)系，從而培育出腸道或成骨細(xì)胞特定LRP5功能缺失或增強(qiáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠。腸道LRP5特定剔除，呈現(xiàn)出5-HT高循環(huán)水平與LRP5-/-小鼠骨骼表型，成骨細(xì)胞特定剔除則沒有出現(xiàn)上述結(jié)果。相反，通過插入編碼HBM突變的LRP5-G171V cDNA使腸道LRP5過表達(dá)，5-HT濃度降低并產(chǎn)生高骨表型，成骨細(xì)胞特定表達(dá)則沒有出現(xiàn)上述結(jié)果。上述研究結(jié)果證實(shí)，LRP5通過影響腸道間接調(diào)節(jié)骨形成。確定5-HT作為腸道LRP5和骨骼的介質(zhì)后，腸道特定刪除Tph1降低5-HT循環(huán)水平并產(chǎn)生高骨質(zhì)量表型，而成骨細(xì)胞Tph1特定刪除則沒有[4]。

升高的5-HT作為一種激素，作用于成骨細(xì)胞抑制骨形成。成骨細(xì)胞膜表面表達(dá)3種5-HT受體：HTR1B、HTR2A和HTR2B。小鼠全部HTR2A基因刪除或成骨細(xì)胞特定HTR2B刪除，并不顯示骨骼表型；然而，小鼠成骨細(xì)胞特定刪除或全身至少HTR1B基因的一個(gè)等位基因的剔除，顯示與腸道HBM LRP5-G171V基因突變小鼠類似的HBM表型。這表明HT1B調(diào)節(jié)5-HT受體介導(dǎo)的成骨細(xì)胞效應(yīng)。體外研究證實(shí)，來自HTR2A和HTR2B缺失突變小鼠的原代成骨細(xì)胞對(duì)5-HT的應(yīng)答，與野生動(dòng)物的成骨細(xì)胞類似，而HTR1B缺失突變小鼠成骨細(xì)胞對(duì)5-HT特定介質(zhì)反應(yīng)遲鈍。隨后研究顯示，5-HT信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子是成骨細(xì)胞cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)，能夠雙向調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。5-HT結(jié)合HTR1B，抑制CREB表達(dá)，進(jìn)而抑制D型細(xì)胞周期蛋 白1(cyclin D1，CycD1)表達(dá)和成骨細(xì)胞增殖[19]。

Yadav等[8]研究表明，LRP5通過調(diào)節(jié)5-HT的水平，從而影響骨代謝，上述過程主要發(fā)生在十二指腸，而不是骨內(nèi)；Cui等[11]研究表明，在腸干細(xì)胞(產(chǎn)生5-HT的腸嗜鉻細(xì)胞的干細(xì)胞)，兩種截然不同的HBM LRP5突變，并沒有產(chǎn)生HBM表型；缺失LRP5純合子小鼠在這些腸干細(xì)胞沒有顯型表達(dá)；HBM LRP5等位基因表達(dá)的小鼠與野生型小鼠的5-HT循環(huán)水平未發(fā)現(xiàn)明顯差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，HBM骨密度增加，敲除骨細(xì)胞的LRP5會(huì)導(dǎo)致骨量減少；四肢骨細(xì)胞中LRP5基因突變表達(dá)會(huì)造成骨量改變，椎骨則沒有。降低循環(huán)和腸內(nèi)5-HT水平，并不影響皮質(zhì)或骨小梁質(zhì)量；也不影響骨形成的生化標(biāo)記物[20]。

基于上述爭(zhēng)議，Korvala等[21]利用體外細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)一步研究LRP5新發(fā)突變?cè)贚RP5產(chǎn)生、Wnt信號(hào)通路和Tph1及HTR1B基因表達(dá)中的效應(yīng)。18個(gè)無成骨不全(Osteogenesis imperfecta，OI)特性的原發(fā)性兒童骨質(zhì)疏松癥患者，LRP5兩個(gè)新發(fā)突變(c.3446T>A；p.L1149Q和c.3553G>A；p.G1185R)被確定存在于2個(gè)患者和其家族成員中。體外分析表明，新突變與之前報(bào)道的突變(p.C913fs，p.R1036Q)顯著降低經(jīng)典Wnt信號(hào)通路活動(dòng)。結(jié)果導(dǎo)致骨形成減少，骨表型變化。腸源性LRP5曾被證實(shí)可通過調(diào)節(jié)Tph1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)5-HT的合成。而此研究表明，LRP5突變沒有影響Tph1表達(dá)，只有一種突變(p.L1149Q)降低了HTR1B的表達(dá)。同時(shí)Boudin等[22]評(píng)估HTR1B和Tph1在顱骨肥大(一組單基因硬化性骨病)發(fā)展中的作用。他們對(duì)53例缺乏已知致病基因LRP5，LRP4和SOST突變的2個(gè)基因編碼區(qū)進(jìn)行篩選，并沒有發(fā)現(xiàn)致病變異編碼區(qū)。因此，尚不能證明Tph1和HTR1B在測(cè)試患者人群中對(duì)硬化性骨病的重要影響。

5 小 結(jié)

為什么不同研究機(jī)構(gòu)的研究結(jié)果差異如此之大，目前還不清楚?？赡軞w因于Cre重組酶在小鼠啟動(dòng)子定位的差異，以及基因結(jié)構(gòu)、小鼠模型、測(cè)量骨密度的方法、骨測(cè)試的方法、小鼠的生長(zhǎng)環(huán)境和5-HT測(cè)定技術(shù)的不同等。LRP5究竟如何調(diào)節(jié)骨量？是直接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞譜系細(xì)胞，還是通過內(nèi)分泌或旁分泌信號(hào)間接調(diào)節(jié)？有待進(jìn)一步深入研究。

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