不同固定方法制作大鼠眼球組織石蠟切片的比較

張亞楠，王子鳴，任廣偉，李 航，郭淺妤，張 雷*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050031)

眼球是一種構(gòu)造復(fù)雜的器官，其各部位的結(jié)構(gòu)和密度不同，且各層次間的依附性和連接性較差[1]。大鼠眼球組織的石蠟切片被廣泛應(yīng)用于眼科相關(guān)疾病的實(shí)驗(yàn)研究，而常規(guī)石蠟切片方法極易造成眼球變形，各層次之間結(jié)構(gòu)分離、移位，特別是固定液性的視網(wǎng)膜脫落，給組織病理學(xué)的診斷帶來很大的阻礙。對(duì)此，我們結(jié)合眼球的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及以往的文獻(xiàn)報(bào)道[1-10]，比較了3種不同的固定方法，總結(jié)出較適合制作大鼠眼球石蠟切片的固定方法，有效地提高了大鼠眼球石蠟切片的質(zhì)量，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料：動(dòng)物，Sprague-Dawley(SD)大鼠，15只，雌雄不限，2～4周齡，體質(zhì)量100g，購(gòu)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按照不同的固定方法分為A組，10只眼球，用固定液1固定；B組，10只眼球，用固定液2固定；C組，10只眼球，用固定液3固定。固定液1，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇85mL，體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛10mL，冰醋酸5mL充分混勻[2]。固定液2，多聚甲醛4g加入0.1mol/L磷酸緩沖液100mL，加熱至60℃左右，使粉末完全溶解。固定液3，多聚甲醛4g加入0.1mol/L磷酸緩沖液80mL，加熱至60℃左右，持續(xù)攪拌，使粉末完全溶解，加少許1mol/L氫氧化鈉澄清。待冷卻后，加冰醋酸5mL、丙酮10mL，用0.1mol/L磷酸緩沖液補(bǔ)足至100mL[3]。

1.2 方法

1.2.1 取材與固定：將SD大鼠脫頸處死后，用無齒眼科鑷摘除眼球，保留約5mm的視神經(jīng)，用角鞏膜剪剪去眼球周圍組織[4]，按照上述分組方法用不同固定液分別固定3組眼球，在固定4～5h后，用1mL注射器抽取3組各自的固定液由角鞏膜緣向眼球內(nèi)注射入少量固定液。所有標(biāo)本在固定24h后，用蒸餾水沖洗3次，每次30min。隨后分別在體積分?jǐn)?shù)為55%、65%、75%、85%、95%乙醇中室溫脫水，各級(jí)3h，無水乙醇中脫水2次，每次2h。二甲苯透明30min，60℃浸蠟3h，包埋，低溫保存待切。

1.2.2 切片染色：用LEICA RM 2245輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片，厚約5μm，40～45℃水浴展片，45℃烤片3h，快速脫蠟至水，蘇木精染液染色5min，1%鹽酸酒精分化10s，1%氨水藍(lán)化3min，1%醇溶性伊紅染液染色3min，快速梯度乙醇脫水各5min，二甲苯透明10min，中性樹膠封片，顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié) 果

A組眼球大體結(jié)構(gòu)及晶狀體保存尚可，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)均能顯示，但存在視網(wǎng)膜部分脫離、碎裂情況，視網(wǎng)膜各層排列疏松，有裂隙存在(圖1，2)；B組眼球結(jié)構(gòu)破損，視網(wǎng)膜出現(xiàn)大面積的脫離及卷折，大量碎裂，不能清晰顯示各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，且視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)被壓縮，染色深，細(xì)胞間界限不清，晶狀體破碎，但角膜各層結(jié)構(gòu)完整清晰(圖3，4)；C組眼球各層結(jié)構(gòu)保持完整，無碎裂，晶狀體完整，可顯示晶狀體上皮，視網(wǎng)膜各層無脫離、卷折，且各層細(xì)胞排列整齊，無壓縮，染色鮮艷，層次分明，細(xì)胞界限清晰，角膜、虹膜、睫狀肌、鞏膜靜脈竇等組織結(jié)構(gòu)均較清晰(圖5，6)。

3 討 論

視網(wǎng)膜位于眼球壁的最內(nèi)層，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由10層結(jié)構(gòu)組成。在常規(guī)石蠟切片的制作中，由于眼球各部位的結(jié)構(gòu)和密度不同，質(zhì)地軟硬度相差懸殊，對(duì)固定液及不同濃度乙醇處理發(fā)生的反應(yīng)不同，極易造成眼球變形，各層之間結(jié)構(gòu)分離、移位及視網(wǎng)膜脫落[5]。因此，選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ杭懊撍畡┑臐舛取⒖刂坪妹撍畷r(shí)間是制作出結(jié)構(gòu)完整的眼球石蠟切片的關(guān)鍵[6]。眼球標(biāo)本必須將整個(gè)眼球固定后才能進(jìn)行剖切，故需要固定液有很強(qiáng)的滲透力，能夠快速穿透眼球?qū)⒏鲗咏M織固定。固定液1中含有冰醋酸和高濃度乙醇，冰醋酸的組織滲透性強(qiáng)[7]，但會(huì)使組織迅速膨脹，因此要求固定時(shí)間要相應(yīng)縮短，乙醇對(duì)組織有收縮作用[8]，可以部分抵消冰醋酸對(duì)組織的膨脹作用。但本實(shí)驗(yàn)中A組結(jié)果顯示存在視網(wǎng)膜部分脫離、碎裂的情況，可能是由于高濃度乙醇的收縮作用太強(qiáng)，過多地抵消了冰醋酸對(duì)組織的膨脹作用。固定液2為4%多聚甲醛，其固定眼球時(shí)由于滲透壓較大，對(duì)組織收縮作用強(qiáng)，造成眼球內(nèi)外壓力不同，使眼球變形，視網(wǎng)膜脫落、卷折，形成固定液性的視網(wǎng)膜脫落[9]，但其對(duì)角膜結(jié)構(gòu)的固定較為理想，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。固定液3中加入了丙酮，使固定液更為溫和，組織收縮幅度小，并且滲透力迅速而均勻，組織不易出現(xiàn)變脆現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)證明，固定液3固定的組織制作的石蠟切片的質(zhì)量明顯優(yōu)于固定液1、2。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)中采用于固定4～5h后由角鞏膜緣向眼球內(nèi)注射固定液的方法，一方面可以使固定液更好地向球內(nèi)各層組織滲透，另一方面可以使眼球內(nèi)保持一定的壓力，維持眼球的形狀，防止視網(wǎng)膜脫離。脫水時(shí)應(yīng)從較低體積分?jǐn)?shù)的乙醇開始[10]，且濃度差越小越好，逐級(jí)脫水至無水乙醇，這樣可以減少由于乙醇濃度驟升后引起的細(xì)胞收縮，避免引起視網(wǎng)膜脫離。同時(shí)，浸蠟時(shí)應(yīng)選用熔點(diǎn)較低的軟蠟，以減輕因浸蠟溫度過高、時(shí)間過長(zhǎng)引起的組織收縮。

本實(shí)驗(yàn)表明固定液3的固定效果優(yōu)于其他2種固定液，并且操作方法較為簡(jiǎn)單，所用試劑均為實(shí)驗(yàn)室常備試劑，無毒無害，所制作的切片結(jié)構(gòu)完整，便于觀察，是固定大鼠眼球組織，制作病理切片的較好方法。(本文圖見封二)

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