黃喉擬水龜摩氏摩根菌的分離鑒定及藥敏試驗

蘭 云 胡秀彩 呂愛軍 沈曉靜 朱愛華 馮照軍

(江蘇師范大學生命科學學院, 徐州221116)

黃喉擬水龜摩氏摩根菌的分離鑒定及藥敏試驗

蘭 云 胡秀彩 呂愛軍 沈曉靜 朱愛華 馮照軍

(江蘇師范大學生命科學學院, 徐州221116)

黃喉擬水龜(Mauremys mutica), 俗稱石龜、石金錢龜、黃板龜等, 為龜科擬水龜屬, 主要分布于中國江蘇、安徽、福建以及越南、日本等。黃喉擬水龜具有食用、藥用和觀賞價值, 近年來野生資源日趨減少, 人工養(yǎng)殖發(fā)展迅速。細菌性病原感染是黃喉擬水龜養(yǎng)殖過程中常見疾病, 目前已報道黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)[1]、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)[2]、摩氏摩根菌(Morganella morganii)[3]、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophmomas maltophilia)和腦膜炎膿毒性黃桿菌(Flavobacterium meningosepticum)[4]等可引起黃喉擬水龜感染發(fā)病。

2013年3—4月, 江蘇省徐州市某養(yǎng)殖場暴發(fā)黃喉擬水龜細菌性慢性傳染病, 病龜臨床表現為頭肢部潰爛、蛻皮, 爪脫落, 眼睛感染嚴重以致失明, 行動遲緩、食欲廢絕, 有濃重腥臭味, 引起零星死亡。為確定該病病原菌,通過細菌分離鑒定、生化特性及16S rDNA序列分析以及構建系統(tǒng)發(fā)育樹等方法進行系統(tǒng)鑒定。本文進行摩氏摩根菌的分離鑒定、藥敏試驗及動物感染試驗等研究, 以期為黃喉擬水龜細菌性疾病的診斷與防治提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物及癥狀觀察 江蘇省徐州市某養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的黃喉擬水龜發(fā)生細菌性感染疾病, 導致病龜零星死亡, 以發(fā)病黃喉擬水龜為試驗動物, 并觀察記錄病龜癥狀。健康稚龜購自徐州市某花鳥市場, 體重約為8.5 g, 體長約4.5 cm。

試驗試劑 LB培養(yǎng)基、細菌生化鑒定管和藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司; PCR反應試劑2×Taq PCR MasterMix購自南京諾唯贊生物科技有限公司, 細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司; 受體菌 DH5α由實驗室保存; DNA Marker、pMD18-T克隆載體購自TaKaRa公司; 引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2 方法

病原菌分離與純化 參考李楠等方法進行[5], 病龜體表病灶用無菌生理鹽水沖洗, 取病灶組織劃線接種于LB培養(yǎng)基, 29℃恒溫培養(yǎng)24h; 無菌操作從肝臟、心臟取樣, 劃線接種于LB培養(yǎng)基, 29℃恒溫培養(yǎng)24h。挑取典型單菌落分離純化, 獲得純種后進行革蘭氏染色鏡檢,并接種于試管斜面保存、備用。

細菌生理生化及藥敏試驗 參考譚愛萍等方法進行[6], 無菌操作挑取適量細菌接種于細菌生化鑒定管, 29℃恒溫培養(yǎng)48h, 觀察記錄結果。采用K-B法進行藥敏試驗, 選用24種抗生素對3株細菌進行藥敏試驗, 29℃培養(yǎng)24h, 測量各種藥物的抑菌圈直徑, 多次測量取平均值,以判定藥物對細菌的抑制作用。

16S rDNA基因克隆測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌總DNA, 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測, －20℃保存?zhèn)溆?。以總DNA為模板,采用細菌通用引物進行 16S rDNA基因擴增, 正向引物F27: AGTTTGATCATGGCTCAG, 反向引物R1492: GTTA CCTTGTTACGACTT。PCR體系: 2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL, 上、下游引物各1 μL, DNA模板1 μL, ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件: 94℃預變性4min、94℃變性40s、55℃復性 40s、72℃延伸 1min, 35個循環(huán)后 72℃延伸10min。PCR產物與pMDl8-T載體連接, 轉化大腸埃希菌DH5α, 篩選陽性克隆, 送上海生工生物工程有限公司測序。分離菌16S rDNA序列通過BLAST和Clustalx l.83軟件進行16S rDNA序列比對分析, 采用MEGA.4軟件鄰接法(Neighbor-joining method)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

動物感染試驗 將3株分離菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基29℃培養(yǎng)12h, 取0.5 mL菌液倍比稀釋, 傾注平板法測定菌液濃度, 用生理鹽水稀釋至 1.0×109cfu/mL和1.0×108cfu/mL。稚龜感染試驗采用腹腔注射法, 每只稚龜注射菌液 0.1 mL, 對照組注射 0.1 mL無菌生理鹽水;飼養(yǎng)溫度約為25 , ℃ 連續(xù)觀察15d、記錄實驗結果。同時對發(fā)病死亡的稚龜進行細菌再分離鑒定。

2 結果

2.1 病龜癥狀及病原菌分離

2013年3—4月, 徐州某養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的黃喉擬水龜發(fā)病, 臨床癥狀主要表現為慢性感染(圖 1): 頭部、四肢、尾部及甲殼邊緣部皮膚潰爛, 皮膚組織變白、蛻皮, 有嚴重的腥臭味; 進一步感染頸部潰爛穿孔, 四肢肌肉、骨骼外露, 爪脫落, 導致零星死亡; 病理解剖可見病龜心臟、肝臟腫大, 肝臟呈暗黑色。

圖1 黃喉擬水龜體表癥狀(箭頭為病灶處)Fig. 1 The clinical signs of Mauremys mutica (arrows indicate local lesions)

從黃喉擬水龜病灶處分離得到 1株細菌, 編號為TMM13032; 從心臟、肝臟中各得到1株細菌, 分別編號為TMM13033、TMM13034。3株分離菌在LB培養(yǎng)基上生長良好, 29℃培養(yǎng)24h后菌落均呈乳白色、半透明、中間凸起、表面光滑、濕潤、邊緣整齊; 3株細菌均為革蘭氏染色陰性, 直桿菌(圖2)。

圖2 TMM13033菌株的菌落及菌體形態(tài)Fig. 2 The individual cell and colonies morphologic characteristics of the TMM13033 strain

2.2 生理生化特性

選用35項細菌生化編碼鑒定管對分離菌進行生化特性檢測, 結果表明TMM13032、TMM13033、TMM13034菌株的生理生化特性基本一致, 能利用葡萄糖產酸產氣,有運動性, 發(fā)酵型, MR試驗、枸櫞酸鹽、脲酶、鳥氨酸、ONPG、硝酸鹽還原和DNA酶試驗均為陽性(表1)。以上3株分離菌的培養(yǎng)特性、生理生化特性, 基本符合《伯杰細菌鑒定手冊》描述的摩根菌屬(Morganella)特征[7]。

圖3 三株分離菌的基因組DNA及16S rDNA的PCR擴增結果Fig. 3 The results of genomic DNA and 16S rDNA PCR amplification of the three strains

2.3 菌株16S rDNA基因擴增、測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以3株分離菌基因組DNA為模板, 采用PCR方法擴增其16S rDNA序列, 電泳檢測在1500 bp處出現目的條帶(圖3), 測序獲得 TMM13032、TMM13033、TMM13034菌株16S rDNA片段大小分別為1506、1507、1507 bp, 序列遞交至 GenBank數據庫的登錄號分別為KF611894、KF611895、KF611896。將16S rDNA序列通過 Blast軟件進行序列同源性檢索, TMM13032、TMM13033、TMM13034菌株與摩氏摩根菌(Morganellamorganii)模式株ATCC25830(登錄號: AJ301681)同源性分別為98.93%、99.67%、99.07%; 選擇14個標準菌株16S rDNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹, TMM13032、TMM13033、TMM13034與摩氏摩根菌(M. morganii)自然聚為一支(圖4), 結合3株分離菌的理化特征, 鑒定均為摩氏摩根菌。

2.4 動物感染及藥敏試驗結果

動物感染試驗分別以菌液濃度為108、109cfu/mL感染稚龜, 結果表明3株摩氏摩根菌感染2d后出現精神萎。頓、行動遲緩、食欲不振, 個別眼睛有分泌物等癥狀, 感染 3d后出現死亡現象, 死亡率為 33.3%—66.7% (表 2),并且從死亡龜中重新分離獲得摩氏摩根菌; 對照組稚龜均未發(fā)病死亡。

選用24種抗生素進行藥敏試驗, 結果顯示3株分離菌對哌拉西林、頭孢哌酮、丁胺卡那霉素、慶大霉素、卡那霉素、乙基西梭霉素、諾氟沙星7種抗生素敏感, 對氨芐西林、頭孢噻吩、頭孢孟多、替考拉寧、阿奇霉素、紅霉素、制菌霉素、四環(huán)素、萘啶酸、利福平、克林霉素、呋喃妥因、復方新諾明、潔霉素 14種抗生素耐藥; 此外, 病灶分離株TMM13032對氯霉素、磺胺異惡唑、甲氧芐啶3種抗生素敏感, 而TMM13033、TMM13034菌株耐藥(表3)。

表1 三株分離菌株的生化反應結果Tab. 1 The biochemical reaction results of the three isolates

表2 三株分離菌的動物感染試驗結果Tab. 2 Results of animal infection test of the three isolates

3 討論

摩氏摩根菌(Morganella morganii)為腸桿菌科細菌,廣泛分布于水、土壤及人和動物糞便中, 是引起嚴重感染的條件致病菌之一, 主要引起人尿路感染和術后傷口感染。目前, 關于摩氏摩根菌對水生動物的致病機制研究,尚未見相關文獻報道。Chen等從術后感染敗血癥病人血液中分離到摩氏摩根菌[8]。Zhao等從病雞肝臟組織及分泌物中分離病原菌, 通過生化特性、16S rDNA序列分析確定為摩氏摩根菌[9]。趙耘等從患病袋鼠肺臟中分離到3株摩氏摩根菌, 其 16S rDNA 基因序列與模式株LMG7874同源性為 99.8%[10]。研究表明, 摩氏摩根菌可引起多種養(yǎng)殖水生動物感染發(fā)病, 是水生動物重要病原菌之一?？桌俚葟闹腥A鱉癤瘡病灶及內臟中分離到摩氏摩根菌, 通過稚鱉感染試驗證實該菌具有較強致病性[11]。黎小正等從發(fā)病黃喉擬水龜肝、肺中分離到摩氏摩根菌, 通過動物感染試驗確定為病原菌[3]。本研究從發(fā)病黃喉擬水龜體表及內臟中分離到摩氏摩根菌(M. morganii), 這與摩氏摩根菌感染引起龜死亡的相關報道基本一致[3,11]。

近年來, 水生病原菌耐藥性不斷增強, 進一步增加了臨床治療難度。本試驗對分離菌進行藥敏試驗, 旨在篩選有效治療藥物, 結果顯示3株摩氏摩根菌對哌拉西林、頭孢哌酮、丁胺卡那霉素、慶大霉素、卡那霉素等抗生素高度敏感?？桌俚冗M行中華鱉摩氏摩根菌藥敏試驗, 證實對氨曲南、氟苯尼考、頭孢哌酮等藥物敏感[11]。Zhao等發(fā)現雞源摩氏摩根菌對頭孢哌酮、新霉素、諾氟沙星、鏈霉素等抗生素敏感[9]。此外, 研究表明摩氏摩根菌對多種常用抗生素存在耐藥性, 因此在水產養(yǎng)殖過程中要慎選藥物、合理用藥, 其中頭孢哌酮、諾氟沙星等抗生素是治療摩氏摩根菌感染的首選藥物, 為水生動物細菌性疾病預防和治療提供科學參考。

圖4 三株分離菌的系統(tǒng)進化樹分析Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of the three isolates

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ISOLATION, IDENTIFICATION AND ANTIBIOTIC SENSITIVITY TEST OF MORGANELLA MORGANII FROM MAUREMYS MUTICA

LAN Yun, HU Xiu-Cai, Lü Ai-Jun, SHEN Xiao-Jing, ZHU Ai-Hua and FENG Zhao-Jun
(School of Life Sciences, Jiangsu Normal University, Xuzhou 221116, China)

黃喉擬水龜; 摩氏摩根菌; 分離鑒定; 致病性; 藥敏試驗

Mauremys mutica; Morganella morganii; Isoltation and identification; Pathogenicity; Antibiotic sensitivity test

S947.9

A

1000-3207(2014)06-1173-06

10.7541/2014.170

2013-09-22;

2014-03-02

國家自然科學基金(31272692、30800847); 江蘇省“青藍工程”(2014)資助

蘭云(1987—), 女, 江蘇連云港人; 碩士研究生; 主要從事微生物及免疫學研究。E-mail: lanyun9058@126.com

呂愛軍(1973—), E-mail: lajand@126.com