細胞自噬的分子機制及其功能

陳蘭芳，肖亮綜述，楊軍平審校

(1、武穴市中醫(yī)院，湖北 武穴 435300；2、江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌330006)

細胞自噬(autophagy)是真核細胞利用溶酶體對細胞器及蛋白質進行降解的生物學過程[1]，廣泛存在于高等脊椎動物的細胞內[2]。自1962年發(fā)現(xiàn)后，直到1993年酵母自噬相關基因的發(fā)現(xiàn)及酵母突變株模型的建立，細胞自噬的基礎研究才有了許多進展[3，4]。 繼 2005 年被《Science》預測為年度科技領域的最大熱點之后，細胞自噬已經成為生命科學領域最炫目的研究方向。現(xiàn)已證實，細胞自噬在生物體生長發(fā)育、細胞分化及對環(huán)境的應答等過程中有著關鍵作用，也與腫瘤的形成、神經性病變、肌病、病原體感染等疾病關系密切[5]。

1 細胞自噬的概述及分類

細胞自噬是一種程序化的細胞內降解過程。細胞通過包裹降解物形成自噬體運送至溶酶體進行消化，以滿足代謝需要、細胞器更新及維持細胞穩(wěn)態(tài)[6]。自噬體直徑一般為300~900nm，平均500nm,電鏡下，其囊泡內常見某些胞漿成份和細胞器如線粒體、過氧化物體等[7]。根據(jù)降解物與溶酶體的結合途徑不同，可將自噬體分為三類：(1)巨自噬 (macroautophagy):細胞內的可溶性蛋白和某些細胞器被非溶酶體來源的雙層膜結構包裹，并運送至溶酶體，與之結合后降解。巨自噬的雙層膜被命名為自噬泡，可能來源于線粒體膜[8]、高爾基復合體膜[9]或內質網膜[10]，但具體形成機制不明[11]，Atg9的多聚化促進了自噬體膜的形成。過去認為，巨自噬體的降解物無明顯選擇性[12];但有研究表明，某些情況下，蛋白質或細胞器也能被選擇性自噬降解，例如線粒體自噬(Mitophagy)、核糖體自噬(Ribophagy)、內質網自噬(Reticulophagy)、過氧化物酶體自噬(Pexophagy)和脂類自噬(Lipophagy)[13]。隨著細胞自噬受體蛋白P62的發(fā)現(xiàn)，我們更加認識到細胞自噬是一個具有高度選擇性的生物過程[14，15]。通常所說自噬即巨自噬。(2)微自噬(microautophagy):細胞通過溶酶體膜直接內陷、包裹細胞內物質(如某些長壽蛋白)并消化、降解。(3)分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy)：胞漿中的分子伴侶HSC70能識別底物蛋白分子 (可溶性蛋白分子)的特定氨基酸序列(KFERQ-模式)，當分子伴侶-底物蛋白分子復合物與溶酶體膜上的受 體 LAMP2α (Lysosome-associated memberane protein 2α)結合后，底物去折疊，溶酶體內的另一種分子伴侶介導底物在溶酶體膜的轉位并進入溶酶體內進行降解[16]。

2 細胞自噬的形成過程及分子機制

細胞自噬具有進化高度保守性，它的發(fā)生、發(fā)展都受多種自噬相關基因的調控。目前，至少已鑒定出30多種自噬特異性基因[17]及50多種相關基因。2003年，以酵母的自噬基因為參考進行了統(tǒng)一命名，以Atg來代表自噬特異性基因及對應的蛋白[18]，哺乳動物自噬相關基因見表1[19]，這些自噬基因編碼的蛋白質在自噬的發(fā)生、發(fā)展的各階段都發(fā)揮著重要的作用。細胞自噬的主要過程包括以下幾個階段(見圖1)。

2.1 自噬的啟動階段 正常生理狀態(tài)下，細胞保持低的基礎自噬水平，當細胞在營養(yǎng)和能量缺乏、蛋白質累積、應激狀態(tài)等情況下，自噬水平會迅速被誘導上調。哺乳動物的自噬誘導主要是通過由ULK1(酵母 Atg1 同系物)、FIP200(酵母 Atg17 同系物)、Atg13三種蛋白形成的ULK1復合物與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mTORC1)之間相互作用實現(xiàn)的[20]。當能量充足時，mTORC1活化，通過高度磷酸化ULK1和Atg13來抑制細胞自噬。當能量缺乏時，mTORC1活性被抑制，去磷酸化的Atg13與ULK1形成復合物，并與FIP200相互作用，從而誘導自噬體的成核和延伸[21]。成核過程與ClassⅢPI3K(Vps34)-Beclin-1(酵母Atg6同系物)復合物密切相關[22，23]，同在該復合體中的還有調節(jié)性蛋白激酶p150(Vps15)以及Atg14的同源分子Atg14L或與Beclin-1和自噬相關的關鍵性調節(jié)蛋白(Barkor)[24],共同作用于膜泡的成核，介導PAS(前自噬體)的形成。Beclin-1-PI3K復合體還可以募集Atg12-Atg5和Atg16L多聚體以及LC3(酵母Atg8同系物)，使后兩者促進吞噬泡的伸展擴張[25]。

表1 哺乳動物自噬相關基因

圖1 自噬體形成的主要過程

2.2 自噬體的延伸階段 哺乳動物自噬體的延伸主要依賴于兩個泛素化復合系統(tǒng):Atg12的結合過程與LC3的修飾過程[26]。Atg12的結合過程是類泛素化的過程，需泛素活化酶E1和E2的參與。Atg12首先由Atg7(E1樣酶)活化，再通過Atg10(E2樣酶)轉運至Atg5，后與Atg16結合生成多體復合物,并參與自噬體的擴張[27-29]。

LC3的修飾過程同樣需要泛素活化酶E1和E2的參與。LC3前體形成后，被Atg4加工成胞漿可溶性的LC3-Ⅰ，后在Atg7(E1樣酶)和Atg3(E2樣酶)作用下與磷脂酰乙醇胺(PE)共價連接成為脂溶性的LC3-Ⅱ-PE，并參與膜的延伸。LC3-Ⅱ能夠與新形成的膜結合，直到自噬溶酶體(Autolysosome)的形成,因此LC3-Ⅱ常用作自噬形成的標識[30],也是目前唯一發(fā)現(xiàn)定位于自噬泡膜上多種信號傳導的調節(jié)蛋白[31]。

哺乳動物的這兩個類泛素化過程，并不是獨立運行的，它們之間可以相互作用，相互調節(jié)。在哺乳動物細胞HEK293細胞中，Atg3除LC3外，還能與 Atg12 及 Atg12-Atg5 相互作用[32，33],另外，在Atg7的存在下，Atg10的超表達還能促進LC3的修飾[34]。

2.3 自噬體的成熟階段 自噬體的成熟主要是指自噬體通過微管骨架，在轉運必須內吞體分類復合物(ESCRT)和單體GTP酶(RabS)作用下與溶酶體融合形成自噬溶酶體的過程[35]。參與成熟階段的溶酶體相關蛋白還包括：LAMP1、LAMP2、UVRAG(紫外線抵抗相關腫瘤抑制基因)等[36，37]。

2.4 自噬體的降解階段 是指自噬溶酶體膜的裂解及內容物在溶酶體水解酶的作用下降解的過程。降解過程中產生的氨基酸及部分蛋白可以為細胞提供營養(yǎng)、能量或循環(huán)利用。實驗表明，部分自噬體蛋白也在降解階段發(fā)揮了重要作用。Atg22直接參與了一部分氨基酸的運輸[38]，同時Atg12與Atg15可能參與了自噬溶酶體的裂解[39]。另外，Atg1及Atg13還參與了溶酶體水解酶的運輸[40]。

3 細胞自噬調控的分子機制

細胞自噬是一個多步驟調節(jié)的過程，信號傳導非常復雜，目前人類尚未完全掌握。除了對上述細胞自噬的形成過程中的信號調控有所了解外，另對幾條其它信號通路也有了深入的研究和重大進展(圖 2)。

圖2 細胞自噬的信號調控通路

3.1 mTOR信號通路 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶mTOR，是磷脂酰肌醇激酶相關蛋白激酶(PIKK)的家族成員。mTOR存在兩種不同形式：對雷帕霉素敏感的mTOR復合物1(mTORC1)，包括mTOR、raptor (regulatory-associated protein of mTOR)、mLST8(mammalian ortholog of LST8)、PRAS40(proline-rich Akt substrate of 40 kDa)；另一種對雷帕霉素不敏感的mTOR復合物(mTORC2)，包括mTOR、mLST8、rictor(rapamycin insensitive companion of mTOR)、mSIN1(mitogen-activated protein kinaseassociated protein 1)。mTORC1主要參與細胞生長、細胞凋亡、能量代謝和細胞自噬的調節(jié)及各種腫瘤的生長[41，42]。mTORC2參與細胞骨架蛋白的構建和存活，但研究表明，mTORC2也可抑制細胞自噬[43]。mTORC1信號通路是多條信號通路的匯聚點，通過對上、下游信號的來傳導影響細胞自噬，現(xiàn)已成為目前研究最多的信號通路。

3.1 .1 mTORC1主要的上、下游信號通路mTORC1的下游通路主要包括：(1)如細胞自噬的誘導階段所述，mTORC1可以通過對ULK1復合物的磷酸化來調節(jié)自噬水平，但ULK1復合物參與自噬的具體調節(jié)機制還不明確[44]。實驗顯示，ULK1復合物的缺失，對自噬的調節(jié)并不明顯，它的功能可能為其亞型所代償[45]。(2)mTORC1作用的下游信號分子還包括轉錄起始因子4E結合蛋白1(4EBP1)、核糖體蛋白S6激酶 (S6K1)等，mTORC1通過與4EBP1、S6K1的相互作用，啟動相關基因的轉錄和翻譯，從而調節(jié)自噬水平[46，47]。 另外，mTORC1 也可通過與4EBP1、S6K1參與細胞周期的調節(jié)[48]。

mTORC1的上游通路主要包括：(1)AMPK-mTORC1信號通路 AMPK的激活能磷酸化結節(jié)性硬化癥TSC1/2復合物，從而促進mTORC1的失活，誘導細胞自噬水平的提高。TSC1/2復合物是異二聚體，TSC1具有穩(wěn)定作用，TSC2能抑制mTORC1激活所必須的小GTP酶Rheb(Ras homolog enriched in brain)，實現(xiàn)對mTORC1的抑制作用。AMPK也能直接磷酸化Raptor,抑制mTORC1，上調細胞自噬[49]。(2)I型磷脂酰肌醇3激酶(ClassⅠ PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTORC1信號通路 激活的ClassⅠPI3K能在細胞中產生第二信使PIP3，PIP3在磷脂酰肌醇脂依賴性蛋白激酶1(PDK1)的協(xié)助下，激活AKT。激活的AKT能夠抑制TSC1/2復合物，從而激活mTORC1,抑制細胞自噬。另外，抑癌基因PTEN(具有磷酸酶活性的張力素同源基因)可以通過抑制ClassIPI3K的活性，誘導細胞自噬水平的上調[50]。(3)Ras/絲裂原蛋白激酶的激酶 (MEK)/細胞外信號調節(jié)激酶 Ras-MEK-ERK信號通路在腫瘤細胞中表現(xiàn)活躍，它與細胞自噬的具體機制還仍然待研究。但研究表明，ERK能通過抑制TSC1/TSC2的活性調節(jié)細胞自噬水平，促進腫瘤細胞的形成[51]，另外Ras也能通過ClassIPI3K/AKT通路調節(jié)細胞自噬。

3.1 .2細胞機體狀態(tài)的改變對mTORC1的影響(1)細胞能量代謝與mTORC1：mTORC1激酶是細胞能量和營養(yǎng)代謝的感受器。當機體能量缺乏時，AMP/ATP比值升高，繼而激活絲氨酸/蘇氨酸激酶11(LKB1)-AMPK信號軸，激活的AMPK能磷酸化結節(jié)性硬化癥TSC1/2復合物，從而促進mTORC1的失活，誘導細胞自噬水平的提高[52，53]。 (2)氨基酸代謝與mTORC1：氨基酸作為細胞自噬的終產物可負反饋調節(jié)細胞自噬，同時外源性的支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)的攝入也能影響細胞自噬的水平。研究表明，當亮氨酸濃度升高時，能激活mTORC1，抑制細胞自噬[54]，而且ClassⅢPI3K/Vps34也能參與亮氨酸激活mTORC1的通路[55]，但具體機制仍待研究。(3)生長因子與mTORC1:生長因子也可通過mTORC1通路調節(jié)細胞自噬。胰島素樣生長因子IGF1 (insulin/insulin-like growth factor)就是通過PI3K/Akt/mTORC1通路調節(jié)細胞自噬水平的[56]。IGF1與受體結合后，激活PI3K，并產生PIP3，在磷脂酰肌醇脂依賴性蛋白激酶1(PDK1)的協(xié)助下，激活AKT，進而激活mTORC1下調細胞自噬的水平[57]。(4)線粒體的功能與mTORC1:線粒體氧化磷酸化產生的活性氧(ROS)，對mTORC1通路具有雙重作用。小劑量的ROS通過ClassIPI3K/AKT信號通路激活mTORC1，但大劑量的ROS能通過AMPK相關通路抑制mTORC1，上調線粒體自噬水平[58]。(5)細胞應激狀態(tài)與mTORC1:mTORC1激酶也是細胞應對應激狀態(tài)的一個重要傳感器。發(fā)育及DNA損傷反應調節(jié)基因蛋白1(REDD1)在缺氧和內質網壓力時，調節(jié)TSC1/TSC2復合物，抑制 mTORC1的活性[59]。

3.2 Beclin-1信號通路 Beclin-1是酵母自噬基因Atg6/Vps30的同源基因，它在自噬的調節(jié)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要，是一個重要的候選抑癌基因[60]。Beclin-1蛋白含有BH3(Bcl-2-homology3)、中央螺旋區(qū)(CCD)和進化保守區(qū)(ECD)三個結構域[61],這些結構域可以與其它因子相互作用，調節(jié)細胞自噬水平。

Bcl-2/Bcl-XL都含有BH3受體，能與Beclin-1蛋白競爭性結合，抑制Beclin-1誘導的細胞自噬。另外，死亡相關蛋白激酶(DAPK)能磷酸化BH3結構域，使Beclin-1與Bcl-XL的親和力減低，上調細胞自噬水平[62]。

Beclin-1可以通過CCD和ECD結構域與ClassⅢ PI3K結合，形成Beclin 1-ClassⅢ PI3KVps15復合體，上調細胞自噬水平[63]。同時這一復合體對細胞自噬水平的調控也受其他蛋白的調節(jié) ， 比 如 Barkor(Atg14L)[64]、Ambra1(activating molecule in Beclin-1 regulated autophagy)[65]和骨髓樣分化因子88(MyD88)等。

UVRAG(抗紫外線相關基因產物)，它是酵母Vps38的同源分子，能與Beclin-1的CCD結構域結合，提高Beclin-1與ClassⅢPI3K的相互作用以及ClassⅢPI3K的活性，從而上調細胞自噬的水平[66]。另外 Bif-1[67](Bax-interacting factor 1)和Beclin 1結合蛋白Rubion[68]也能通過UVRAG與Beclin-1相互作用，影響細胞自噬的水平。

3.3 P53信號通路 P53是一個主要的抑癌基因，在細胞周期、細胞凋亡、腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展過程中都發(fā)揮關鍵的作用?，F(xiàn)研究表明P53在細胞的自噬過程中，也發(fā)揮了重要的作用。且P53在細胞核和細胞質的不同定位能對細胞自噬產生完全不同的影響[69，70]。 P53在細胞核中：(1)P53能通過sestrin1/2蛋白激活AMPK-mTORC1信號通路，從而抑制mTORC1，上調細胞自噬水平[71]。(2)P53能通過激活DAPK1，磷酸化Beclin-1,促進細胞自噬。(3)P53能通過激活抗凋亡蛋白BCL-2家族(Bad、PUMA、Bax 、BNIP3)，解除 Bcl-2/Bcl-xL 與 Beclin-1之間的抑制作用而上調細胞自噬[72，73]。(4)P53能激活DRAM1(損傷相關自噬調節(jié)因子)，通過編碼一種溶酶體蛋白，從而上調細胞的自噬水平，但具體機制還未明確[74，75]。

P53在細胞質中有關研究表明，P53缺失的癌細胞中，細胞自噬水平上調，且細胞質中重新載入P53能下調細胞自噬水平[76]。因此，P53在細胞質中能夠發(fā)揮抑制細胞自噬水平的功能。

部分學者認為，P53在細胞中的不同定位發(fā)揮的雙重功能以及P53在細胞中的穿梭功能，可能正是P53調控細胞自噬水平的基礎。

3.4 其它 除上述三種信號通路外，細胞自噬還存在其它多種信號通路，仍待深入研究。例如：脂多糖 LPS[77]和SSRNA[78]可以通過不同的 Toll like receptors(TLRs)，調節(jié)細胞自噬的水平；另外，本實驗室也正研究在IL-13和共培養(yǎng)的條件下，細胞自噬中具體的作用和可能信號途徑，因有關實驗已表明，TH1細胞因子[79]和TH2[80]細胞因子能通過不同的信號通路對細胞自噬發(fā)揮不同的調控功能。

4 細胞自噬的功能

4.1 細胞自噬的生理功能 細胞自噬廣泛的存在于人體細胞的正常生理過程中，主要功能包括 ：(1)細胞自噬作為細胞內能量的來源，在維持能量代謝及應對應激改變時起著重要的作用。細胞在營養(yǎng)缺乏、應激狀態(tài)下，通過上調細胞自噬，分解更多蛋白質，來提供細胞存活需要的能量。實驗表明，新生的幼鼠在中斷胎盤營養(yǎng)供應后，就是通過上調細胞自噬水平維持生存的[81]。(2)細胞自噬在維持細胞穩(wěn)態(tài)中也發(fā)揮了關鍵作用。細胞自噬通過對長壽蛋白、細胞器的降解利用以及清除缺陷蛋白的積聚來參與細胞細胞質的重建和維持細胞穩(wěn)態(tài)。例如：細胞自噬負調控了細胞老化過程中部分蛋白質、細胞器等的積聚，這也提示了細胞自噬與生命長度的相關性[82]。(3)細胞自噬引起的細胞程序性死亡(Ⅱ型程序性細胞死亡[83])，在體內清除無用或病理改變的細胞過程中，起著重要作用。細胞自噬水平的破壞與腫瘤、自身免疫性疾病等關系密切。

4.2 細胞自噬與疾病的關系 (1)細胞自噬與腫瘤大量研究表明，細胞自噬與腫瘤有著非常密切的關系。人類眾多癌細胞中都能發(fā)現(xiàn)細胞自噬相關基因的缺失，例如Beclin-1在很多乳腺癌細胞中明顯表達降低[84]，可見細胞自噬可以抑制腫瘤的發(fā)生。但是細胞自噬與腫瘤的關系非常復雜，它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，扮演著雙重角色。在腫瘤發(fā)生的早期，抑制細胞自噬可以促進腫瘤細胞的增長，顯示細胞自噬可以抑制腫瘤的發(fā)生[85]；但是，在腫瘤的進展過程中，細胞自噬卻可以抑制腫瘤細胞的凋亡、促進腫瘤細胞的轉移[86]從而使腫瘤細胞持續(xù)增殖，同時，細胞自噬還能通過促進血管生成來促進腫瘤細胞的生長[87]。另外，在腫瘤的治療工程中，細胞自噬也有雙重功能。一方面，可以保護腫瘤細胞免受化療、放療的損傷[88]，另一方面，又可以因為抗腫瘤藥物的影響，誘導腫瘤細胞的程序性凋亡。(2)細胞自噬與病原體 進入人體內的細菌、病毒可以被自噬泡包裹運送至溶酶體從而通過細胞自噬降解。 實驗表明，細胞自噬相關基因Atg5缺失的的細胞中，A群鏈球菌可以大量繁殖[89],而且機體可以通過細胞自噬與MHCⅡ類抗原的相互作用，清除進入體內的EB病毒[90]。(3)細胞自噬與神經性退行性疾病、肌病等 細胞自噬廣泛參與機體神經元內的異常蛋白的降解，當細胞自噬水平的上調或下調時，可引起神經系統(tǒng)功能障礙 如 Huntington’s[91]、Parkinson’s、Altheimer’s。 另外，肌細胞中，細胞自噬相關蛋白的缺陷，可導致大量自噬溶酶泡的聚集而引起肌病如Danon肌病[92]。相關實驗還表明，細胞自噬與糖尿病腎病[93]、心臟疾病[94]也存在重要聯(lián)系。

5 展望

細胞自噬是存在于真核生物中重要的生理現(xiàn)象，與各種生理活動和疾病息息相關。自發(fā)現(xiàn)以來，特別是酵母模型的建立后，細胞自噬的研究取得了突破性的進展；但是，細胞自噬是一個多步驟，極其復雜的過程，在不同的狀態(tài)、不同的位置、不同的細胞、不同的疾病過程中都存在不同的信號通路和不同的生物功能，它的信號途徑和分子機制仍然是一個幾十年都未解決的問題。隨著科技的進步和社會的發(fā)展，細胞自噬越來越成為生命科學領域研究的熱點，待細胞自噬研究的深入和發(fā)展，我們有望在腫瘤的預防和治療、生命的衰老等領域取得重的突破。

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