乙型肝炎病毒耐藥突變基因檢測在臨床中的應(yīng)用

許瑞元，王爾莉，曹霜，許玉慧，徐川林

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院，福建 漳州 363000)

乙型肝炎(HBV)是危害人類身體健康最嚴(yán)重的常見傳染病之一，我國是乙型肝炎的高發(fā)國家，人群中乙型肝炎表面抗原 (HbsAg)陽性率約為10.0%[1]。其中有2千多萬為慢性乙型肝炎患者。近年來，隨著核苷(酸)類似物的廣泛應(yīng)用，大部分病人的病情都能夠得到控制，極大程度地改善了患者的生活質(zhì)量[2]。但長期應(yīng)用后，易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，成為當(dāng)今乙肝治療領(lǐng)域最大的挑戰(zhàn)，研究表明，接受拉米夫定、阿德福韋酯聯(lián)合治療5年后，臨床耐藥發(fā)生率高，拉米夫定耐藥發(fā)生率>60%，阿德福韋酯耐藥發(fā)生率>20%[3]。本文對我院門診2012年1月-2013年7月期間123例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定、阿德福韋酯聯(lián)合治療5年后，進(jìn)行核苷(酸)類似物耐藥基因檢測，旨在發(fā)現(xiàn)HBV對不同的核苷類藥物的耐藥情況，為臨床藥物治療提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般材料 選取我院門診2012年1月-2013年7月期間123例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定、阿德福韋酯聯(lián)合治療5年后的血清標(biāo)本，男90例，女33例，年齡21~58歲，平均46.5歲。CHB診斷符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》[4]。

1.2 標(biāo)本采集與處理 采集空腹受檢者靜脈血1ml，注入無菌1.5ml離心管中，于室溫靜置2h，轉(zhuǎn)入 4℃靜置 1h，8000r/min 離心 5min，吸取 200μl上清轉(zhuǎn)入另一無菌1.5ml離心管中，置于4℃冰箱中待測。

1.3 儀器與試劑 北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司提供的ABI310遺傳分析儀，并使用其專用試劑。

1.4 檢驗(yàn)方法 完全解凍試劑后充分混勻并3000r/min離心30s。用微量加樣器在每一PCR反應(yīng)管內(nèi)分裝20μlHBV PCR反應(yīng)液。向上述分裝好試劑的PCR管內(nèi)，加入5μl樣本DNA。將加有標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、對照品的PCR反應(yīng)管按照預(yù)先設(shè)定好的程序依次置于PCR儀中，進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)完畢，根據(jù)已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品與擴(kuò)增曲線Ct值之間的線性關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出待檢標(biāo)本血清中HBV病毒量。取5μl上述制得的PCR產(chǎn)物，再加入2.5μl SAP酶混合物震蕩混勻，3000r/min離心30s，37℃60min,80℃15min，制得PCR酶解產(chǎn)物。取制得的PCR酶解產(chǎn)物3μl、測序試劑1μl和HBV測序引物2μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后，使用測序分析軟件Chromas對相應(yīng)耐藥靶點(diǎn)進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

123 例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定、阿德福韋酯聯(lián)合治療5年后，進(jìn)行核苷(酸)類似物耐藥的檢測。拉米夫定耐藥84例，占68.29%；阿德福韋酯耐藥25例，占20.32%；替比夫定耐藥12例，占9.76%；恩替韋卡耐藥2例，占1.63%。對不同核苷(酸)類似物有不同耐藥發(fā)生率：依次是拉米夫定>阿德福韋酯>替比夫定>恩替韋卡。

3 討論

我國有1億多的乙型肝炎病毒攜帶者，其中有2千多萬為慢性乙型肝炎患者，核苷(酸)類似物是臨床上常用于慢性乙型肝炎抗病毒治療的藥物，它的應(yīng)用極大地提高了慢性乙型肝炎抗病毒治療水平。但是隨著治療時(shí)間的延長，核苷(酸)類似物會(huì)出現(xiàn)耐藥。本研究123例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定、阿德福韋酯聯(lián)合治療5年后，拉米夫定耐藥達(dá)68.29%，阿德福韋酯耐藥20.32%，替比夫定耐藥9.76%；恩替韋卡耐藥1.63%，結(jié)果與國外研究一致。目前在我國批準(zhǔn)用于乙肝治療有四種核苷(酸)類似物即：拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定、恩替韋卡。我國目前常用拉米夫定、阿德福韋酯聯(lián)合治療慢性乙型肝炎患者。近年來，隨著拉米夫定、阿德福韋酯長期應(yīng)用后，易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。因此，核苷(酸)類似物耐藥的檢測及更加強(qiáng)效快速抗病毒藥物的應(yīng)用尤為重要。替比夫定、恩替韋卡近年來在我國上市，但也存在耐藥現(xiàn)象[5]。我們的研究結(jié)果表明，HBV的耐藥發(fā)生率依次為拉米夫定>阿德福韋酯>替比夫定>恩替韋卡，相對于拉米夫定，替比夫定和恩替韋卡屬于強(qiáng)效快速抗病毒藥物。對有抗病毒治療適應(yīng)證的患者，若選用核苷(酸)類似物應(yīng)盡量選用抗病毒作用強(qiáng)、耐藥變異發(fā)生率低的藥物，同時(shí)要了解既往的治療情況，包括核苷(酸)類似物應(yīng)用情況、治療應(yīng)答情況及耐藥變異情況，以便選擇無交叉耐藥的藥物治療。治療期間應(yīng)定期檢測HBV的DNA水平。大量的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，早期病毒學(xué)應(yīng)答情況是預(yù)測耐藥發(fā)生率的重要指標(biāo)。所以加強(qiáng)對乙肝病毒耐藥的檢測，及時(shí)調(diào)整治療方案，以提高療效，降低耐藥發(fā)生率是目前應(yīng)對核苷(酸)耐藥的最佳選擇。

[1]羅超,任娟,高惠,等.乙肝病毒耐藥導(dǎo)致慢性重型肝炎9例臨床分析[J].西南國防醫(yī)藥,2010,16(5):4-6．

[2]張兆穎，拉米夫定臨床研究進(jìn)展[J].抗感染藥學(xué),2005,25(1):33．

[3]EASL Clinical Practice Guidelines.Management of chronic hepatitis B[J].Hepatology 2009,50(2):227-242.

[4]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南[J].中華肝臟病雜志,2005,13(12):881-891．

[5]Yim H J，Hussain M，Liu Y,et al.Evolution ofmulti-drug resistant hepatitis B virus during sequential therapy[J].Hepatology,2006,44(3):703-712.