柯薩奇-腺病毒受體在肺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理因素的相關(guān)性研究

郭廣秀，張功亮，肖軍蘭，黃金長，王建

(贛州市人民醫(yī)院 病理科，江西 贛州 341000)

柯薩奇-腺病毒受體 (Coxsackie and adenovirious receptor，CAR)是柯薩奇 B病毒(CBV)和腺病毒(ADV)與靶細(xì)胞結(jié)合的共同受體。CAR因其作為腺病毒受體介導(dǎo)攜帶治療基因的腺病毒載體進(jìn)入宿主細(xì)胞發(fā)揮治療作用而受到廣泛關(guān)注[1]。CAR作為細(xì)胞間粘附分子，參與了多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理過程[2]。本文應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)CAR在肺癌和癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理因素之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般材料 收集2009年1月至2012年12月我院病理診斷明確的肺癌手術(shù)切除標(biāo)本70例、支氣管鏡活檢標(biāo)本5例，其中鱗癌43例，腺癌27例，小細(xì)胞癌5例。同時(shí)采用癌旁(距離癌腫5cm以外)組織作為對(duì)照組。所有組織均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定10h，石蠟包埋組織。

1.2 試劑 鼠抗人CAR單克隆抗體購買自美國Upstate公司，EnVision試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟 免疫組化EnVision法：觀察存檔肺癌及癌旁組織玻片，挑選對(duì)應(yīng)最佳蠟塊，4um切片，60℃考片1h，二甲苯脫蠟后置酒精，水化后置入PBS液，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，用0.01M、pH6.0枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，100℃15min，自然冷卻，CAR(1:100)一抗孵育，4℃過夜，0.01M、pH7.2～7.4PBS 沖洗 10min， 再用 En-Vision 二抗孵育，37℃ 60min，0.01M、pH7.2～7.4PBS沖洗10min，DAB顯色(顯微鏡下觀察，及時(shí)終止顯色)，蘇木素襯染，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 所有切片均經(jīng)由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師進(jìn)行閱片、計(jì)數(shù)及判斷。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野(×400倍)，呈色強(qiáng)度得分：未染色0分，黃色1分，棕黃色2分，棕黑色3分。呈色百分率得分：無陽性細(xì)胞 0分，＜25%1分，25%～50%2分，＞50%3分。兩項(xiàng)得分相加即為CAR表達(dá)的最后得分：0 分為(-)，1～2 分為弱陽性(+)，3～4 分為中度陽性(++)，5～6 分為(+++)。表達(dá)程度分為：(-)和(+)為陰性表達(dá)，(++)和(+++)為陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)不同組織間CAR表達(dá)的差異進(jìn)行比較，并分析其與臨床病理因素的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAR在肺癌及癌旁組織中的表達(dá) CAR陽性定位于細(xì)胞膜上，胞漿內(nèi)少量表達(dá)，呈棕黃色顆粒狀。肺癌組織著色較深(++)～(+++)，多呈彌漫陽性(圖1)，而癌旁組織著色較淺，且呈灶性陽性(圖2)。

圖1 CAR在鱗癌組織中表達(dá)，呈彌漫陽性 SP法(×200)

圖2 CAR在癌旁組織中的表達(dá)，呈灶性陽性SP法(×200)

CAR在肺癌組織中的陽性表達(dá)率為57.3%(44/75)，癌旁組織中的陽性率 9.3%(7/75)，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(見表1)。

表1 CAR在肺癌及癌旁組織中的表達(dá)[n(%)]

2.2 肺部組織CAR表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系在不同的臨床病理因素中，CAR的表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但在患者不同性別、年齡、吸煙與否、腫瘤大小、TNM分期等因素中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CAR在腺癌及小細(xì)胞癌中的表達(dá)陽性率分別為74.1%(20/27)、80.0%(4/5)，而鱗癌僅為46.5%(20/43)，三者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見表 2)。

2.3 CAR的表達(dá)在肺鱗癌及腺癌不同組織學(xué)分級(jí)中的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0．05)(見表3)。

3 討論

柯薩奇-腺病毒受體(CAR)是分子量為45KD的Ⅰ型跨膜單倍，能夠介導(dǎo)腺病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合，在以腺病毒為載體的基因治療領(lǐng)域起著重要作用[3]。CAR表達(dá)具有組織特異性和物種特異性[4]，在人類胰腺、腦、心臟、小腸、睪丸以及前列腺中含量最高，在肝臟和肺中有少量表達(dá)，而在腎臟、胎盤、末梢血白細(xì)胞，胸腺和脾臟中則無。CAR作為細(xì)胞間粘附分子，可能參與了多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理過程，在多種腫瘤細(xì)胞中CAR表達(dá)均有不用程度的降低或缺失，并且隨著腫瘤的惡性度增高，CAR的表達(dá)丟失更明顯。Jonas等[5]研究發(fā)現(xiàn)，CAR在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)下調(diào)，Ⅱ期和Ⅲ期腫瘤CAR表達(dá)高于Ⅳ期，其間差異明顯。在前列腺組織中，CAR無論是在表達(dá)強(qiáng)度還是表達(dá)率上都較正常前列腺組織發(fā)生明顯下調(diào)，且隨著腫瘤惡性程度的升高，其下調(diào)也愈明顯。在膀胱尿路上皮癌也出現(xiàn)類似現(xiàn)象，而且CAR表達(dá)水平與腫瘤的病理分級(jí)、肌層侵犯、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及P53表達(dá)密切相關(guān)。然而，近來的研究發(fā)現(xiàn)[6]，在大多數(shù)骨肉瘤細(xì)胞系中CAR高度表達(dá)。Ito等發(fā)現(xiàn)鼠骨折模型中非成熟的成骨細(xì)胞亦有CAR的高水平表達(dá)。另外，所有的Ewing氏肉瘤細(xì)胞系都有CAR的高表達(dá)。所以我們可以看出，CAR在不同類型腫瘤中發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能，在有些腫瘤中扮演了抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及侵襲的角色，而在另一些腫瘤中發(fā)揮著相反的作用。Qin等[7,8]發(fā)現(xiàn)在體外試驗(yàn)表面CAR表達(dá)有利于非小細(xì)胞肺癌的形成，同時(shí)預(yù)示在體內(nèi)CAR的表達(dá)在腫瘤的增殖中是必須的，并且激發(fā)肺癌細(xì)胞某種亞型的有效形成中也是必須的。以腺病毒為載體的基因治療由于具有技術(shù)成熟、操作簡(jiǎn)便和安全性好等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)展尤為迅速。在本研究中，肺癌組織中CAR的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，提示CAR在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。但CAR的表達(dá)在肺鱗癌、腺癌不同組織學(xué)分級(jí)中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明CAR的表達(dá)可能與肺鱗癌及腺癌惡性程度無明顯相關(guān)性。

表2 肺癌組織CAR表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系[n(%)]

表3 鱗癌及腺癌不同組織學(xué)分級(jí)中CAR表達(dá)比較[n(%)]

CAR為細(xì)胞表面的病毒受體，在細(xì)胞粘附、上皮細(xì)胞極性形成以及細(xì)胞的接觸抑制機(jī)制等方面起著重要作用，并可以抑制腫瘤的惡性進(jìn)程及侵襲轉(zhuǎn)移[9]。本研究結(jié)果表明，在不同的臨床病理因素中，CAR的表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例CAR表達(dá)的陽性率較低，說明CAR在一定程度上抑制了肺癌細(xì)胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。但在患者不同性別、年齡、吸煙與否、腫瘤大小等因素中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。值得注意的是，TNM分期中Ⅰ~Ⅱ期CAR陽性表達(dá)率較高(66.7%，28/42)，Ⅲ~Ⅳ期陽性率較低(48.5%，16/33)，說明CAR的表達(dá)與肺癌的TNM分期可能有一定的關(guān)系，即TNM分期越晚，CAR表達(dá)越不顯著，但尚未達(dá)到有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的程度，分析其原因可能為：肺癌TNM分期不單與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，還與腫瘤大小及是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，這幾個(gè)因素都會(huì)對(duì)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果產(chǎn)生影響，也有可能與本研究樣本量較小有關(guān)，更為精確的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有待于今后擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，CAR在不同組織類型的肺癌細(xì)胞中表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，腺癌及小細(xì)胞癌的CAR表達(dá)明顯強(qiáng)于鱗癌的表達(dá)，說明CAR的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞起源有關(guān)，并與肺腺癌及小細(xì)胞癌形成發(fā)展關(guān)系更為密切，與顧安康[10]、鮑永儀等[11]的報(bào)道一致，這將為我們選擇靶向藥物或基因治療不同組織學(xué)類型的肺癌提供一定的理論依據(jù)。

本研究不足之處：本研究屬于小樣本分析，更為精確的結(jié)果有待于更大樣本的研究。另外關(guān)于CAR對(duì)肺癌細(xì)胞具體的作用機(jī)制還不清楚，CAR與肺癌的增殖指數(shù)及預(yù)后等的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

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