嬰幼兒感染豬霍亂沙門(mén)菌耐藥基因特點(diǎn)及同源性分析

黃凱，余曉君，王曄

(江西省兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006)

沙門(mén)菌是一種重要的腸道病原菌，主要通過(guò)污染的食物、飲用水經(jīng)口感染進(jìn)入消化道致病，常引起小范圍內(nèi)的流行。其中豬霍亂沙門(mén)菌是引起嬰幼兒腸道感染最常見(jiàn)的致病血清型，為了解本地區(qū)豬霍亂沙門(mén)菌嬰幼兒血流感染的流行及耐藥的分子特點(diǎn)，本文收集我院2008年至2011年間分離自不同病區(qū)患兒血液中的豬霍亂沙門(mén)菌16株，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)及同源性分析，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源及耐藥特點(diǎn) 16株豬霍亂沙門(mén)菌均分離自2008年7月至2011年8月我院不同病區(qū)各個(gè)患兒血液標(biāo)本，所有菌株均經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)生化試驗(yàn)和血清學(xué)檢測(cè)。所有被測(cè)菌株均對(duì)亞胺培南、美羅培南及三代頭孢菌素敏感。耐藥率最高的復(fù)方新諾明(87%，14/16)，其次是氨芐西林(81%，13/16)，氯霉素(75%，12/16)。有5株對(duì)環(huán)丙沙星中介，其中一株同時(shí)對(duì)左氧氟沙星中介。16株豬霍亂沙門(mén)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥譜見(jiàn)文獻(xiàn)[1]。

1.2 一般臨床資料 16例患兒中男12例、女4例；<1周歲者10例，6例為1~3歲幼兒，分別來(lái)自江西不同地區(qū)。入院前均有1~10天的高熱史，熱型不規(guī)則，熱峰38~40℃，均為急診收治入院，分別有咳嗽、寒戰(zhàn)、腹瀉、黃疸及呼吸困難等體征。所有患兒經(jīng)臨床抗菌藥物治療后均已痊愈出院。

1.3 耐藥基因的檢測(cè) 通過(guò)煮沸法提取被測(cè)菌株的總DNA，即挑取單個(gè)克隆菌落于離心管中，再加入150μl的雙蒸水煮沸10min，然后4℃以10600×g離心15 min，取上清液-20℃儲(chǔ)存作為PCR模板備用。采用PCR法及DNA測(cè)序法對(duì)16株豬霍亂沙門(mén)菌進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)耐藥基因檢測(cè)，包括blaTEM、blaSHV、blaCTX-M，引物序列參照文獻(xiàn)[2]。

1.4 PFGE分析 挑取血平皿中培養(yǎng)過(guò)夜的單克隆菌株用低熔點(diǎn)膠灌模，蛋白酶K 50℃消化2 h，40 U的Xba I酶切2h，1.0%的脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀專(zhuān)用膠，電泳儀為美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)的CHEFMapperXA，0．5×TBE 緩沖液，溫度 14℃，電壓為 6V／cm，角度 120°，脈沖時(shí)間 5~20s，電泳時(shí)間為19h，分子量標(biāo)記物為L(zhǎng)adderDNA。電泳后EB染色，紫外燈觀察結(jié)果。PFGE結(jié)果分型按美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心Tenover等[3]推薦的方法判讀，結(jié)果少于3個(gè)條帶不同的被認(rèn)為同一型。

2 結(jié)果

2.1 耐藥基因 對(duì)氨芐西林耐藥的13株(81%，13/16)豬霍亂沙門(mén)菌經(jīng)PCR檢測(cè)為blaTEM陽(yáng)性，經(jīng)測(cè)序確定全部為blaTEM-1型，所有菌株的blaCTX-M和blaSHV基因均為陰性。耐藥基因檢出率見(jiàn)表1。

表1 16株豬霍亂沙門(mén)菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果[株(%)]

2.2 PFGE結(jié)果 所有菌株都可得到清晰的PFGE圖譜，PFGE分型圖譜見(jiàn)圖1，經(jīng)過(guò)聚類(lèi)分析，16株豬霍亂沙門(mén)菌可分為5個(gè)PFGE型，分別命名為A~E型。其中A型包含12株菌，B、C、D、E型均為1株菌。13株blaTEM-1基因陽(yáng)性的豬霍亂沙門(mén)菌株分別為 A 型(11株)，B 型(1株)，D 型(1株)；詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 16株豬霍亂沙門(mén)菌PFGE分型結(jié)果

3 討論

沙門(mén)菌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的食源性腸道致病菌，已知的沙門(mén)菌血清型有2600余種，其中豬霍亂沙門(mén)菌是臨床最常見(jiàn)的血清型之一。本次研究表明，細(xì)菌對(duì)氨芐西林等β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗菌藥物嚴(yán)重耐藥(81%，13/16)，既往對(duì)細(xì)菌耐藥機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是革蘭陰性菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥最重要的原因，TEM是革蘭陰性菌中最常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺酶[4]，是由細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)的能被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(如克拉維酸)所抑制的一類(lèi)酶，可水解青霉素類(lèi)抗菌藥物。本研究資料顯示，13株對(duì)氨芐西林耐藥菌株對(duì)TEM基因檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，特異性TEM引物進(jìn)一步擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果顯示，全部為T(mén)EM-1型廣譜β-內(nèi)酰胺酶。說(shuō)明細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的耐藥性主要由TEM基因編碼，產(chǎn)TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶是本地區(qū)豬霍亂沙門(mén)菌對(duì)氨芐西林耐藥的主要機(jī)制。

注：－表示菌株未檢測(cè)出耐藥基因或未對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，(I)為中介；AMP為氨芐西林，SXT為復(fù)方新諾明，C為氯霉素，CIP為環(huán)丙沙星，LEV為左旋氧氟沙星。

PFGE分型方法是直接針對(duì)整個(gè)細(xì)菌染色體DNA進(jìn)行分析，采用稀有位點(diǎn)限制性?xún)?nèi)切酶將染色體切成5~30條大小約為10~800kb的片段，再通過(guò)2個(gè)或多個(gè)交變電場(chǎng)，使得DNA分子的電泳方向隨電場(chǎng)的變化而變化，在凝膠中呈蛇形向前移動(dòng)，從而使大分子DNA得到分離，PFGE分辨力高，重復(fù)性好，是目前最理想的分型方法，常作為評(píng)價(jià)其它分型方法的參考標(biāo)準(zhǔn)[5,6]。本研究采用此方法對(duì)豬霍亂沙門(mén)菌進(jìn)行分型，所有菌株都可得到10~20條左右條帶，16株豬霍亂沙門(mén)菌共分為5個(gè)PFGE型，分型結(jié)果較好。對(duì)比PFGE分型結(jié)果和耐藥基因測(cè)定結(jié)果可以看出，A 型是最主要的類(lèi)型(75%，12/16)，13株blaTEM-1基因陽(yáng)性菌株A型中有11株，說(shuō)明本地區(qū)豬霍亂沙門(mén)菌腸道外感染主要是由克隆性傳播所引起的。分析耐藥譜測(cè)定結(jié)果可以看出，同種PFGE型有著相同或非常相似的耐藥譜，PFGE型相同而耐藥譜不同的情況則可能是由于耐藥基因發(fā)生突變，但是突變位點(diǎn)并不在PFGE酶切位點(diǎn)上，導(dǎo)致耐藥情況不能從PFGE分型上體現(xiàn)出來(lái)[7]。從臨床資料分析上看，同一PFGE型中的細(xì)菌或來(lái)自江西不同地區(qū)，或來(lái)自不同時(shí)間，考慮為院外散發(fā)感染，雖為同一克隆傳播，但可以排除院內(nèi)交叉感染可能。

[1]黃凱,段榮,余曉君.16例嬰幼兒敗血癥豬霍亂沙門(mén)菌感染的耐藥性分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(5):466-467.

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