青稞 F7-OMT基因的克隆及原核表達(dá)分析

牟 利，張鹍飛，李 鵬，方 建，劉新春，馮宗云

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川成都 611130)

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青稞 F7-OMT基因的克隆及原核表達(dá)分析

牟 利，張鹍飛，李 鵬，方 建，劉新春，馮宗云

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川成都 611130)

摘要：類黃酮7-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(F7-OMT)具有甲基轉(zhuǎn)移酶功能，能催化底物類黃酮甲基化產(chǎn)生植物抗毒素，提高植物的抗菌性。為了給進(jìn)一步研究該酶蛋白的功能奠定基礎(chǔ)，以青稞 “94-19-1” 為材料，采用同源克隆方法得到青稞 F7-OMT基因編碼片段。生物信息學(xué)分析表明，青稞 F7-OMT開放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)為1 173 bp，編碼390個(gè)氨基酸，蛋白分子質(zhì)量為42 207.8 Da，等電點(diǎn)pI為5.36，無(wú)信號(hào)肽序列，具有甲基轉(zhuǎn)移酶2(Methyltransf_2,pfam00891)和二聚化(Dimerization,pfam08100)保守域。通過(guò)亞克隆將 F7-OMT連接到表達(dá)載體pET-32a上，構(gòu)建pET-32a- F7-OMT融合表達(dá)載體，在E.coli BL21(DE3)pLysS中誘導(dǎo)表達(dá)，并采用親和層析純化法得到純化蛋白。

關(guān)鍵詞：青稞；類黃酮7-O-甲基轉(zhuǎn)移酶；克?。簧镄畔W(xué)分析；原核表達(dá)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudum Hook. f.)又名裸大麥、元麥、米大麥，既是藏族牧民的主要糧食，也是生產(chǎn)啤酒和保健品的原料，還可作為牲畜的飼料。在青藏高原地區(qū)，青稞遺傳資源類型豐富多樣，具有三高(高蛋白、高纖維、高維生素)和兩低(低脂肪、低糖)的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)組成和良好的醫(yī)療保健功能[1-2]。青稞中含有豐富的類黃酮化合物，與植物的生態(tài)防御密切相關(guān)，能直接或間接抵抗紫外線、重金屬、微生物等的侵害[3]。目前有關(guān)類黃酮側(cè)鏈羥基經(jīng)甲基化反應(yīng)產(chǎn)生植物抗毒素的研究較多[4]，如甲基化生成的豆科類植物抗毒素紫苜蓿素[5]、櫻花素[6]、芒柄花黃素[7]等。

甲基轉(zhuǎn)移酶(Methyltransferase)調(diào)控甲基化反應(yīng)，根據(jù)作用對(duì)象可分為遺傳物質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶和非遺傳物質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶[8]。催化非遺傳物質(zhì)的甲基轉(zhuǎn)移酶種類繁多，功能復(fù)雜。氧甲基轉(zhuǎn)移酶(OMT,O-methyltransferase)就是作用底物位點(diǎn)為氧的甲基轉(zhuǎn)移酶,也是其中研究最為廣泛的一類[9]。類黃酮氧甲基轉(zhuǎn)移酶(FOMT,flavonoid O-methyltransferase)是氧甲基轉(zhuǎn)移酶家族中的亞家族，通過(guò)催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM,S-adenosyl-L-methionine)上的一個(gè)CH3轉(zhuǎn)移到類黃酮上，產(chǎn)生S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH,S-Adenosyl-L-homocysteine)和甲氧基類黃酮[10]。甲氧基類黃酮具有更強(qiáng)的脂親和性，更利于在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散，提高植物的抗菌性，從而增加植物抗脅迫能力[11-12]，并賦予類黃酮更多的生理活性。

近年來(lái)，有關(guān)植物中類黃酮甲基轉(zhuǎn)移酶的研究逐漸成為熱點(diǎn)。研究表明，在禾本科植物中，禾白粉病菌誘導(dǎo)大麥產(chǎn)生類黃酮7-O-甲基轉(zhuǎn)移酶F1-OMT[13]，催化芹菜素7位羥基甲基化生成芫花素；小麥TaOMT2能催化黃酮和五羥黃酮甲基化產(chǎn)生單甲基、雙甲基、三甲基黃酮[14]；但對(duì)青稞類黃酮氧甲基轉(zhuǎn)移酶的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究所用材料為青稞品系“94-19-1”，由甘肅省甘南藏族自治州農(nóng)科所經(jīng)系譜法選育而成，具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、耐寒、耐旱、抗倒伏等特性，是前期測(cè)定的高黃酮含量品系[15]。本研究擬通過(guò)RT-PCR(Reverse transcription PCR)擴(kuò)增得到cDNA，克隆得到 F7-OMT基因的編碼區(qū)，并實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌中的表達(dá)及表達(dá)蛋白的純化，目的是為研究該酶蛋白的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及功能等奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究該基因在青稞中的表達(dá)提供依據(jù)，也為青稞高功能成分育種提供重要基因資源。

1材料與方法

1.1材 料

供試青稞材料為“94-19-1”，由甘肅省甘南藏族自治州農(nóng)科所贈(zèng)送。LA DNA聚合酶、pMD19-T simple Vector、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、IPTG均購(gòu)自TaKaRa公司(大連)。pET-32a載體于本實(shí)驗(yàn)室保存。E.coliDH5α菌株、E.coliBL21(DE3)pLysS菌株、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)于天根生化科技有限公司(TIANGEN)。Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2方 法

1.2.1總RNA的提取和cDNA第一鏈合成

培養(yǎng)青稞材料“94-19-1”至3葉1心期，采用改良的Trizol法提取其總RNA，并進(jìn)行RT-PCR得到cDNA，具體操作參照TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明。

1.2.2青稞 F7-OMT基因的擴(kuò)增

參照大麥F1-OMT(No.X77467)序列，設(shè)計(jì)特異性引物為F7-OMTF1：5′-ATGCAGGACACCAGTAGTACC-3′；F7-OMTR1：5′-CACGGCCTTTGCACCAAATC-3′。以青稞葉片總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，反應(yīng)體系(總體積25 μL)為模板cDNA 1.5 μL(25～40 ng·μL-1)，引物各 1 μL(10 ng·μL-1)，LA DNA聚合酶 0.25 μL，2×GC buffer 12.5 μL，ddH2O 8.75 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，變性到延伸共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，擴(kuò)增獲得包含 F7-OMT基因全長(zhǎng)ORF在內(nèi)的序列。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)到PCR產(chǎn)物并切膠回收?；厥站唧w步驟參照TIANgel Midi Purification Kit 普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明。

1.2.3青稞 F7-OMT基因的克隆及陽(yáng)性篩選

將已獲得的回收產(chǎn)物與pMD19-T simple Vector 16 ℃連接過(guò)夜。10 μL反應(yīng)體系為回收產(chǎn)物 4.5 μL，pMD19-T 0.5 μL，solutionⅠ 5 μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α菌株，以F7-OMTF1、F7-OMTR1為引物，參考該基因擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR，挑選5個(gè)獨(dú)立的陽(yáng)性克隆，送至北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.4重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)已獲得的目的基因序列設(shè)計(jì)包含ORF全序列的特異性引物(斜體前幾個(gè)字母為保護(hù)堿基，斜體表示酶切位點(diǎn))：F7-OMTF(5′-CGCGGATCCATGCAGGACACCAGTAGTAC-3′)；F7-OMTR：(5′-CCGCTCGAGCTATGGCTGGA CTTCAATGA-3′)。擴(kuò)大培養(yǎng)篩選出的陽(yáng)性克隆單菌落中的菌體，使用TIANprep Mini Plasmid Kit 質(zhì)粒小提試劑盒提取其質(zhì)粒。PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物電泳檢測(cè)，切膠回收目的片段，同時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)帶有pET-32a載體的菌株，提取質(zhì)粒。

將回收片段和pET-32a空載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切。雙酶切體系(20 μL)為ddH2O 6 μL，10×K buffer 2 μL，質(zhì)?；騊CR回收產(chǎn)物 10 μL，BamHⅠ和XhoⅠ各1 μL。將完全雙酶切切開的PCR回收產(chǎn)物和pET-32a載體按照如下比例于16 ℃連接過(guò)夜。連接體系(10 μL)為：酶切后純化目的片段 6.5 μL，酶切后純化pET-32a 2 μL，T4連接酶 0.5 μL，1×K Buffer 1 μL。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α菌株中，以F7-OMTF、F7-OMTR為引物，參考該基因克隆程序進(jìn)行PCR檢測(cè)，同時(shí)雙酶切檢測(cè)篩選陽(yáng)性克隆，挑選3個(gè)獨(dú)立的陽(yáng)性克隆送至生工生物工程有限公司(Sangon Biotech)測(cè)序。篩選得到測(cè)序無(wú)突變的陽(yáng)性克隆，命名為pET-32a-F7-OMT，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)pLysS菌株。

1.2.5菌株誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE鑒定

取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液接種于100 mL含抗生素Amp的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min-1振蕩3～5 h，期間測(cè)定OD600值至0.6～0.8之間。分裝為每管3 mL，以一管不加IPTG作為對(duì)照，其他分別加IPTG至終濃度為0.4、0.5、0.6、0.8 mmol·L-1，每個(gè)濃度分別設(shè)置時(shí)間梯度1～5 h進(jìn)行誘導(dǎo)，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定蛋白，選取最優(yōu)誘導(dǎo)條件。

1.2.6親和層析純化蛋白

活化帶有重組質(zhì)粒的菌株，并擴(kuò)大培養(yǎng)30 mL?？刂芆D600至0.6～0.8之間，取3 mL作為對(duì)照，其余菌液采用最優(yōu)誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)目的蛋白，并參照Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行純化。

2結(jié)果與分析

2.1青稞 F7-OMT基因克隆結(jié)果

提取青稞材料“94-19-1”的3葉1心期總RNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。以總RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，F(xiàn)7-OMTF1/F7-OMTR1為引物，PCR擴(kuò)增后經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果得到與預(yù)期片段(1 284 bp)相符的單一、清晰的條帶(圖1)。將獲得的目的條帶切膠回收，連接至pMD19-T simple Vector，轉(zhuǎn)入E.coliDH5α獲得大量陽(yáng)性克隆后測(cè)序，將測(cè)得的序列經(jīng)Blastn序列比對(duì)，結(jié)果青稞 F7-OMT基因編碼區(qū)與大麥類黃酮F1-OMT(X77467.1)ORF相似度為99.66%，4個(gè)堿基發(fā)生改變，同時(shí)導(dǎo)致3個(gè)氨基酸變化，表明獲得了青稞 F7-OMT基因序列(圖2)。

A： F7-OMT基因擴(kuò)增片段；M：D2000 DNA marker

A: Amplification of F7-OMT gene fragment；M: D2000 DNA marker

圖1青稞 F7-OMT基因的PCR產(chǎn)物

Fig.1 PCR products of F7-OMT gene in hulless barley

2.2青稞 F7-OMT基因的生物信息學(xué)分析

通過(guò)DNAMAN對(duì)青稞 F7-OMT基因進(jìn)行分析，得到的cDNA全長(zhǎng)為1 284 bp，其中ORF全長(zhǎng)1 173 bp。通過(guò)NCBI CCD預(yù)測(cè)結(jié)果為具有甲基轉(zhuǎn)移酶2家族(Methyltransf_2,pfam00891)保守域于118～367位氨基酸內(nèi)和二聚化(Dimerization,pfam08100)保守域于53～101位氨基酸內(nèi)。經(jīng)ScanProsite初步預(yù)測(cè)到其His296(His/H,histidine)為接受質(zhì)子的活性位點(diǎn)，而其Asp258(Asp/D,aspartic acid)為SAM結(jié)合位點(diǎn)。該基因預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量為42 207.8 Da，等電點(diǎn)pI為5.36，為酸性蛋白。使用ProtParam分析其氨基酸，得到該蛋白負(fù)電荷的氨基酸(Asp+Glu)有41個(gè)，正電荷氨基酸(Arg+Lys)有27個(gè)，含亮氨酸(Leu)最多，為42個(gè)，占10.8%；色氨酸(Trp)最少，只有3個(gè)，占0.8%。半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為40.69，屬于不穩(wěn)定蛋白。平均親水性系數(shù)(GRAVY)為0.127。經(jīng)SignalP 4.0 Server 預(yù)測(cè)無(wú)信號(hào)肽序列。使用PredictProtein預(yù)測(cè)到該酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中含α-螺旋(47.18%)、β-折疊(10%)、無(wú)規(guī)則卷曲(42.82%)。

2.3青稞F7-OMT氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

通過(guò)NCBI-blastp將青稞F7-OMT與其他物種O-甲基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明青稞F7-OMT與大麥F1-OMT[13](CAA54616.1)相似度最高，為99%，與山羊草O-methyltransferase ZRP4[16](EMT02597.1)和烏拉爾圖小麥5-pentadecatrienyl resorcinol O-methyltransferase[17](EMS46654.1)相似度分別為77%和73%，而與其他物種的相似性不到60%。并且與大麥O-methyltransferase(AB086416.1)和大麥Caffeic acid O-methyltransferase[18](Q96565)的氨基酸序列相似度僅為21.99%和25.06%。通過(guò)DNAMAN將青稞及其近源物種OMT進(jìn)行多序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其OMTs家族蛋白序列保守性較低，青稞F7-OMT氨基酸序列中His296對(duì)應(yīng)的組氨酸高度保守(圖3)。

采用MEGA 6.06對(duì)該酶與其他植物FOMT和其他種類OMTs等28種同一家族的甲基化酶類構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，結(jié)果顯示，OMTs系統(tǒng)發(fā)育樹分為兩大類，第一類又分為兩個(gè)亞類，其中青稞F7-OMT與大麥、山羊草、小麥、小米、水稻、玉米等單子葉植物的OMTs歸為第二亞類，與第一亞類中的苜蓿、甘草、大豆、長(zhǎng)春花、杏、李等雙子葉OMTs在進(jìn)化上有明顯區(qū)分。從第一亞類可看出異黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶(IOMT)在進(jìn)化上相較于FOMT保守性更強(qiáng)。從整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹來(lái)看，同一物種OMT家族中酶的相似性不一定更高，物種親緣關(guān)系更近的功能相似的OMTs同源性越強(qiáng)，且7-OMTs并不是非常保守。

方框中D表示Asp258，為SAM結(jié)合位點(diǎn)；方框中H表示His296，為接受質(zhì)子的活性位點(diǎn)；*表示終止密碼子

D in the box is Asp258for binding site of SAM；H in the box is His296for active site of accepting protons;* is terminator codon

圖2青稞 F7-OMT基因的ORF序列及其預(yù)測(cè)氨基酸序列

Fig.2Total ORF sequence and putative amino acid sequence of F7-OMT gene in hulless barley

三角形指示組氨酸活性位點(diǎn)　Triangle is active site of histidine

2.4原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

用引物F7-OMTF/F7-OMTR擴(kuò)增產(chǎn)物與pET-32a空載體經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α。涂平板挑菌后擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒再經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切檢測(cè)鑒定為陽(yáng)性克隆(圖5)。將陽(yáng)性克隆菌株送測(cè)序(Sangon Biotech)，經(jīng)DNAMAN比對(duì)測(cè)得序列和前期獲得的序列，結(jié)果表明該基因ORF無(wú)突變，獲得該基因的重組表達(dá)載體。

2.5青稞F7-OMT的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析

從DH5α中提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)pLysS中，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)4 h后菌液OD600值0.6左右。分別取IPTG終濃度0.4、0.5、0.6、0.8 mmol·L-1，每管3 mL，誘導(dǎo)4 h。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，隨濃度增加條帶變化不明顯，但在60 kDa左右處有較粗條帶。取擴(kuò)大培養(yǎng)的OD600菌液3 mL作空白對(duì)照，搖菌5 h，其余的加入IPTG控制其終濃度為0.8 mmol·L-1，分裝為5管，每管3 mL，分別搖1～5 h。同時(shí)將pET-32a空載體轉(zhuǎn)入BL21(DE3)pLysS，同樣擴(kuò)大培養(yǎng)至菌液OD600為0.6左右，分裝為5管，每管3 mL，搖菌1～5 h。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，含有重組質(zhì)粒未加IPTG培養(yǎng)5 h的菌和含空載體培養(yǎng)1～5 h的菌中60 kDa中沒(méi)有明顯變化；加入IPTG含重組質(zhì)粒培養(yǎng)1～5 h的菌在60 kDa左右可以明顯看到隨培養(yǎng)時(shí)間增加而變粗的條帶，培養(yǎng)5 h的條帶最粗，該菌其他條帶與其他菌沒(méi)有明顯差別(圖6)。結(jié)果表明成功誘導(dǎo)表達(dá)出青稞F7-OMT蛋白。

箭頭表示青稞F7-OMT蛋白　Arrow is F7-OMT protein in hulless barley

A：目的基因與pET-32a；M：500 bp DNA ladder

A: Target gene fragment and pET-32a； M: 500 bp DNA ladder

圖5雙酶切鑒定目的基因與pET-32a

Fig.5Target gene products and pET-32a

identified with double enzyme digestion

2.6青稞F7-OMT蛋白的親和層析純化

擴(kuò)大培養(yǎng)并按最優(yōu)條件(IPTG濃度0.8 mmol·L-1，5 h)誘導(dǎo)表達(dá)含重組表達(dá)質(zhì)粒的BL21(DE3)pLysS，經(jīng)親和層析純化后得到與目的條帶位置相符的單一條帶(圖7)，說(shuō)明成功純化得到目的蛋白即青稞F7-OMT蛋白。

3討 論

植物OMTs家族因底物多樣性形成龐大甲基轉(zhuǎn)移酶家族，類黃酮OMTs通過(guò)奪取類黃酮羥基中的質(zhì)子轉(zhuǎn)移甲基而改變底物結(jié)構(gòu)，并改變底物的理化性質(zhì)和功能。類黃酮有抗氧化、類雌激素、參與植物生長(zhǎng)和花色形成、參與植物抗脅迫等作用[19-21]。目前關(guān)于植物OMTs cDNA的克隆及其結(jié)構(gòu)、功能的研究較多，如豆科類[22-24]、番茄[25]、煙草[26]、擬南芥[11,27]、水稻[6,28-29]、小麥[14]、月季[30]、葡萄[31]等。尤其關(guān)于轉(zhuǎn)移甲基產(chǎn)生大量植物抗毒素，增加植物抵抗病菌感染方面研究較多。目前豆科植物由于其黃酮含量較高，對(duì)其OMTs研究較為深入。對(duì)禾本科OMTs也已有一定研究，但在青稞材料中尚未有研究。

本研究經(jīng)青稞F7-OMT氨基酸序列同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在底物結(jié)合區(qū)域所預(yù)測(cè)出的His高度保守。其主要原因可能是其咪唑基團(tuán)中的兩個(gè)N原子易發(fā)生質(zhì)子化反應(yīng)，而奪取其他基團(tuán)中的質(zhì)子，SAM上的甲基轉(zhuǎn)移到去質(zhì)子化的底物羥基上，形成其甲基化產(chǎn)物[32]。而SAM與OMTs結(jié)

M：廣譜蛋白Marker(CWBIO)；A1～A5：空載體加IPTG誘導(dǎo)1～5 h；B1～B5：重組質(zhì)粒加IPTG誘導(dǎo)1～5 h；C：重組質(zhì)粒未加IPTG誘導(dǎo)5 h；D1～D4：重組質(zhì)粒IPTG終濃度分別為0.4、0.5、0.6、0.8 mmol·L-1

M: Protein marker(CWBIO)；A1-A5：Original vector induced by IPTG for 1-5 h；B1-B5：Recombinant vector induced by IPTG for 1-5 h；C：Recombinant vector induced without IPTG for 5 h；D1-D4：Recombinant vector induced by IPTG at the final concentration of 0.4，0.5，0.6，0.8 mmol·L-1

圖6目的蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

Fig.6Expression of target protein inE.coliinduced by IPTG

M：廣譜蛋白Marker(CWBIO)；A：純化的目的蛋白；B：加IPTG誘導(dǎo)5 h的重組質(zhì)粒

M: Protein marker(CWBIO)；A：Purified target protein；B：Recombinant vector induced by IPTG for 5 h

圖7目的蛋白的親和層析純化

Fig.7Affinity chromatography purification of target protein

合位點(diǎn)較多，預(yù)測(cè)分析尚不準(zhǔn)確。通過(guò)對(duì)含有甲基轉(zhuǎn)移酶2和二聚化保守域的OMTs做系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示出其種類多樣性，其主要原因可能是同個(gè)物種中黃酮種類多樣性使得與其結(jié)合的酶結(jié)構(gòu)多樣性。7-OMTs并沒(méi)有高度保守，說(shuō)明類黃酮與氧甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合還有其他黃酮結(jié)構(gòu)區(qū)域參與，可能正是這些不同導(dǎo)致7-OMTs千差萬(wàn)別[33-34]。在依賴SAM的OMTs中，因其需要與結(jié)構(gòu)已經(jīng)固定的SAM結(jié)合，所以其SAM結(jié)合域保守性較強(qiáng)[35]。青稞F7-OMT與禾本科植物同源性更高說(shuō)明OMT符合系統(tǒng)進(jìn)化規(guī)律，7-OMTs保守性不高以及豆科類異黃酮OMT同樣具有很高保守性，這與Kim等[32]的分析結(jié)果一致。

僅通過(guò)同源性分析來(lái)研究植物OMTs功能尚不準(zhǔn)確[36]，要對(duì)青稞F7-OMT功能做進(jìn)一步研究還需原核表達(dá)得到其純化蛋白。本研究中構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a-F7-OMT后，調(diào)整誘導(dǎo)表達(dá)IPTG終濃度對(duì)重組目的蛋白表達(dá)影響不明顯，說(shuō)明該基因原核表達(dá)體系對(duì)IPTG濃度不敏感，這與重組質(zhì)粒pET32a-AKT1結(jié)果一致[37]。在誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)將IPTG控制其終濃度為0.8 mmol·L-1、誘導(dǎo)時(shí)間為5 h時(shí)得到的目的蛋白含量最高，而空載體采用同樣處理不能得到相同條帶，說(shuō)明該蛋白能在原核表達(dá)載體pET-32a中較好地表達(dá)。該結(jié)果為研究該蛋白的底物特異性及其功能提供了一定的基礎(chǔ)。

目前OMTs的克隆研究只是集中在cDNA方面，關(guān)于其他基因元件對(duì)該基因的影響鮮有研究，如其啟動(dòng)子和內(nèi)含子序列的相關(guān)報(bào)道較少；其次對(duì)于該基因多態(tài)性研究也較少；另外OMTs在植物抗病毒中與其他拮抗反應(yīng)相關(guān)性，以及在植物抵御病菌反應(yīng)中地位的報(bào)道也較少。隨著基因工程和分子生物學(xué)發(fā)展，后期將高黃酮含量與OMTs相結(jié)合，有望培育出抗病性強(qiáng)、高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因植株。

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Cloning and Prokaryotic Expression Analysis of F7-OMT Gene from Hulless Barley

MOU Li,ZHANG Kunfei,LI Peng,FANG Jian,LIU Xinchun,FENG Zongyun

(College of Agronomy,Sichuan Agricultural University,Chengdu，Sichuan 611130,China)

Abstract:Flavonoid 7-O-methyltransferase(F7-OMT) can produce phytoalexin with the ability of methylating flavonoids for its methyltransferase function so that it can improve the antibacterial property in plant.In order to lay further research foundation for the protein,the objective gene sequence of F7-OMT was cloned from the hulless barley material “94-19-1” by using the homology-based cloning technique in this research,bioinformatics analysis showed the full length of open reading frame (ORF) with 1173 bp in F7-OMT that encoded 390 amino acid residues. The calculated molecular mass of the putative protein without signal peptide was 42207.8 Da and the isoelectric point was predicted as 5.36. And the gene had Methyltransf_2 and Dimerization domains that were highly conserved. pET-32a- F7-OMT fusion expression vector,which could be induced to express in E.coli BL21(DE3)pLysS was constructed. The purified protein was obtained through affinity chromatography purification method.

Key words:Hulless barley;Flavonoid 7-O-methyltransferase;Cloning;Bioinformatics analysis;Prokaryotic expression

中圖分類號(hào)：S512.3；S330

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-1041(2016)01-0018-08

通訊作者：馮宗云(E-mail：zyfeng49@126.com)

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(大麥青稞體系)建設(shè)專項(xiàng)(CARS-05)

收稿日期：2015-08-18修回日期：2015-10-07

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160108.1820.006.html

第一作者E-mail：pasheaty@hotmail.com